李若云，張 嬌*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島市農(nóng)村環(huán)境工程研究中心，山東 青島 266109)

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高效液相色譜法檢測土壤中氧化樂果殘留

李若云1，2，張 嬌1，2*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島市農(nóng)村環(huán)境工程研究中心，山東 青島 266109)

采用高效液相色譜法優(yōu)化了土壤中的氧化樂果殘留測定條件，優(yōu)化結(jié)果為：色譜柱為Inertsil QDS-SP 4.6*250 mm，流動(dòng)相為甲醇/水(V/V=10/90)，溶劑為超純水，檢測波長210 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量為20 μL，總流速1.0 mL·min-1；氧化樂果在0.1～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9992)，最低檢測限0.1 μg·mL-1。采用振蕩提取法，提取劑為丙酮和乙酸乙酯，提取后的溶液以弗羅里硅土為固相萃取柱，淋洗劑為丙酮/乙腈(1/3)。采用上述方法對土壤樣品進(jìn)行測定，加標(biāo)回收率為在70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.08%～8.08%，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求，適合土壤中氧化樂果的殘留量檢測。

高效液相色譜；氧化樂果；土壤；有機(jī)磷農(nóng)藥

氧化樂果學(xué)名O，O-二甲基-S-[2-(甲胺基)-2-氧代乙基]硫代磷酸酯，是我國常用的農(nóng)藥之一，其毒性強(qiáng)[1]，對害蟲和螨類有很強(qiáng)的觸殺作用，主要用于防治香蕉、棉花及果樹的多種蚜蟲、卷葉蟲、斜紋夜蛾等害蟲[2]。施用的農(nóng)藥60%～70%都進(jìn)入土壤環(huán)境[3]。目前氧化樂果在果蔬生產(chǎn)上已被禁止使用[4]，但仍有地方違反規(guī)定繼續(xù)使用，加之大量農(nóng)藥使用導(dǎo)致其較長時(shí)間的殘存[5]，在土壤、水、果蔬中仍能檢出[6]，對土壤生態(tài)系統(tǒng)乃至人體健康有很大危害。因此針對土壤中氧化樂果建立準(zhǔn)確、完全系統(tǒng)的檢測方法是具有重要意義的。

已報(bào)道的氧化樂果檢測方法有毛細(xì)管電泳法[7]、氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]、TLCS法[11]和酶聯(lián)免疫法[12-13]等。氣相色譜法在氧化樂果的測定中應(yīng)用較多，但是氧化樂果的熱穩(wěn)定性差[14]。高效液相色譜法以其分離效能高、檢測靈敏度高、分析速度快等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于有機(jī)農(nóng)藥的檢測過程中。目前，研究者關(guān)于液相色譜法測定氧化樂果的研究，主要集中生物樣品[15]、食品[16]等氧化樂果殘留的檢測，關(guān)于土壤樣品中氧化樂果的檢測主要針對多種農(nóng)藥同時(shí)檢測[18]，由于氧化樂果極性較強(qiáng)，與其他農(nóng)藥相比，其檢測回收率普遍較低。此外，研究條件的改善使得早期研究成果逐漸不適合當(dāng)前研究且資料報(bào)道不詳?shù)龋沟猛寥乐醒趸瘶饭臋z測仍存在許多問題，因此，本研究在已有基礎(chǔ)上對高效液相色譜測定土壤中氧化樂果的方法進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化，分析試驗(yàn)過程中的問題，為研究者快速、準(zhǔn)確地掌握氧化樂果檢測方法提供借鑒，為土壤中氧化樂果的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器 LC-20A高效液相色譜(日本島津公司)，Inertsil QDS-SP 色譜柱(4.6×250 mm)；SHZ-82恒溫振蕩器(金壇市精達(dá)儀器制造廠)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-III 循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；萬分之一 電子分析天平[丹佛儀器(北京)有限公司]；GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；KQ-600B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2 藥品及試劑 氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)品100 μg·mL-1(美國Accustandard公司)，甲醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷、乙腈均為色譜純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，乙酸乙酯、中性氧化鋁、硅藻土均為分析純，超純水(屈臣氏)，硅酸鎂吸附劑(60～100目)，無水硫酸鈉(優(yōu)級(jí)純)。中性氧化鋁和無水硫酸鈉使用前450℃灼燒4 h，硅酸鎂吸附劑使用前650℃灼燒4 h，置于干燥的器皿中密封備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化 在流動(dòng)相、波長、溶劑、柱溫、洗脫方式等方面對液相色譜測定條件進(jìn)行了優(yōu)化。其中波長選擇210 nm和220 nm，流動(dòng)相選擇乙腈/水(6/94，V/V)和甲醇/水(10/9)，柱溫對25、30、35、40℃進(jìn)行優(yōu)化，樣品溶劑選擇乙腈和純水，在流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL，采用等度洗脫方式下，獲取優(yōu)化色譜條件。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 吸取氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)品用超純水逐級(jí)稀釋配成質(zhì)量濃度為10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別吸取1.5 mL質(zhì)量濃度為10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液于液相小瓶中，置于高效液相色譜儀上測定。以氧化樂果峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性方程。

1.2.3 樣品的提取 將供試土壤自然風(fēng)干，研磨后過100 目篩。稱取10.00 g土壤樣品置于250 mL的具塞錐形瓶中，加入1.0 μg·mL-1的氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL，并設(shè)置不添加農(nóng)藥但添加1.5 mL超純水的為空白對照，加入50 mL丙酮提取劑震蕩50 min，再加入50 mL乙酸乙酯提取劑振蕩50 min，抽濾(砂芯漏斗上鋪1層硅藻土)，用15 mL丙酮和乙酸乙酯1∶1混合提取劑淋洗瓶及殘?jiān)?～5次，合并濾液后40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干，用1 mL色譜純乙腈溶解，待凈化。

1.2.4 樣品的凈化 選取硅酸鎂吸附劑和中性氧化鋁兩種常用的固相萃取小柱富集氧化樂果，以丙酮和二氯甲烷(體積比1∶1)、丙酮和正己烷(體積比3∶1)、丙酮和乙腈(體積比1∶3)3種混合試劑作為淋洗劑，選取最佳的凈化條件。用丙酮和二氯甲烷的混合液(體積比1∶1)活化萃取柱，棄去淋洗液，加入1 μg·mL-1的氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL，分別用15 mL 3種淋洗劑分3次對樣品進(jìn)行洗脫，再用30 mL淋洗劑淋洗凈化柱，收集淋出液，在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至近干，用超純水定容至1.5 mL，過有機(jī)系0.22 μm的濾膜至樣品瓶，供高效液相色譜測定，并計(jì)算氧化樂果回收率。

1.2.5 方法回收率測定 稱取10.00 g梨園風(fēng)沙土和萊陽褐土樣品置于250 mL具塞錐形瓶中，在每種土樣中分別加入1.5 mL 5.0、1.0、0.5 μg·mL-1的氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品重復(fù)8次，每個(gè)土壤設(shè)置1個(gè)添加1.5 mL超純水不添加農(nóng)藥的為空白對照。將土樣用相同的提取條件、凈化條件和液相色譜檢測條件進(jìn)行處理，分析數(shù)據(jù)并計(jì)算方法回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

根據(jù)氧化樂果性質(zhì)，結(jié)合文獻(xiàn)[19-21]，在流動(dòng)相、波長、溶劑、柱溫、洗脫方式等方面對液相色譜測定條件進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，文獻(xiàn)[19-20]給出的波長和柱溫條件均具有較好的檢測效果，相比較而言，波長在210 nm時(shí)峰形略好，柱溫在25℃時(shí)氧化樂果峰形對稱，分離效果略好。

在流動(dòng)相和樣品溶劑選擇上，試驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道[19，21]有所不同，其中乙腈/水(10/90，V/V)為流動(dòng)相時(shí)峰保留時(shí)間為2.5 min左右，這個(gè)時(shí)間出峰，周圍干擾峰較大，并且氧化樂果峰形較小，難于滿足實(shí)際檢測結(jié)果的要求，相比以甲醇/水(V/V)=10/90做流動(dòng)相，農(nóng)藥氧化樂果在9 min左右出峰，標(biāo)準(zhǔn)溶液無干擾峰，且基線平穩(wěn)，“峰形對稱”，滿足分析要求，可見乙腈/水不適合作為氧化樂果液相檢測的流動(dòng)相；此外，樣品溶劑的研究結(jié)果與報(bào)道[9，21]給出的條件不同，選用乙腈[19]為溶劑時(shí)，無論如何改變液相色譜條件，乙腈的出峰條件和分離效果均不好。以水[22]為溶劑時(shí)，氧化樂果的峰形較好，基線平穩(wěn)，分離效果佳，可見，水更適合作為氧化樂果樣品的溶劑，而乙腈不適合。綜上，最終確定以Inertsil QDS-SP 4.6*250 mm為色譜柱，高效液相色譜測定氧化樂果最佳色譜條件為流動(dòng)相為甲醇/水(V/V=10/90)，溶劑為超純水，檢測波長210 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量為20 μL，總流速1.0 mL·min-1。在最佳條件下氧化樂果的高效液相色譜圖如圖1所示，此時(shí)，氧化樂果峰形和分離效果較好，色譜圖基線平穩(wěn)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限

配制氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度梯度為10.00、5.00、1.00、0.50 、0.20、0.10 μg·mL-1，按照已優(yōu)化的色譜條件對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果(圖2)顯示：氧化樂果標(biāo)準(zhǔn)品在0.10～10.00 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=13638X-578.9，R2=0.9992(>0.999)。為了進(jìn)一步考查該方法的靈敏度，經(jīng)該優(yōu)化方法上機(jī)測定，并以3倍信噪比計(jì)算出該方法測定氧化樂果的最低檢出限為0.01 μg·mL-1，表明該方法使得氧化樂果濃度與峰高在較大的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出較良好的線性相關(guān)性，符合分析精度的要求。

2.3 樣品的凈化條件的選擇

凈化條件試驗(yàn)結(jié)果見表1，其中以中性氧化鋁為固相萃取劑時(shí)，3種淋洗劑的淋洗液均未檢出氧化樂果，以弗羅里硅土為凈化材料，以丙酮和乙腈為淋洗液時(shí)淋洗效果較好，達(dá)到99%，但是以丙酮和二氯甲烷、丙酮和正己烷為淋洗液時(shí)淋洗效果不好，不足50%，因此，本試驗(yàn)采用弗羅里硅土為凈化柱，丙酮和乙腈為淋洗劑。

2.4 方法回收率及精密度

在空白土壤樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法，利用上述優(yōu)化方法進(jìn)行檢測，通過加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算驗(yàn)證該方法的精密度和準(zhǔn)確度。試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可見，2種土壤氧化樂果的加標(biāo)回收率各不相同，總體回收率在70%以上。其中，梨樹下土添加施藥量在0.5、1、5 μg·mL-1的添加回收率分別為91.2%～100.4%、83.6%～87.5%、73.0%～80.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是2.03%、4.17%、4.41%，相比較低含量農(nóng)藥添加量的土壤回收率較高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也低；萊陽褐土添加施藥量在0.5、1.0、5.0 μg·mL-1的添加回收率分別為100.2%～119.8%、95.6%～100.5%、87.8%～94.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是2.08%、3.59%、8.08%，不同土壤和不同農(nóng)藥濃度之間的回收率有些許差別，這與土壤樣品的理化性質(zhì)有關(guān)。如表3可知，梨樹土、萊陽褐土兩種土壤理化性質(zhì)差別較大，萊陽褐土有機(jī)質(zhì)含量較高，而梨樹土陽離子交換量(CEC)較高，而這2種指標(biāo)是影響土壤中有機(jī)農(nóng)藥提取的重要因素?？傮w而然，2種土壤樣品的平均回收率在70%～120%，檢測結(jié)果較為滿意。

表1 不同層析柱和不同淋洗劑對氧化樂果回收率的比較

Table 1 Comparison of different columns and eluting agents on omethoate recovery rate

凈化填料標(biāo)樣含量/(μg·mL-1)平均回收率/%123弗羅里硅土1.0314199.85中性氧化鋁1.0---

注：1,2,3分別表示淋洗液丙酮和二氯甲烷(1∶1)、丙酮和正己烷(3∶1)、丙酮和乙腈(1∶3)，

表2 土壤樣品測定的氧化樂果的重復(fù)性和回收率

表3 兩種不同土壤的理化性質(zhì)

3 結(jié) 論

本研究采用固相萃取-高效液相色譜法來檢測土壤中氧化樂果。結(jié)果表明，采用高效液相色譜法測定氧化樂果時(shí)，色譜條件為色譜柱為Inertsil QDS-SP(4.6*250 mm)，流動(dòng)相為甲醇/水(V/V)=10/90，溶劑為超純水，檢測波長為210 nm，柱溫為室溫25℃，氧化樂果進(jìn)樣量為20 μL，總流速為1.0 mL·min-1，等度洗脫；采用振蕩提取方法，以丙酮和乙酸乙酯為提取劑，以弗羅里硅土為固相萃取柱、丙酮/乙腈(1/3)的淋洗劑，對土壤中氧化樂果有較好的提取和純化效果。采樣上述條件對土壤中氧化樂果進(jìn)行測定時(shí)，樣品加標(biāo)回收率為在70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.08%～8.08%，能夠滿足土壤中氧化樂果的檢測要求。

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(責(zé)任編輯：林海清)

HPLC Determination of Omethoate Content in Soil

LI Ruo-yun1，2，ZHANG Jiao1，2*

(1.QingdaoEngineeringResearchCenterforRuralEnvironmentCollegeofResourceandEnvironment，Qingdao,Shandong266109，China；2.QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao,Shandong266109，China)

Testing conditions for the omethoate determination byHPLC were optimized to be: Inertsil QDS-SP (4.6*250 μm) at 25℃, an injection of 20μL methanol/water (V/V=10/90) as mobile phase ata flow rate of 1.0 mL·min-1, and the wave length of 210 nm for ultraviolet detection. A high recovery rate was achieved by using anextraction column with acetone/acetonitrile (V/V=1/3) as the eluting agent. A linear calibration curve for the omethoate concentrations in the range of 0.1-10μg·mL-1(R2=0.9992) with a minimal detection limit of 0.1 μg·mL-1was established. Acetone and ethyl acetate were used as the solvents in the oscillation extraction. The recovery rate of omethoate in the soil samples ranged from 70% to 120% with a relative deviation of 2.08%-8.08%, which was within the requirements for pesticide residue analysis. It appeared that the newly developed HPLC methodology was appropriate for detecting omethoate residues in soil.

HPLC; omethoate; soil; organophosphorus pesticides

2016-04-07初稿；2016-05-20修改稿

李若云(1990-)，女，碩士生，研究方向：土壤農(nóng)藥遷移轉(zhuǎn)化(E-mail：ruoyun827@qq.com)

*通訊作者：張嬌(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：污染物遷移及控制技術(shù)(E-mail：zhangjiao11@163.com)

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41301552、41201507)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)工程課程建設(shè)項(xiàng)目(XDSJP2013037)

X 592

A

1008-0384(2016)08-881-05

李若云，張嬌.高效液相色譜法檢測土壤中氧化樂果殘留[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(8)：881-885.

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