王 鵬 歷 春 王海鵬 蓋曉東

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

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Alpha-突觸核蛋白寡聚體致帕金森病小鼠模型的行為學(xué)變化

王 鵬 歷 春1王海鵬 蓋曉東1

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

目的 觀察家族型帕金森病(PD)alpha-突觸核蛋白(α-Syn)突變體A53T和A30P寡聚體導(dǎo)致小鼠PD模型的行為學(xué)變化，探討α-Syn寡聚體在體內(nèi)的神經(jīng)毒性作用。方法 制備野生型α-Syn、家族型突變體A53T和A30P的聚集體，對C57BL/6小鼠進行紋狀體注射。培養(yǎng)至第30、60天，進行爬桿實驗、懸吊實驗、滾軸實驗和平衡木實驗評估行為學(xué)改變。免疫組織化學(xué)方法檢測黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元改變。結(jié)果 實驗鼠紋狀體α-Syn寡聚體注射后30 d出現(xiàn)PD樣運動障礙表現(xiàn)，紋狀體注射30 d和60 d后，各組小鼠的爬桿實驗結(jié)果均與對照組無差異(P>0.05)。注射30 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗、懸掛實驗、滾軸實驗與對照組無差異(P>0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木時間比對照組長(P<0.05)，滾軸上時間比對照組小鼠縮短(P<0.05)，懸掛評分比對照組明顯降低(P<0.01)，與野生型α-Syn寡聚體組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。注射60 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗平均通過時間比對照組小鼠長(P<0.05)、懸掛實驗評分較對照組小鼠降低(P<0.05)；A53T和A30P組小鼠各項行為學(xué)評估與對照組小鼠差異顯著(P<0.01)、與野生型α-Syn寡聚體組相比有差異(P<0.05)。A53T和A30P組小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目下降(P<0.05)。結(jié)論 紋狀體注射α-Syn突變體A53T和A30P寡聚體,模型小鼠出現(xiàn)PD樣行為學(xué)改變和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少。

帕金森病；alpha-突觸核蛋白；寡聚體

帕金森病(PD)是以神經(jīng)元內(nèi)路易體(LB)為主要病理特征的神經(jīng)變性病〔1〕。而alpha-突觸核蛋白(α-Syn)作為LB的主要成分，被認為是引起PD發(fā)病的關(guān)鍵性蛋白〔2〕。研究證實，存在于LB中的α-Syn大部分發(fā)生錯誤折疊而聚集〔3〕。外源性α-Syn的寡聚體進入神經(jīng)元后，可引起進一步聚集，形成不可溶的淀粉樣變性包涵體〔4〕。一些家族性PD患者α-Syn基因突變引起α-Syn錯譯發(fā)生結(jié)構(gòu)變化而易于聚集，其中以第88位堿基發(fā)生G-C突變，導(dǎo)致氨基酸序列第30位丙氨酸變成脯氨酸(A30P)，第209位核苷酸發(fā)生G-A突變，使氨基酸序列中第53位丙氨酸變成蘇氨酸(A53T)最常見〔5，6〕。我們已證實α-Syn突變型A53T和A30P的寡聚體可以進入神經(jīng)元，并較野生型α-Syn寡聚體對神經(jīng)元的毒性更大、在神經(jīng)元內(nèi)形成LB樣嗜酸性包涵體。如能利用其神經(jīng)毒性制作動物模型，對PD的發(fā)病機制研究意義重大。本研究利用α-Syn寡聚體神經(jīng)元感染的特點，對實驗動物進行紋狀體注射，觀察其行為學(xué)變化，探討在短時間內(nèi)構(gòu)建PD動物模型的可能，并進一步研究α-Syn 家族型突變體A53T和A30P寡聚體在體內(nèi)的神經(jīng)毒性作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 組織包埋劑(SAKURA Tissue-Tek?O.C.T.Compound)，購自美國SAKURA公司；α-Syn 單克隆抗體(ab138501)，購自Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，購自北京中杉金橋生物有限公司；TH抗體，購自美國Abcam公司。

1.2 實驗動物 C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2013-0001。動物訂購后，在26 cm×18 cm×18 cm籠箱內(nèi)、每籠5只適應(yīng)性培養(yǎng)7 d后，進行體重測量和紋狀體注射的預(yù)實驗操作。之后進行相應(yīng)實驗操作和按照實驗動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進行正常飼養(yǎng)。動物實驗操作流程經(jīng)實驗動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，動物試驗操作者持有實驗動物人員崗位證書，證書編號39749。共4組，假手術(shù)組、野生型α-Syn寡聚體組、A53T寡聚體組、A30P寡聚體組。每組8只。均采用左側(cè)紋狀體側(cè)注射。實驗組每只注射5 μg寡聚體〔7〕，體積為2 μl，假手術(shù)組注射2 μl PBS。

1.3 方法

1.3.1 紋狀體注射 小鼠稱重，10%水合氯醛0.004 ml/g體重進行腹腔注射麻醉。將小鼠頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，距離前囟冠狀位中線向前0.8 mm、前囟外側(cè)緣2.0 mm、距離硬腦膜深約3.0 mm、開骨窗，注射樣品，用牙托粉封閉顱骨孔。然后縫合筋膜和皮膚，并于腹腔注射氨芐青霉素8萬U，術(shù)后小鼠包被保暖，清醒后置于籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。

1.3.2 動物行為學(xué)觀察 通過爬桿實驗、懸吊實驗、滾軸實驗和平衡木實驗反映肌力、平衡和協(xié)調(diào)能力。分別在實驗前先訓(xùn)練大鼠3 d，然后開始正式實驗。在紋狀體注射前、注射第30、60天由經(jīng)過正式培訓(xùn)的實驗人員通過雙盲原則完成行為學(xué)測試。

1.3.2.1 爬桿實驗 參照Ogawa等〔8〕的測試方法，自制直徑0.8 cm、高60 cm 的直木桿，桿頂部有一小木球，外面覆蓋紗布以防止小鼠打滑。小鼠被頭向上放于桿頂端，記錄動物從開始運動到完全轉(zhuǎn)為頭向下的時間和它們下到桿底的時間。

1.3.2.2 懸掛實驗 參照Kuribara等〔9〕的測試方法，自制懸掛桿，水平放置，距地面30 cm。實驗中小鼠懸掛于金屬桿上，如小鼠用兩后爪計3分，如用一后爪抓住電線計2分，如小鼠兩后爪均抓不住電線計1 分，最后計算得分情況，測5次取平均值。

1.3.2.3 滾軸實驗 采用小鼠電動轉(zhuǎn)軸儀(Rotamex-5，Columbus Instruments)，滾軸直徑6 cm，轉(zhuǎn)速20 r/min，連續(xù)測20次取平均值〔10〕。

1.3.2.4 平衡木實驗 105 cm × 4 cm × 3 cm長木桿，木桿離地80 cm，兩端由木架支撐。實驗時，將小鼠放在起始區(qū)面對鼠籠方向，同時開始計時，記錄小鼠走過起始區(qū)的時間(潛伏期)和小鼠走過整個平衡桿的時間〔11〕。先訓(xùn)練3次，然后開始正式實驗。走3次取平均值。

1.3.3 免疫組織化學(xué)方法 將實驗小鼠灌注取腦，制備腦組織冰凍切片。將組織切片放入含0.3% Triton X-100的PBS中，4℃浸泡2～4 d；將組織切片在含有0.5% H2O2的PBS中處理30 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。在含1% 山羊血清中封閉30 ～ 60 min。加入TH抗體(1∶1 000)，4℃過夜。PBST沖洗后，加入生物素化的山羊抗小鼠IgG，1∶1 000，室溫孵育2 h。將切片用Tris-HCl緩沖液漂洗后，放入含有DAB和H2O2的顯色劑中顯色。顯色完成后，將切片移入Tris-HCl緩沖液中終止顯色。貼片上，低溫烤干或自然干燥，然后在不同濃度的乙醇中逐次脫水，每次5 min，然后移入二甲苯中透明，每次3 min。準(zhǔn)備好蓋玻片，封片劑封片。晾干后，觀察。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析，并用Sigma-plot繪圖軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠給予α-Syn寡聚體后的一般表現(xiàn) 紋狀體注射30 d后小鼠開始出現(xiàn)輕微震顫、運動減少，個別出現(xiàn)后肢張開、豎毛等改變；注射A53T和A30P組小鼠運動能力下降明顯，震顫增多，肢體僵硬，個別小鼠有步態(tài)不穩(wěn)、反應(yīng)遲緩的PD樣運動障礙表現(xiàn)。

圖1 C57BL/6小鼠爬桿實驗行為學(xué)觀察結(jié)果

2.2 行為學(xué)檢測 見圖1～圖4。紋狀體注射30 d和60 d后，各組小鼠的爬桿實驗結(jié)果均與對照組無差異(P>0.05)。注射30 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗、懸掛實驗、滾軸實驗與對照組無差異(P>0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木時間比對照組長(P<0.05)，滾軸時間比對照組小鼠縮短(P<0.05)，懸掛評分比對照組明顯降低(P<0.01)，與野生型α-Syn寡聚體組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。注射60 d后，野生型α-Syn寡聚體組小鼠平衡木實驗平均通過時間比對照組小鼠長(P<0.05)、懸掛實驗評分較對照組小鼠降低(P<0.05)；A53T和A30P組小鼠平衡木實驗平均通過時間、懸掛實驗評分和滾軸平衡時間均與對照組小鼠有顯著差異(P<0.01)、與野生型α-Syn寡聚體組相比有差異(P<0.05)。

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與α-Syn寡聚體組比較：3)P<0.05；下圖同圖2 C57BL/6小鼠平衡木實驗行為學(xué)觀察結(jié)果(n=8)

圖3 C57BL/6小鼠懸掛實驗行為學(xué)觀察結(jié)果(n=8)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與A53T組比較：3)P<0.05圖4 C57BL/6小鼠滾筒實驗行為學(xué)觀察結(jié)果(n=8)

2.3 黑質(zhì)多皮胺能神經(jīng)元免疫組織化學(xué)檢測 紋狀體注射第30天各組黑質(zhì)組織染色正常，未發(fā)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元減少。第60天，野生型α-Syn寡聚體組小鼠腦黑質(zhì)多皮胺能神經(jīng)元較對照組減少約26.53%(P<0.05)；A53T和A30P組與對照組相比，黑質(zhì)多皮胺能神經(jīng)元數(shù)目明顯減少約56.34 %和53.21%(P<0.01)，存留神經(jīng)元形態(tài)皺縮，突起減少，多巴胺能神經(jīng)纖維密度減低，見圖5。

標(biāo)尺：20 μm圖5 寡聚體組小鼠腦紋狀體注射同側(cè)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元較對照組減少

3 討 論

在神經(jīng)系統(tǒng)，細胞外源性可溶α-Syn寡聚體進入神經(jīng)元內(nèi)后可引起進一步聚集，形成不可溶的淀粉樣變性包涵體〔12〕。這些變性蛋白形成的包涵體可以經(jīng)細胞間的轉(zhuǎn)運感染正常細胞，使病變蔓延〔13〕。向PD患者腦黑質(zhì)內(nèi)移植胎兒中腦干細胞，結(jié)果顯示新移植的神經(jīng)元細胞內(nèi)也出現(xiàn)LB樣病變〔14〕，進一步證實了LB病變的可轉(zhuǎn)移性。本實驗結(jié)果證實，在紋狀體注射的α-Syn寡聚體可以在神經(jīng)元間傳遞的方式進入黑質(zhì)，并導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少。

本文行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，模型小鼠垂直運動能力未改變而出現(xiàn)懸掛能力減弱、滾筒保持平衡的時間縮短以及通過平衡桿時間延長等表現(xiàn)。在體內(nèi)證實家族型α-Syn突變體A53T、A30P聚集體對神經(jīng)元的毒性并具備制作PD模型的可能。良好的動物模型是探討PD發(fā)病機制和治療方案的基礎(chǔ)。已知PD主要發(fā)病機制是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元喪失、紋狀體多巴胺含量降低，而使膽堿能系統(tǒng)的功能相對亢進，造成紋狀體DA和乙酰膽堿遞質(zhì)失衡。PD模型主要通過損毀的辦法破壞黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)，繼而產(chǎn)生PD樣遞質(zhì)生化改變；藥物干擾Ach和DA的平衡，直接模擬PD的遞質(zhì)變化；或通過轉(zhuǎn)基因動物，從發(fā)病機制、生化改變以接近人PD改變。但模型均未有PD特征性的病理變化LB形成。我們利用α-Syn寡聚體和家族型α-Syn突變體A53T和A30P進行紋狀體注射，發(fā)現(xiàn)模型小鼠出現(xiàn)PD樣行為學(xué)改變和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少，提供了PD模型制備的新方法。

1 Irizarry MC，Growdon W，Gomez-Isla T，etal.Nigral and cortical Lewy bodies and dystrophic nigral neurites in Parkinson′s disease and cortical Lewy body disease contain alpha-synuclein immunoreactivity〔J〕.J Neuropathol Exp Neurol，1998；57(4)：334-7.

2 Baba M，Nakajo S，Tu PH,etal.Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson′s disease and dementia with Lewy bodies〔J〕.Am J Pathol，1998;152(4):879-84.

3 Conway KA，Lee SJ，Rochet JC，etal.Acceleration of oligomerization，not fibrillization，is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson′s disease：implications for pathogenesis and therapy〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2000;97(2)：571-6.

4 Uversky VN，Li J，F(xiàn)ink AL.Evidence for a partially folded intermediate in alpha-synuclein fibril formation〔J〕.J Biol Chem，2001;276(14)：10737-44.

5 Lou H，Montoya SE，Alerte TN，etal.Serine 129 phosphorylation reduces the ability of alpha-synuclein to regulate tyrosine hydroxylase and protein phosphatase 2A in vitro and in vivo〔J〕.J Biol Chem，2010;285：17648-61.

6 Liu D，Jin L，Wang H，etal.Silencing alpha-synuclein gene expression enhances tyrosine hydroxylase activity in MN9D cells〔J〕.Neurochem Res，2008，33：1401-9.

7 Luk KC，Kehm VM，Zhang B，etal.Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice〔J〕.J Exp Med,2012;209(5)：975-86.

8 Ogawa N，Hirose Y，Ohara S，etal.A simple quantitative bradykinesia test in MPTP-t reated mice〔J〕.Res Commun Chem Pathol Pharmacol,1985;50(3)：435-41.

9 Kuribara H，Higuchi Y，Tadokoro S.Effects of central depressants on rota-rod and traction performances in mice〔J〕.Jpn J Pharmacol,1977;27(1)：117-26.

10 Wozniak DF，Xiao M，Yamada KA，etal.Impaired spatial learning and defective theta burst induced LTP in mice lacking fibroblast growth factor 14〔J〕.Neurobiol Dis,2007；26：4-26.

11 Fu XH，Zhu M，Sun XY，etal.Original article hyperbaric oxygen treatment and enteral nutrition support with glutamine relieves traumatic brain injury in the rats〔J〕.Int J Clin Exp Med，2014;7(12)：5686-90.

12 Uversky VN，Li J，F(xiàn)ink AL.Evidence for a partially folded intermediate in alpha-synuclein fibril formation〔J〕.J Biol Chem，2001;276(14)：10737-44.

13 Clavaguera F，Bolmont T，Crowther RA，etal.Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain〔J〕.Nat Cell Biol，2009;11(7)：909-13.

14 Kordower JH，Chu Y，Hauser RA，etal.Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson′s disease〔J〕.Nat Med,2008;14：504-6.

〔2015-12-19修回〕

(編輯 徐 杰)

吉林省科技廳項目(20150101128JC)

蓋曉東(1962-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤分子病理學(xué)研究。

王 鵬(1977-)，男，博士，講師，主要從事人體解剖學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究。

R74

A

1005-9202(2016)21-5227-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.21.005

1 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室