解錦鼎 安 寧 曹文慧 楊曉帆 李小蘋

(牡丹江林業(yè)中心醫(yī)院骨科，黑龍江 牡丹江 157000)

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胚胎脊髓移植結(jié)合神經(jīng)生長因子對損傷脊髓老年大鼠的修復(fù)作用

解錦鼎 安 寧1曹文慧1楊曉帆1李小蘋1

(牡丹江林業(yè)中心醫(yī)院骨科，黑龍江 牡丹江 157000)

目的 分析胚胎脊髓移植(FSC)結(jié)合神經(jīng)生長因子修復(fù)損傷脊髓的老年大鼠模型。方法 將28只體重250～300 g的健康Wistar大鼠用于制作脊髓損傷模型，其中和雙下肢癱瘓標(biāo)準(zhǔn)相符的24只分為單純脊髓損傷組(A組)、脊髓損傷結(jié)合外源性神經(jīng)生長因子組(B組)、脊髓損傷結(jié)合FSC組(C組)、脊髓損傷結(jié)合FSC兼用神經(jīng)生長因子組(D組)4組，每組6只。將10 μl移植物注入B、C、D組體內(nèi)。結(jié)果 B、C、D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的聯(lián)合行為評分(CBS)、神經(jīng)元面積均顯著低于或高于A組(P<0.05)，D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS、神經(jīng)元面積顯著低于或高于B、C組(P<0.05)。結(jié)論 FSC結(jié)合神經(jīng)生長因子能夠有效修復(fù)老年大鼠的損傷脊髓功能。

胚胎脊髓移植；神經(jīng)生長因子；損傷脊髓

脊髓損傷引發(fā)的神經(jīng)元萎縮是否能夠在胚胎脊髓移植(FSC)結(jié)合神經(jīng)生長因子的作用下得到挽救、大鼠脊髓損傷后的功能是否能夠在其作用下得到恢復(fù)及二者的協(xié)同作用尚不清楚，本實驗分析FSC結(jié)合神經(jīng)生長因子修復(fù)損傷脊髓老年大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 主要儀器：自制改良Allen打擊器、病理切片機(jī)OPTICKI型(Japan)、光學(xué)顯微鏡CX40RF200型(Olympus Optical Co.LTD Japan)、離心機(jī)LXZ-64-01型(北京醫(yī)療儀器廠)、計算機(jī)圖像分析儀MIAS-2000型(四川大學(xué)圖像研究所)。主要試劑：自制胚胎脊髓懸液、Nissl染色試劑(甲苯藍(lán)試劑，北京化工制品有限公司)、神經(jīng)生長因子(北京圣日醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)。Wistar孕鼠(第1天：陰栓出現(xiàn)2 w后剖腹將胚胎脊髓取出)、Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。

1.2 模型制作及分組 28只體重250～300 g的健康Wistar大鼠給予腹腔注射750 mg/kg 20%烏拉坦進(jìn)行麻醉，幫助其取俯臥位，在手術(shù)板上固定，用碘伏常規(guī)備皮消毒。將無菌巾鋪上，在以T7棘突為中心的背正中縱行開一長4 cm的切口，切開皮下組織對兩側(cè)椎旁肌進(jìn)行剝離。將T7棘突及椎板切除，將硬膜暴露，將有直徑為2 cm打擊頭的改良Allen打擊器放置其中，對重量為10 g的打擊重錘進(jìn)行調(diào)節(jié)，高度為5 cm。使重錘自然下落，將打擊重量保持在50 g/cm2。以較快的速度將打擊頭及重錘移開，對創(chuàng)面進(jìn)行清理，將切口逐層縫合起來。單籠飼養(yǎng)動物，定時為其擠尿，每8 h 1次，喂養(yǎng)3 d，期間4只死亡。余下的24只與雙下肢癱瘓標(biāo)準(zhǔn)相符，分為單純脊髓損傷組(A組)、脊髓損傷結(jié)合外源性神經(jīng)生長因子組(B組)、脊髓損傷結(jié)合FSC組(C組)、脊髓損傷結(jié)合FSC兼用神經(jīng)生長因子組(D組)4組，每組6只。

1.3 移植方法 將制作脊髓損傷動物模型取出來，將損傷脊髓處硬膜暴露，途徑為手術(shù)入路；將皮試注射器向損傷中心垂直刺入，抽取少量滲液，抽取過程中以較慢的速度；將移植物取出，在此過程中用皮試注射器，分別刺入頭尾1.5 cm，位置為損傷中心，刺入角度為45°斜角，3 min內(nèi)勻速將10 μl移植物注入B、C、D組體內(nèi)；對滲出情況進(jìn)行嚴(yán)密觀察，然后逐層縫合，單籠飼養(yǎng)，定時為其擠尿，每8 h 1次，完成標(biāo)準(zhǔn)為其能夠自行排尿。

1.4 聯(lián)合行為評分(CBS) 制模術(shù)后6 h、移植術(shù)后2、4、6、8 w分別對脊髓損傷后運(yùn)動、反射等后肢功能進(jìn)行綜合評定，評定過程中運(yùn)用Cale綜合評分方法，分值在0～100分，大鼠的神經(jīng)功能和分值呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即0分為具有完全正常的神經(jīng)功能，100分為完全喪失神經(jīng)功能〔1〕。

1.5 形態(tài)學(xué)檢查 ①標(biāo)本取材。將大鼠處死，將其脊髓標(biāo)本切取，計所有時相點，每組3只。給予大鼠750 mg/kg 20%烏拉坦麻醉，幫助大鼠取仰臥位，在手術(shù)板上固定，開胸將其心臟暴露，進(jìn)行主動脈插管，切開右心房，將生理鹽水灌注其中，改用10%甲醛溶液灌注的標(biāo)準(zhǔn)為有無色液體從右心房切口溢出，停止灌注的標(biāo)準(zhǔn)為刺激性氣體從右心房切口溢出2 min后，2 h后從原手術(shù)入路將T7暴露出來，計T4～T10椎體，分別切片并進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)、嗜銀染色，位置為所有標(biāo)本頭尾兩側(cè)及損傷中心；②光鏡觀察。HE染色切片、甲苯胺藍(lán)染色切片、嗜銀染色切片分別對神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量及大小、神經(jīng)元細(xì)胞軸突發(fā)芽及尼氏小體、神經(jīng)纖維變化情況進(jìn)行觀察，然后對神經(jīng)元面積變化進(jìn)行檢測和定量分析，檢測過程中用計算機(jī)圖像分析儀〔2～5〕。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS變化 B、C、D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS均顯著低于A組(P<0.05)，D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的CBS又均顯著低于B、C組(P<0.05)，但B、C組差異均不顯著(P>0.05)，見表1。

表1 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 wCBS變化(分，

與A組比較：1)P<0.05；與D組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積變化 B、C、D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積均顯著高于A組(P<0.05)，D組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積又均顯著高于B、C組(P<0.05)，但B組、C組差異均不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 4組移植手術(shù)后2、4、6、8 w的神經(jīng)元面積變化

3 討 論

由于哺乳動物中樞神經(jīng)損傷后再生極為困難，因此平面以下下肢癱瘓在脊髓損傷的作用下發(fā)生一直是臨床研究的難點和重點〔6〕。醫(yī)學(xué)實驗表明〔7～10〕，脊髓損傷后由于缺乏對促進(jìn)神經(jīng)再生進(jìn)行誘導(dǎo)的微環(huán)境等，因此無法再生，這和周圍神經(jīng)不同。醫(yī)學(xué)實驗顯示〔11，12〕，宿主脊髓中胚胎脊髓移植能夠存活、生長等并促進(jìn)部位纖維連接的形成，為恢復(fù)神經(jīng)功能提供良好的前提條件。對其應(yīng)用外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠?qū)顾枭窠?jīng)元萎縮進(jìn)行有效防止，促進(jìn)紅核脊髓通路的再生。在神經(jīng)營養(yǎng)因子中，最具感覺及運(yùn)動神經(jīng)元活性的是神經(jīng)生長因子。FSC及外源性神經(jīng)生長因子均能夠有效改善脊髓損傷局部微環(huán)境，將良好的前提條件提供給損傷脊髓的神經(jīng)纖維再生。本研究結(jié)果充分說明FSC結(jié)合神經(jīng)生長因子能夠有效修復(fù)老年大鼠的損傷脊髓功能。

1 劉 佳.脊髓脫細(xì)胞支架復(fù)合人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠脊髓長節(jié)段缺損軸突長入再生及功能恢復(fù)〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

2 劉 炎.人臍帶Wharton膠間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)雪旺細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的實驗研究〔D〕.長春：吉林大學(xué)，2013.

3 王 勇，趙 偉，馮健洲，等.神經(jīng)生長因子修飾脂肪干細(xì)胞移植促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù)〔J〕.中國組織工程研究，2015；10(14)：2224-9.

4 孫兆忠，李 瑞，房清敏，等.臍血干細(xì)胞移植及電針治療脊髓損傷大鼠神經(jīng)生長因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子3的表達(dá)〔J〕.中國組織工程研究，2015；19(1)：61-6.

5 柴 勇，楊 成，張 敏.神經(jīng)干細(xì)胞移植治療對損傷脊髓大鼠神經(jīng)生長因子表達(dá)的影響〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2013；29(12)：1910-2.

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8 佘志峰，陳煒煒，蔣功達(dá).神經(jīng)生長因子結(jié)合高壓氧治療脊髓損傷療效分析〔J〕.現(xiàn)代實用醫(yī)學(xué)，2013；5(1)：63-4.

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11 Bramlett HM，Dietrich WD，Marcillo A，etal.Effects of low intensity vibration on bone and muscle in rats with spinal cord injury〔J〕.Osteoporosis Int，2014；25(9)：2209-19.

12 Menon N，Gupta A，Khanna M，etal.Ambulation following spinal cord injury and its correlates〔J〕.Ann Indian Acad Neurol，2015；18(2)：167-70.

〔2015-02-11修回〕

(編輯 苑云杰)

牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(No.ZS201523；ZS201526)

安 寧(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)病學(xué)研究。

解錦鼎(1982-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事脊髓損傷研究。

R53.3

A

1005-9202(2016)21-5269-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.024

1 牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科