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        胚胎脊髓移植結(jié)合神經(jīng)生長因子對損傷脊髓老年大鼠的修復(fù)作用

        2016-12-06 03:35:01解錦鼎曹文慧楊曉帆李小蘋
        中國老年學(xué)雜志 2016年21期
        關(guān)鍵詞:移植手術(shù)牡丹江生長因子

        解錦鼎 安 寧 曹文慧 楊曉帆 李小蘋

        (牡丹江林業(yè)中心醫(yī)院骨科,黑龍江 牡丹江 157000)

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        胚胎脊髓移植結(jié)合神經(jīng)生長因子對損傷脊髓老年大鼠的修復(fù)作用

        解錦鼎 安 寧1曹文慧1楊曉帆1李小蘋1

        (牡丹江林業(yè)中心醫(yī)院骨科,黑龍江 牡丹江 157000)

        目的 分析胚胎脊髓移植(FSC)結(jié)合神經(jīng)生長因子修復(fù)損傷脊髓的老年大鼠模型。方法 將28只體重250~300 g的健康Wistar大鼠用于制作脊髓損傷模型,其中和雙下肢癱瘓標(biāo)準(zhǔn)相符的24只分為單純脊髓損傷組(A組)、脊髓損傷結(jié)合外源性神經(jīng)生長因子組(B組)、脊髓損傷結(jié)合FSC組(C組)、脊髓損傷結(jié)合FSC兼用神經(jīng)生長因子組(D組)4組,每組6只。將10 μl移植物注入B、C、D組體內(nèi)。結(jié)果 B、C、D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的聯(lián)合行為評分(CBS)、神經(jīng)元面積均顯著低于或高于A組(P<0.05),D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS、神經(jīng)元面積顯著低于或高于B、C組(P<0.05)。結(jié)論 FSC結(jié)合神經(jīng)生長因子能夠有效修復(fù)老年大鼠的損傷脊髓功能。

        胚胎脊髓移植;神經(jīng)生長因子;損傷脊髓

        脊髓損傷引發(fā)的神經(jīng)元萎縮是否能夠在胚胎脊髓移植(FSC)結(jié)合神經(jīng)生長因子的作用下得到挽救、大鼠脊髓損傷后的功能是否能夠在其作用下得到恢復(fù)及二者的協(xié)同作用尚不清楚,本實驗分析FSC結(jié)合神經(jīng)生長因子修復(fù)損傷脊髓老年大鼠的作用。

        1 材料與方法

        1.1 材料 主要儀器:自制改良Allen打擊器、病理切片機(jī)OPTICKI型(Japan)、光學(xué)顯微鏡CX40RF200型(Olympus Optical Co.LTD Japan)、離心機(jī)LXZ-64-01型(北京醫(yī)療儀器廠)、計算機(jī)圖像分析儀MIAS-2000型(四川大學(xué)圖像研究所)。主要試劑:自制胚胎脊髓懸液、Nissl染色試劑(甲苯藍(lán)試劑,北京化工制品有限公司)、神經(jīng)生長因子(北京圣日醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。Wistar孕鼠(第1天:陰栓出現(xiàn)2 w后剖腹將胚胎脊髓取出)、Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。

        1.2 模型制作及分組 28只體重250~300 g的健康Wistar大鼠給予腹腔注射750 mg/kg 20%烏拉坦進(jìn)行麻醉,幫助其取俯臥位,在手術(shù)板上固定,用碘伏常規(guī)備皮消毒。將無菌巾鋪上,在以T7棘突為中心的背正中縱行開一長4 cm的切口,切開皮下組織對兩側(cè)椎旁肌進(jìn)行剝離。將T7棘突及椎板切除,將硬膜暴露,將有直徑為2 cm打擊頭的改良Allen打擊器放置其中,對重量為10 g的打擊重錘進(jìn)行調(diào)節(jié),高度為5 cm。使重錘自然下落,將打擊重量保持在50 g/cm2。以較快的速度將打擊頭及重錘移開,對創(chuàng)面進(jìn)行清理,將切口逐層縫合起來。單籠飼養(yǎng)動物,定時為其擠尿,每8 h 1次,喂養(yǎng)3 d,期間4只死亡。余下的24只與雙下肢癱瘓標(biāo)準(zhǔn)相符,分為單純脊髓損傷組(A組)、脊髓損傷結(jié)合外源性神經(jīng)生長因子組(B組)、脊髓損傷結(jié)合FSC組(C組)、脊髓損傷結(jié)合FSC兼用神經(jīng)生長因子組(D組)4組,每組6只。

        1.3 移植方法 將制作脊髓損傷動物模型取出來,將損傷脊髓處硬膜暴露,途徑為手術(shù)入路;將皮試注射器向損傷中心垂直刺入,抽取少量滲液,抽取過程中以較慢的速度;將移植物取出,在此過程中用皮試注射器,分別刺入頭尾1.5 cm,位置為損傷中心,刺入角度為45°斜角,3 min內(nèi)勻速將10 μl移植物注入B、C、D組體內(nèi);對滲出情況進(jìn)行嚴(yán)密觀察,然后逐層縫合,單籠飼養(yǎng),定時為其擠尿,每8 h 1次,完成標(biāo)準(zhǔn)為其能夠自行排尿。

        1.4 聯(lián)合行為評分(CBS) 制模術(shù)后6 h、移植術(shù)后2、4、6、8 w分別對脊髓損傷后運(yùn)動、反射等后肢功能進(jìn)行綜合評定,評定過程中運(yùn)用Cale綜合評分方法,分值在0~100分,大鼠的神經(jīng)功能和分值呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,即0分為具有完全正常的神經(jīng)功能,100分為完全喪失神經(jīng)功能〔1〕。

        1.5 形態(tài)學(xué)檢查 ①標(biāo)本取材。將大鼠處死,將其脊髓標(biāo)本切取,計所有時相點,每組3只。給予大鼠750 mg/kg 20%烏拉坦麻醉,幫助大鼠取仰臥位,在手術(shù)板上固定,開胸將其心臟暴露,進(jìn)行主動脈插管,切開右心房,將生理鹽水灌注其中,改用10%甲醛溶液灌注的標(biāo)準(zhǔn)為有無色液體從右心房切口溢出,停止灌注的標(biāo)準(zhǔn)為刺激性氣體從右心房切口溢出2 min后,2 h后從原手術(shù)入路將T7暴露出來,計T4~T10椎體,分別切片并進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)、嗜銀染色,位置為所有標(biāo)本頭尾兩側(cè)及損傷中心;②光鏡觀察。HE染色切片、甲苯胺藍(lán)染色切片、嗜銀染色切片分別對神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量及大小、神經(jīng)元細(xì)胞軸突發(fā)芽及尼氏小體、神經(jīng)纖維變化情況進(jìn)行觀察,然后對神經(jīng)元面積變化進(jìn)行檢測和定量分析,檢測過程中用計算機(jī)圖像分析儀〔2~5〕。

        1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗及單因素方差分析。

        2 結(jié) 果

        2.1 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS變化 B、C、D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS均顯著低于A組(P<0.05),D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS又均顯著低于B、C組(P<0.05),但B、C組差異均不顯著(P>0.05),見表1。

        表1 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 wCBS變化(分,

        與A組比較:1)P<0.05;與D組比較:2)P<0.05;下表同

        2.2 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積變化 B、C、D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積均顯著高于A組(P<0.05),D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積又均顯著高于B、C組(P<0.05),但B組、C組差異均不顯著(P>0.05),見表2。

        表2 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積變化

        3 討 論

        由于哺乳動物中樞神經(jīng)損傷后再生極為困難,因此平面以下下肢癱瘓在脊髓損傷的作用下發(fā)生一直是臨床研究的難點和重點〔6〕。醫(yī)學(xué)實驗表明〔7~10〕,脊髓損傷后由于缺乏對促進(jìn)神經(jīng)再生進(jìn)行誘導(dǎo)的微環(huán)境等,因此無法再生,這和周圍神經(jīng)不同。醫(yī)學(xué)實驗顯示〔11,12〕,宿主脊髓中胚胎脊髓移植能夠存活、生長等并促進(jìn)部位纖維連接的形成,為恢復(fù)神經(jīng)功能提供良好的前提條件。對其應(yīng)用外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠?qū)顾枭窠?jīng)元萎縮進(jìn)行有效防止,促進(jìn)紅核脊髓通路的再生。在神經(jīng)營養(yǎng)因子中,最具感覺及運(yùn)動神經(jīng)元活性的是神經(jīng)生長因子。FSC及外源性神經(jīng)生長因子均能夠有效改善脊髓損傷局部微環(huán)境,將良好的前提條件提供給損傷脊髓的神經(jīng)纖維再生。本研究結(jié)果充分說明FSC結(jié)合神經(jīng)生長因子能夠有效修復(fù)老年大鼠的損傷脊髓功能。

        1 劉 佳.脊髓脫細(xì)胞支架復(fù)合人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠脊髓長節(jié)段缺損軸突長入再生及功能恢復(fù)〔D〕.廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2013.

        2 劉 炎.人臍帶Wharton膠間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)雪旺細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的實驗研究〔D〕.長春:吉林大學(xué),2013.

        3 王 勇,趙 偉,馮健洲,等.神經(jīng)生長因子修飾脂肪干細(xì)胞移植促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù)〔J〕.中國組織工程研究,2015;10(14):2224-9.

        4 孫兆忠,李 瑞,房清敏,等.臍血干細(xì)胞移植及電針治療脊髓損傷大鼠神經(jīng)生長因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子3的表達(dá)〔J〕.中國組織工程研究,2015;19(1):61-6.

        5 柴 勇,楊 成,張 敏.神經(jīng)干細(xì)胞移植治療對損傷脊髓大鼠神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志,2013;29(12):1910-2.

        6 劉知泉.溫腎助陽益精填髓結(jié)合神經(jīng)生長因子治療脊髓損傷的臨床療效觀察〔J〕.實用中西醫(yī)結(jié)合臨床,2014;20(11):36-7.

        7 劉 坤,劉維婕,李 薇.聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)生長因子和神經(jīng)節(jié)苷脂對坐骨神經(jīng)損傷大鼠脊髓神經(jīng)元的保護(hù)作用探討〔J〕.中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè),2014;6(7):9-10.

        8 佘志峰,陳煒煒,蔣功達(dá).神經(jīng)生長因子結(jié)合高壓氧治療脊髓損傷療效分析〔J〕.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué),2013;5(1):63-4.

        9 楊 波,隋汝波.電針對大鼠脊髓損傷細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2015;35(12):3263-5.

        10 田小磊,王 坤,靳安民.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在大鼠急性脊髓損傷中的表達(dá)及其意義〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2014;34(20):5796-8.

        11 Bramlett HM,Dietrich WD,Marcillo A,etal.Effects of low intensity vibration on bone and muscle in rats with spinal cord injury〔J〕.Osteoporosis Int,2014;25(9):2209-19.

        12 Menon N,Gupta A,Khanna M,etal.Ambulation following spinal cord injury and its correlates〔J〕.Ann Indian Acad Neurol,2015;18(2):167-70.

        〔2015-02-11修回〕

        (編輯 苑云杰)

        牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(No.ZS201523;ZS201526)

        安 寧(1983-),女,碩士,主治醫(yī)師,主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。

        解錦鼎(1982-),男,碩士,主治醫(yī)師,主要從事脊髓損傷研究。

        R53.3

        A

        1005-9202(2016)21-5269-03;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.024

        1 牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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