張國(guó)興 齊 力 李曉華 趙 輝 孫 霓 孫 宇 李秀江

(吉林省腫瘤醫(yī)院ICU科，吉林 長(zhǎng)春 130012)

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促紅細(xì)胞生成素對(duì)內(nèi)毒素所致大鼠腎臟線粒體損傷的保護(hù)作用

張國(guó)興 齊 力1李曉華2趙 輝 孫 霓 孫 宇 李秀江

(吉林省腫瘤醫(yī)院ICU科，吉林 長(zhǎng)春 130012)

目的 利用建立脂多糖(LPS)大鼠內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致腎臟損傷模型觀察促紅細(xì)胞生成素(EPO)防治脂多糖對(duì)腎臟造成損害的機(jī)制。方法 隨機(jī)選取成年Wistar大鼠30只，采用等組實(shí)驗(yàn)法分為空白對(duì)照組、脂多糖(LPS)組以及聯(lián)合(LPS+EPO)組。除空白對(duì)照組以外，其余兩組分別注射LPS 10 mg/ml，采取尾靜脈注射建立腎臟損傷模型，空白對(duì)照組給予同等量生理鹽水，30 min后，LPS+EPO組給予rhEPO(5 000 U/kg)經(jīng)尾靜脈注射。其余2組大鼠給予生理鹽水。在LPS注射后24 h處死大鼠，分離提取腎臟組織線粒體，用 Clark 氧電極法檢測(cè)線粒體呼吸功能，線粒體內(nèi)、外膜試劑盒測(cè)定線粒體膜完整性，一氧化氮(NO)試劑盒測(cè)定線粒體NO含量，電鏡掃描觀察線粒體形態(tài)變化。結(jié)果 LPS組和LPS+EPO組的線粒體外膜完整率、內(nèi)膜膜電位、呼吸控制率均較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，LPS+EPO組上述結(jié)果均高于LPS組(P<0.05)；LPS組線粒體NO含量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，LPS+EPO組低于LPS組(P<0.01)，電鏡掃描見LPS組線粒體結(jié)構(gòu)受損明顯，EPO減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷。結(jié)論 EPO對(duì)內(nèi)毒素導(dǎo)致的腎臟線粒體損傷有保護(hù)作用，可能與EPO抑制NO生成有關(guān)。

促紅細(xì)胞生成素；內(nèi)毒素；腎損傷；線粒體

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)表明，每天有1萬(wàn)多人死于感染疾病，而被感染人群的比率每年高達(dá)8%〔1〕。絕大多數(shù)被感染的患者腎臟功能破壞是造成死亡的首要原因。腎臟是重癥感染所致多臟器損傷中最常受累及的臟器之一，急性腎衰竭的發(fā)病率可高達(dá)40%～50%〔2〕。促紅細(xì)胞生成素(EPO)對(duì)內(nèi)毒素所致腎臟損傷具有保護(hù)作用〔3〕，本研究探討EPO對(duì)于脂多糖(LPS)所致大鼠急性腎損傷的腎臟線粒體的保護(hù)作用。

1 材料及方法

1.1 動(dòng)物及主要試劑 Wistar成年大鼠30只，雌鼠15只，雄鼠15只，重量最大為250 g，所有的大鼠均有合格證明，證號(hào)為：scxk(吉)2008-0005，由吉大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，大鼠供養(yǎng)溫度22℃～24℃，并保證大鼠的吃食正常，此次研究的相關(guān)內(nèi)容以及規(guī)定均已經(jīng)通過審查。重組人EPO的批號(hào)為(20071102V；100 000 IU/支)，是由沈陽(yáng)三生制藥所生產(chǎn)的。LPS(Sigma-L2880；≥99%) 上海Sigma公司。Percoll 細(xì)胞分離液 Pharmacia17-0891-01(MK 02742)由日本郵購(gòu)，IMM以及外膜功能檢測(cè)盒的生產(chǎn)公司為上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，NO試劑盒購(gòu)于南京建成生物醫(yī)藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型的建立及標(biāo)本采集 對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)7 d，并按照基礎(chǔ)適應(yīng)性方法進(jìn)行飼養(yǎng)，7 d后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用等組實(shí)驗(yàn)法，平均分為空白對(duì)照組、LPS組以及聯(lián)合(LPS+EPO)組，每組各10只。除空白對(duì)照組外，其余兩組各尾靜脈注射含量為10 mg/ml的LPS〔4〕。注射LPS后，等待0.5 h，LPS+EPO組尾靜脈注射含量為5 000 U/kg的重組人紅細(xì)胞生成素，空白對(duì)照組以及LPS組注射等量氯化鈉溶液，LPS注射后24 h，乙醚吸入麻醉后處死。取右側(cè)新鮮腎臟組織用于線粒體提取，左側(cè)腎臟組織2.5%戊二醛固定。

1.2.2 腎臟線粒體提取 取腎臟組織，最重為500 mg，將其轉(zhuǎn)移到冰冷的mitochondrion分離緩沖液之中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)用的所有設(shè)備以及緩沖液都要控制冰冷度，以4℃為最佳，所采用的試樣要將其放置在3.6 ml 12%的Percoll分層液中攪拌均勻，并使用勻漿器均勻攪動(dòng)，以10次為最佳，且使用的勻漿器直徑應(yīng)為0.12 mm，并再次用直徑0.06 mm的勻漿器攪拌，數(shù)量與之前一致。獲得mitochondrion的方式選擇Percoll密度梯度離心法〔3〕，加入分離介質(zhì)重懸mitochondrion，按照1∶0.4的體積，并放置于冰槽中，等待檢查。

1.2.3 mitochondrion呼吸功能測(cè)定 使用Respiration Measurement法，在反應(yīng)槽中放置2.5 ml的反應(yīng)溶劑(225 mmol/L D-木蜜醇，70 mmol/L白砂糖，1 mmol/L乙二胺四乙酸，0.1%牛血清白蛋白，10 mmol/L磷酸三鉀，ph=7.4，設(shè)置溫度25℃)，將所有物質(zhì)充分?jǐn)嚢杈鶆?，?dāng)基本氧濃度為240 μmol/L時(shí)，則狀態(tài)平衡。將含量為2 mg的線粒體懸液進(jìn)行60 s的孵育。將4 mmol/L的Disodium Succinate放置，耗氧速率為4態(tài)呼吸。將50 mmol/L的二磷酸腺苷加入，測(cè)定耗氧速率為3態(tài)呼吸。4態(tài)呼吸和3態(tài)呼吸分別為R3和R4，新鮮提取的線粒體，按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)線粒體膜完整性及NO含量。

1.2.4 線粒體超微結(jié)構(gòu) 記錄2.5% C5H8O2已經(jīng)固定的腎組織，進(jìn)行1% OsO4后加固，梯度酒精脫水，Epoxy resin包埋，使用型號(hào)為L(zhǎng)KB-Ⅲ的超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，醋酸氧鈾以及C6H5O7Pb雙上色。完成上述過程后，使用規(guī)格為JEM-1200EX透射式電子顯微鏡，對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 線粒體呼吸功能對(duì)比 LPS+EPO組、LPS組R3及RCR相比于空白對(duì)照組差異顯著(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+EPO組R3和RCR值升高(P<0.05)。見表1。

2.2 線粒體內(nèi)外膜完整性對(duì)比及NO含量mitochondrion完整性和內(nèi)膜膜電位熒光對(duì)比 與LPS組比較，外膜完整率及內(nèi)膜膜電位熒光比值升高(P<0.05)。LPS組NO含量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01)，LPS+EPO組低于LPS組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠腎臟線粒體呼吸功能比較

與空白對(duì)照組比較：1)P=0.003，2)P= 0.001；與LPS組比較：3)P=0.009，4)P=0.019

表2 各組大鼠腎臟線粒體膜完整性比較及NO含量比較

與空白對(duì)照組比較:1)P=0.005，2)P= 0.008，3)P=0.000;與LPS組比較:4)P=0.017，5)P=0.038，6)P=0.010

2.3 電鏡形態(tài)觀察 LPS組腎臟線粒體明顯腫脹，線粒體內(nèi)腔擴(kuò)大，嵴數(shù)量減少，模糊紊亂，部分嵴消失或空泡化，LPS+EPO組腎臟線粒體損傷有不同程度的緩解，線粒體腫脹減輕，嵴致密排列較整齊，部分嵴模糊，排列尚規(guī)則。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟線粒體電鏡掃描結(jié)果(×10 000)

3 討 論

線粒體是細(xì)胞維持生命的重要細(xì)胞器，由內(nèi)膜、外膜和基質(zhì)組成，是三磷酸腺苷(ATP)形成的主要場(chǎng)所，是機(jī)體的 “能量工廠”。ATP生成的主要方式是氧化磷酸化，電子在內(nèi)膜呼吸鏈中傳遞。內(nèi)毒素所致的重癥感染導(dǎo)致臟器功能障礙的機(jī)制十分復(fù)雜，線粒體功能障礙在發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到重視。本研究結(jié)果表明，LPS可以導(dǎo)致腎臟線粒體損傷，主要表現(xiàn)在線粒體呼吸功能顯著降低，線粒體膜的完整性遭到破壞，電鏡掃描下線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)破壞明顯。

重癥感染時(shí)，LPS使用TOLL樣受體，將腫瘤壞死因子-α誘發(fā)出，在此過程中，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和其受體-1相聯(lián)合，使其1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶異常開放，同時(shí)加速活性氧(ROS)的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激損傷〔5〕。因此TNF-α與感染性休克誘導(dǎo)的線粒體功能障礙有著密切關(guān)系〔6〕。

本研究組既往的研究〔3〕表明EPO對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)的活化進(jìn)行遏制，將核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)表達(dá)有效減少，真正的控制TNF-α的表達(dá)，來保護(hù)重癥感染導(dǎo)致的急性腎損傷，萬(wàn)芳等〔7〕的研究表明EPO降低重癥感染時(shí)組織NO的產(chǎn)生。本研究中，給予LPS建立重癥感染模型后，再給予EPO保護(hù)臟器治療，線粒體呼吸功能顯著改善，R3和RCR值升高，線粒體膜完成性明顯提高，電鏡掃描證實(shí)線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。NO含量較LPS組降低。

綜上所述，EPO可以保護(hù)LPS導(dǎo)致的腎臟線粒體破壞，調(diào)節(jié)線粒體呼吸功能，其機(jī)制可能與EPO抑制TNF-α表達(dá)和減低NO生成有關(guān)。

1 Mayr FB，Yende S，Angus DC.Epidemiology of severe sepsis〔J〕.Virulence，2014；5(1)：4-11.

2 劉曉偉，劉 志.嚴(yán)重膿毒癥并發(fā)急性腎衰竭患者92例臨床研究〔J〕.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2010；13(7)：738-40.

3 張國(guó)興，李曉華，趙 輝，等.促紅細(xì)胞生成素對(duì)脂多糖所致大鼠腎損傷的保護(hù)作用〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版)，2014;8(6)：5-9.

4 劉 彤，李 哲，畢曉穎.新生大鼠腦組織中線粒體的分離〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2011;15(6)：1006-7.

5 Siepe M，Goebel U，Mecklenburg A，etal.Pulsatile pulmonary perfusion during cardiopulmonary bypass reduces the pulmonary inflammatory response 〔J〕.Ann Thorac Surg，2008;86(1)：115-22.

6 Víctor VM，Esplugues JV，Hernandez-Mijares A,etal.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in sepsis：a potential therapy with mitochondria-targeted antioxidants〔J〕.Infect Disord Drug Targets，2009;9(4)：376-89.

7 萬(wàn) 芳，吳 儉，汪翠婷，等.重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)感染性休克大鼠腦組織的保護(hù)作用〔J〕.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011;5(3)：1-4.

〔2015-10-10修回〕

(編輯 袁左鳴)

吉林省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(No.2012Z067)

李秀江(1961-)，男，教授，主要從事危重病研究。

張國(guó)興(1985-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事危重病研究。

R6

A

1005-9202(2016)21-5230-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.006

1 長(zhǎng)春市朝陽(yáng)區(qū)醫(yī)院 2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院感染科