王 虎 白 楊 單 臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

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抑肽酶對(duì)跟腱斷裂白兔模型跟腱修復(fù)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2表達(dá)的影響

王 虎 白 楊 單 臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 觀察抑肽酶對(duì)白兔跟腱斷裂修復(fù)的影響。方法 選用60只新西蘭白兔，隨機(jī)分為三組(正常對(duì)照組、模型損傷組、抑肽酶治療組)，于造模后第3天及第1、2、3、4周采集標(biāo)本，RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2) mRNA表達(dá)，免疫組化染色觀察TGF-β2蛋白表達(dá)。結(jié)果 抑肽酶組在3 d TGF-β2 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，在1 w后，抑肽酶組TGF-β2 mRNA表達(dá)低于模型組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第2～3周時(shí)，抑肽酶組中表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá)，術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2～4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。結(jié)論 抑肽酶可減輕炎癥反應(yīng)，早期可通過(guò)調(diào)控TGF-β2的表達(dá)量，促進(jìn)跟腱斷裂的修復(fù)。

抑肽酶；跟腱斷裂；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2

跟腱斷裂在臨床骨科治療過(guò)程中主要以石膏固定及手術(shù)治療為主，但均不能取得滿意的臨床效果，可能會(huì)再次出現(xiàn)跟腱斷裂〔1，2〕。抑肽酶是非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，通過(guò)抑制激肽釋放酶以及纖溶酶而達(dá)到止血的目的，廣泛用于體外循環(huán)的心血管手術(shù)和多種疾病的治療〔3〕。目前抑肽酶在骨科應(yīng)用的報(bào)道較少。本研究擬觀察抑肽酶對(duì)跟腱斷裂的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 新西蘭白兔，雌雄兼用，體重(2.8±0.2)kg。吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 跟腱斷裂白兔模型的建立 白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行造模。造模前12 h開(kāi)始禁食、不禁水，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將白兔固定于手術(shù)臺(tái)上，實(shí)施跟腱局部麻醉后，用手術(shù)刀切斷跟腱內(nèi)側(cè)1/2組織，使中央部分成“V”字缺損。跟腱周?chē)荒そz線連續(xù)縫合，絲線間斷縫合皮膚。術(shù)后無(wú)菌紗布包扎傷口，并扎緊，防止脫落。每只兔肌肉注射青霉素(1次/d，40萬(wàn)U/次)，連續(xù)3 d。傷口不給予更換紗布，不給予夾板固定，給予籠外放養(yǎng)，自由活動(dòng)。所有動(dòng)物外科手術(shù)操作由同一實(shí)驗(yàn)人員完成。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 取60只新西蘭白兔，隨機(jī)分為三組：正常對(duì)照組(不做任何處理)，抑肽酶組(制備模型縫合鍵周膜后，損傷部位周?chē)⑸湟蛛拿?0 000 kIU/ml，縫合皮膚)，模型組，在損傷部位注射等容量生理鹽水。

1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β2 mRNA表達(dá) 于造模后第3天及第1、2、3、4周每組白兔耳緣靜脈注射空氣 20 ml處死動(dòng)物，取下造模側(cè)的跟腱組織后，稱(chēng)取組織研磨裂解進(jìn)行總RNA提取，利用核酸定量?jī)x檢測(cè)樣品濃度。采用RT-PCR法檢測(cè)TGF-β2基因的表達(dá)。TGF-β2(191 bp)正義鏈：5′ccggaggtgatctccatcta3′；反義鏈：5′actgagccagagggtgttgt3′。βactin(350 bp)正義鏈：5′aggccaaccgcgagaagaI，gacc3′；反義鏈：5′aggccaaccgcgagaagatgacc3′設(shè)置條件：變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s。配置1.5%的瓊脂糖凝膠，吸取5 μl PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，120 U，30 min電泳。利用凝膠成像儀觀察結(jié)果并采集圖片，使用Quantity One對(duì)圖片進(jìn)行灰度掃描分析。

1.2.4 免疫組化染色觀察TGF-β2蛋白表達(dá) 于造模后第3天及第1、2、3、4周每組白兔耳緣靜脈注射空氣 20 ml處死動(dòng)物，取下造模側(cè)的跟腱組織后，將跟腱用10%福爾馬林固定，經(jīng)石蠟包埋后，縱切厚4 μm標(biāo)本，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0 軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚切口在術(shù)后1 w內(nèi)基本愈合，未發(fā)生傷口感染情況。

2.1 RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β2 mRNA表達(dá) 圖1，圖2可見(jiàn)，抑肽酶組在3 d TGF-β2 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，在1 w后，抑肽酶組TGF-β2 mRNA表達(dá)低于模型組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第2～3周時(shí)，抑肽酶組中表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)。第4周時(shí)兩組的TGF-β2的表達(dá)量接近于正常組。

1.正常組;2.模型組;3.抑肽酶組，下圖同圖1 白兔跟腱組織中TGF-2 mRNA表達(dá)

2.2 TGF-β2在抑肽酶對(duì)白兔跟腱斷裂模型跟腱修復(fù)中的表達(dá) TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá)，術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2～4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。見(jiàn)圖3。

圖2 白兔跟腱組織中β-actin mRNA表達(dá)

圖3 TGF-β2在白兔跟腱組織中的免疫組化表達(dá)(DAB,×200)

3 討 論

跟腱斷裂早期修復(fù)過(guò)程中常常形成粘連導(dǎo)致肌腱愈合不佳。資料報(bào)道，產(chǎn)生粘連的主要原因是由于損傷早期，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，在炎性細(xì)胞的作用下，成纖維細(xì)胞過(guò)量增殖，在損傷周?chē)霈F(xiàn)大量膠原纖維〔1〕。TGF-β 是一個(gè)多功能的多肽家族，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成、細(xì)胞的移動(dòng)、黏附、機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)等方面均有著非常重要的作用〔2，3〕。TGF-β促進(jìn)組織修復(fù)的保護(hù)性因子，對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)合成具有重要的調(diào)節(jié)作用〔4〕。TGF-β2又被稱(chēng)為軟骨因子β，它可以促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞的增殖，使其分化為軟骨細(xì)胞，還可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)如膠原、透明質(zhì)酸酶和蛋白聚糖的合成〔5〕。TGF-β作用于肌腱愈合的所有階段，能刺激外源性細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)蛋白酶、纖維素連接作用和刺激膠原產(chǎn)生〔6〕。TGF-β2可在體外促進(jìn)肌腱細(xì)胞膠原的生成〔7〕。Decker等〔8〕對(duì)損傷修復(fù)后的馬屈肌腱中的TGF-β的內(nèi)源性表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)TGF-β2作為表達(dá)水平最高的生長(zhǎng)因子，在修復(fù)第5天出現(xiàn)高峰，在本實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)，TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá)，術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2～4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá)，術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組，第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2～4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。這種現(xiàn)象說(shuō)明抑肽酶可以通過(guò)改變TGF-β2的提前表達(dá)加速跟腱組織的愈合，而在后期TGF-β2表達(dá)下降，是否抑肽酶此時(shí)通過(guò)抑制跟腱的外源性愈合機(jī)制而主要是依靠腱細(xì)胞自身的分化增殖的內(nèi)源性愈合機(jī)制促進(jìn)跟腱的愈合，還是抑肽酶通過(guò)調(diào)控其他細(xì)胞因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等促進(jìn)跟腱后期的愈合值得進(jìn)一步研究。

1 Khanna A，F(xiàn)riel M，Gougoulias N，etal.Prevention of adhesions in surgery of the flexor tendons of the hand：what is the evidence〔J〕.Br Med Bull，2009；90(1)：85-109.

2 Heino J，Ignotz RA，Hemler ME，etal.Regulation of cell adhesion receptors by transforming growth factor-beta.Concomitant regulation of integrins that share a common beta 1 subunit〔J〕.J Biol Chem，1989；264(4)：380-9.

3 Ignotz RA，Massague J.Transforming growth factor-beta stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix〔J〕.J Biol Chem，1986；261(9)：4337-45.

4 Livne E，Laufer D，Blumenfeld I.Osteoarthritis in the temparomandbular joint (TMJ) of aged mice and the in vitro effect of TGF-beta 1 on cell proliferation matrix synthesis,an alkaline phosphatase activity〔J〕.Microsc Res Tech，1997；37(4)：314-23.

5 Van Osch GJ，Van der Veen SW，Burger EH，etal.Chondrogenic potential of in vitro multiplied rabbit perichondrium cells cultured in alginate beads in defined medium〔J〕.Tissue Eng，2000；6(4)：321-30.

6 Kibe Y，Takenaka H，Kishimoto S.Spatial and temporal expression of basic fibroblast growth factor protein during wound healing of rat skin〔J〕.Br J Dermatol，2000；143(4)：720-7.

7 Kein MB，Yalamanchi N，Pham H.Flexor tendon healing in vitro：effects of TGF-beta on tendon cell collagen production〔J〕.J Hand Surg Am，2002；27(4)：615-20.

8 Decker R，Ibertsson-wikland K，Kristrom B，etal.Metabolic outcome of GH treatment in prepubertal short children with and without classical GH deficiency〔J〕.Clin Endocrinol (Oxf)，2010；73(3)：346-56.

〔2015-12-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.201215199)

單 臣(1968-)，男，主任醫(yī)師，主要從事周?chē)窠?jīng)及軟組織損傷的研究。

王 虎(1972-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事足踝疾病診治及四肢軟組織損傷修復(fù)治療研究。

R39

A

1005-9202(2016)21-5236-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.009