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        抑肽酶對(duì)跟腱斷裂白兔模型跟腱修復(fù)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2表達(dá)的影響

        2016-12-06 03:28:45
        中國(guó)老年學(xué)雜志 2016年21期
        關(guān)鍵詞:白兔跟腱胞外基質(zhì)

        王 虎 白 楊 單 臣

        (吉林省人民醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

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        抑肽酶對(duì)跟腱斷裂白兔模型跟腱修復(fù)中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2表達(dá)的影響

        王 虎 白 楊 單 臣

        (吉林省人民醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

        目的 觀察抑肽酶對(duì)白兔跟腱斷裂修復(fù)的影響。方法 選用60只新西蘭白兔,隨機(jī)分為三組(正常對(duì)照組、模型損傷組、抑肽酶治療組),于造模后第3天及第1、2、3、4周采集標(biāo)本,RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2) mRNA表達(dá),免疫組化染色觀察TGF-β2蛋白表達(dá)。結(jié)果 抑肽酶組在3 d TGF-β2 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05),在1 w后,抑肽酶組TGF-β2 mRNA表達(dá)低于模型組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第2~3周時(shí),抑肽酶組中表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá),術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組,第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2~4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。結(jié)論 抑肽酶可減輕炎癥反應(yīng),早期可通過(guò)調(diào)控TGF-β2的表達(dá)量,促進(jìn)跟腱斷裂的修復(fù)。

        抑肽酶;跟腱斷裂;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2

        跟腱斷裂在臨床骨科治療過(guò)程中主要以石膏固定及手術(shù)治療為主,但均不能取得滿意的臨床效果,可能會(huì)再次出現(xiàn)跟腱斷裂〔1,2〕。抑肽酶是非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑,通過(guò)抑制激肽釋放酶以及纖溶酶而達(dá)到止血的目的,廣泛用于體外循環(huán)的心血管手術(shù)和多種疾病的治療〔3〕。目前抑肽酶在骨科應(yīng)用的報(bào)道較少。本研究擬觀察抑肽酶對(duì)跟腱斷裂的修復(fù)作用。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物 新西蘭白兔,雌雄兼用,體重(2.8±0.2)kg。吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 跟腱斷裂白兔模型的建立 白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行造模。造模前12 h開(kāi)始禁食、不禁水,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將白兔固定于手術(shù)臺(tái)上,實(shí)施跟腱局部麻醉后,用手術(shù)刀切斷跟腱內(nèi)側(cè)1/2組織,使中央部分成“V”字缺損。跟腱周?chē)荒そz線連續(xù)縫合,絲線間斷縫合皮膚。術(shù)后無(wú)菌紗布包扎傷口,并扎緊,防止脫落。每只兔肌肉注射青霉素(1次/d,40萬(wàn)U/次),連續(xù)3 d。傷口不給予更換紗布,不給予夾板固定,給予籠外放養(yǎng),自由活動(dòng)。所有動(dòng)物外科手術(shù)操作由同一實(shí)驗(yàn)人員完成。

        1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 取60只新西蘭白兔,隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組(不做任何處理),抑肽酶組(制備模型縫合鍵周膜后,損傷部位周?chē)⑸湟蛛拿?0 000 kIU/ml,縫合皮膚),模型組,在損傷部位注射等容量生理鹽水。

        1.2.3 RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β2 mRNA表達(dá) 于造模后第3天及第1、2、3、4周每組白兔耳緣靜脈注射空氣 20 ml處死動(dòng)物,取下造模側(cè)的跟腱組織后,稱(chēng)取組織研磨裂解進(jìn)行總RNA提取,利用核酸定量?jī)x檢測(cè)樣品濃度。采用RT-PCR法檢測(cè)TGF-β2基因的表達(dá)。TGF-β2(191 bp)正義鏈:5′ccggaggtgatctccatcta3′;反義鏈:5′actgagccagagggtgttgt3′。βactin(350 bp)正義鏈:5′aggccaaccgcgagaagaI,gacc3′;反義鏈:5′aggccaaccgcgagaagatgacc3′設(shè)置條件:變性94℃30 s,退火58℃30 s,延伸72℃30 s。配置1.5%的瓊脂糖凝膠,吸取5 μl PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣,120 U,30 min電泳。利用凝膠成像儀觀察結(jié)果并采集圖片,使用Quantity One對(duì)圖片進(jìn)行灰度掃描分析。

        1.2.4 免疫組化染色觀察TGF-β2蛋白表達(dá) 于造模后第3天及第1、2、3、4周每組白兔耳緣靜脈注射空氣 20 ml處死動(dòng)物,取下造模側(cè)的跟腱組織后,將跟腱用10%福爾馬林固定,經(jīng)石蠟包埋后,縱切厚4 μm標(biāo)本,進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS14.0 軟件行t檢驗(yàn)。

        2 結(jié) 果

        全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚切口在術(shù)后1 w內(nèi)基本愈合,未發(fā)生傷口感染情況。

        2.1 RT-PCR方法檢測(cè)TGF-β2 mRNA表達(dá) 圖1,圖2可見(jiàn),抑肽酶組在3 d TGF-β2 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05),在1 w后,抑肽酶組TGF-β2 mRNA表達(dá)低于模型組,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在第2~3周時(shí),抑肽酶組中表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)。第4周時(shí)兩組的TGF-β2的表達(dá)量接近于正常組。

        1.正常組;2.模型組;3.抑肽酶組,下圖同圖1 白兔跟腱組織中TGF-2 mRNA表達(dá)

        2.2 TGF-β2在抑肽酶對(duì)白兔跟腱斷裂模型跟腱修復(fù)中的表達(dá) TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá),術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組,第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2~4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。見(jiàn)圖3。

        圖2 白兔跟腱組織中β-actin mRNA表達(dá)

        圖3 TGF-β2在白兔跟腱組織中的免疫組化表達(dá)(DAB,×200)

        3 討 論

        跟腱斷裂早期修復(fù)過(guò)程中常常形成粘連導(dǎo)致肌腱愈合不佳。資料報(bào)道,產(chǎn)生粘連的主要原因是由于損傷早期,出現(xiàn)炎癥反應(yīng),在炎性細(xì)胞的作用下,成纖維細(xì)胞過(guò)量增殖,在損傷周?chē)霈F(xiàn)大量膠原纖維〔1〕。TGF-β 是一個(gè)多功能的多肽家族,在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成、細(xì)胞的移動(dòng)、黏附、機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)等方面均有著非常重要的作用〔2,3〕。TGF-β促進(jìn)組織修復(fù)的保護(hù)性因子,對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞外基質(zhì)合成具有重要的調(diào)節(jié)作用〔4〕。TGF-β2又被稱(chēng)為軟骨因子β,它可以促進(jìn)骨膜間充質(zhì)細(xì)胞的增殖,使其分化為軟骨細(xì)胞,還可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)如膠原、透明質(zhì)酸酶和蛋白聚糖的合成〔5〕。TGF-β作用于肌腱愈合的所有階段,能刺激外源性細(xì)胞遷移、調(diào)節(jié)蛋白酶、纖維素連接作用和刺激膠原產(chǎn)生〔6〕。TGF-β2可在體外促進(jìn)肌腱細(xì)胞膠原的生成〔7〕。Decker等〔8〕對(duì)損傷修復(fù)后的馬屈肌腱中的TGF-β的內(nèi)源性表達(dá)情況進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)TGF-β2作為表達(dá)水平最高的生長(zhǎng)因子,在修復(fù)第5天出現(xiàn)高峰,在本實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn),TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá),術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組,第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2~4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。TGF-β2蛋白在正常白兔跟腱有少量表達(dá),術(shù)后第3天時(shí)抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組,第1周抑肽酶組中表達(dá)量明接近模型。2~4 w時(shí)抑肽酶組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。這種現(xiàn)象說(shuō)明抑肽酶可以通過(guò)改變TGF-β2的提前表達(dá)加速跟腱組織的愈合,而在后期TGF-β2表達(dá)下降,是否抑肽酶此時(shí)通過(guò)抑制跟腱的外源性愈合機(jī)制而主要是依靠腱細(xì)胞自身的分化增殖的內(nèi)源性愈合機(jī)制促進(jìn)跟腱的愈合,還是抑肽酶通過(guò)調(diào)控其他細(xì)胞因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等促進(jìn)跟腱后期的愈合值得進(jìn)一步研究。

        1 Khanna A,F(xiàn)riel M,Gougoulias N,etal.Prevention of adhesions in surgery of the flexor tendons of the hand:what is the evidence〔J〕.Br Med Bull,2009;90(1):85-109.

        2 Heino J,Ignotz RA,Hemler ME,etal.Regulation of cell adhesion receptors by transforming growth factor-beta.Concomitant regulation of integrins that share a common beta 1 subunit〔J〕.J Biol Chem,1989;264(4):380-9.

        3 Ignotz RA,Massague J.Transforming growth factor-beta stimulates the expression of fibronectin and collagen and their incorporation into the extracellular matrix〔J〕.J Biol Chem,1986;261(9):4337-45.

        4 Livne E,Laufer D,Blumenfeld I.Osteoarthritis in the temparomandbular joint (TMJ) of aged mice and the in vitro effect of TGF-beta 1 on cell proliferation matrix synthesis,an alkaline phosphatase activity〔J〕.Microsc Res Tech,1997;37(4):314-23.

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        6 Kibe Y,Takenaka H,Kishimoto S.Spatial and temporal expression of basic fibroblast growth factor protein during wound healing of rat skin〔J〕.Br J Dermatol,2000;143(4):720-7.

        7 Kein MB,Yalamanchi N,Pham H.Flexor tendon healing in vitro:effects of TGF-beta on tendon cell collagen production〔J〕.J Hand Surg Am,2002;27(4):615-20.

        8 Decker R,Ibertsson-wikland K,Kristrom B,etal.Metabolic outcome of GH treatment in prepubertal short children with and without classical GH deficiency〔J〕.Clin Endocrinol (Oxf),2010;73(3):346-56.

        〔2015-12-09修回〕

        (編輯 袁左鳴)

        吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.201215199)

        單 臣(1968-),男,主任醫(yī)師,主要從事周?chē)窠?jīng)及軟組織損傷的研究。

        王 虎(1972-),男,副主任醫(yī)師,主要從事足踝疾病診治及四肢軟組織損傷修復(fù)治療研究。

        R39

        A

        1005-9202(2016)21-5236-03;

        10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.009

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