鄭雪芳，朱育菁，劉 波，葛慈斌

(福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福建 福州 350003)

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番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵過程狀態(tài)參數(shù)研究

鄭雪芳，朱育菁，劉 波*，葛慈斌

(福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福建 福州 350003)

對番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458進行培養(yǎng)條件優(yōu)化和發(fā)酵過程狀態(tài)參數(shù)研究。采用搖瓶培養(yǎng)和單因素試驗研究菌株FJAT-1458的培養(yǎng)條件，確定最適培養(yǎng)基為SPA(蛋白胨5 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO40.25 g·L-1)，最適培養(yǎng)溫度為30℃，250 mL三角瓶最適裝液量為35 mL。用50 L發(fā)酵罐發(fā)酵FJAT-1458，發(fā)酵過程中菌體數(shù)量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，F(xiàn)JAT-1458的生長可分為4個時期：0～6 h為發(fā)酵適應期、6～36 h為對數(shù)生長期、36～60 h為穩(wěn)定生長期，72 h后為消亡期。發(fā)酵過程中，菌體的致病性指標-弱化指數(shù)變化小，介于0.832～0.855，方差分析表明其差異不顯著，P>0.05；發(fā)酵液pH值從7.23上升至8.78；菌體細胞為短桿狀，大小為(1.0～1.5)μm ×(0.5～0.8)μm，隨著發(fā)酵進程，細胞顏色變深，發(fā)酵后期細胞開始變形、裂解。

番茄青枯病；青雷爾氏菌；植物疫苗；培養(yǎng)條件優(yōu)化

由致病性青枯雷爾氏菌VirulentRalstoniasolanacearum引起的番茄青枯病是一種毀滅性的土傳病害，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。該病害堪稱“植物癌癥”，一旦發(fā)病就難以控制，甚至造成生產(chǎn)絕收，嚴重制約著番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟效益的提高[2]。植株大面積枯萎死亡和番茄產(chǎn)量的嚴重下降，輕病田塊減產(chǎn)10%～30%，重病田塊減產(chǎn)50%，目前，對該病害一些防治措施包括農(nóng)業(yè)防治(如嫁接、抗病育種、土壤改良、輪作套種等)、化學防治、生物防治(如芽孢桿菌、鏈霉菌等生防菌的利用)等[3]，其中，抗病育種是防治番茄青枯病的理想途徑，但由于青枯病原菌寄生范圍廣，國內外育種家雖作大量工作，但能供生產(chǎn)上使用的抗病品種不多[4]，化學防治見效快，但污染環(huán)境且危害人類健康，因此，有必要開辟更多的防治途徑。

自1950年，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)真菌、細菌、病毒等可誘導多種植物產(chǎn)生抵抗病菌的能力。這方面的研究逐漸成為植物病理學的熱點領域，形成植物免疫學(學科代碼210.6015)。2006年《Nature》刊登了名為“The plant immune system”的文章，將植物免疫及抗病性的研究推入一個高潮[5]。植物在受到病原菌侵染時會產(chǎn)生主動抗病性，在被侵染位點產(chǎn)生過敏反應(HR)并發(fā)出系統(tǒng)性信號，進而產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)或誘導系統(tǒng)抗性(ISR)[6-7]。近年來，針對“植物免疫系統(tǒng)”如接種無毒或弱毒的活體微生物或蛋白等來激發(fā)植物免疫系統(tǒng)的防衛(wèi)反應，進而開發(fā)安全、高效、無殘留的“植物疫苗”已成為研究熱點[8]。

青枯雷爾氏菌存在嚴重的致病力分化現(xiàn)象[9-11]，可分化出強致病力、無致病力和過渡型菌株，研究發(fā)現(xiàn)無致病力菌株對番茄、茄子等茄科作物具有免疫抗病的功能，即在作物苗期預先接種無致病力菌株，菌株就會侵入植株體內，并隨著植株的生長在體內繁殖增長，通過生長競爭阻礙病原菌的侵入，同時能誘導植株產(chǎn)生抗病反應，如防御酶活性的提高、抗病化合物的產(chǎn)生、防衛(wèi)相關基因表達量的增加等，從而使植物免遭病害或減輕病害[12]。在前期研究中，我們構建青枯雷爾氏菌無致病力突變菌株庫，從中篩選到1株生物學特性穩(wěn)定，對番茄青枯病防效好的菌株FJAT-1458[13]，盆栽試驗防效可達100%，田間試驗表明其對番茄青枯病防效達75%以上，擬利用該菌株研發(fā)青枯病植物疫苗。

生防菌制劑的規(guī)?；a(chǎn)與應用，發(fā)酵技術是關鍵。為實現(xiàn)青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458在今后生產(chǎn)應用上的高效表達，降低能量和物料消耗，有必要對其發(fā)酵條件及發(fā)酵過程各參數(shù)進行檢測。本研究主要通過對菌株FJAT-1458發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)溫度及通氣量的選擇，確定其最佳發(fā)酵條件，通過對菌株FJAT-1458發(fā)酵過程的狀態(tài)參數(shù)pH值、菌體濃度和菌株弱化指數(shù)進行跟蹤研究，了解該菌株的發(fā)酵變化規(guī)律，為提高發(fā)酵質量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株FJAT-1458，分離自番茄青枯病田塊的健康植株，由福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫保存。青枯雷爾氏菌固體培養(yǎng)基為TTC[14]：蛋白胨10 g，酪朊水解物1 g，葡萄糖5 g，瓊脂17 g，1 000 mL蒸餾水，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min，滅菌后冷卻至55℃左右加入已滅菌的1%的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)水溶液，其終濃度為0.005%。發(fā)酵培養(yǎng)基SPA：蛋白胨5 g，蔗糖20 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.25 g，1 000 mL蒸餾水，pH7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基NA：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，1 000 mL蒸餾水，pH 7.0～7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，1 000 mL蒸餾水，pH 7.0～7.2。

1.2 菌株FJAT-1458培養(yǎng)液的制備

將菌株FJAT-1458活化于TTC培養(yǎng)基平板上，在30℃條件下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于裝有35 mL SPA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于30℃，170 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液，系列梯度稀釋后涂布TTC平板，計算活菌體數(shù)。

1.3 菌株FJAT-1458發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定

將上述制備的FJAT-1458培養(yǎng)液按1%的接種量(1)分別接種至SPA、NA和LB 3種培養(yǎng)基，3個重復，30℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液；(2)接種至裝有35 mL SPA培養(yǎng)基，分別置20、25、30、35和40℃，3個重復，170 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液；(3)接種至裝有15、25、35、45、55 mL SPA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，3個重復，30℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液。將收集的不同處理的培養(yǎng)液，系列梯度稀釋后涂布TTC平板，計算菌株FJAT-1458的活菌數(shù)。

1.4 菌株FJAT-1458發(fā)酵過程狀態(tài)參數(shù)的變化

1.4.1 菌株的發(fā)酵及樣本采集 將菌株FJAT-1458的培養(yǎng)液按1%接菌量接種至裝有40 L SPA培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中進行大容量發(fā)酵，控制發(fā)酵罐攪拌器轉速為200 r·min-1、溫度(30±1)℃。每隔12 h取樣，檢測發(fā)酵液各狀態(tài)參數(shù)。

1.4.2 菌體濃度檢測 各樣本經(jīng)系列梯度稀釋后涂布TTC平板，計算活菌數(shù)。

1.4.3 弱化指數(shù)測定 采用劉波等的方法[15]測定菌株FJAT-1458在不同發(fā)酵時間的弱化指數(shù)，分析其在發(fā)酵過程致病力的變化。具體方法如下：隨機選取FJAT-1458在TTC平板上的10個單菌落，在Leica M165FC電動熒光體視顯微鏡測量并計算弱化指數(shù)，取平均值。弱化指數(shù)(Attenuation index， AI)=菌落的紅斑直徑與菌落直徑的比值，弱化指數(shù)小于0.65為強致病力菌株，弱化指數(shù)大于0.75為無致病力菌株，弱化指數(shù)0.65～0.75為過渡型菌株。

1.4.4 發(fā)酵液pH值測定 取20 mL發(fā)酵液，進行pH值檢測，重復3次，取平均值。pH值測定儀為Starter 3C奧豪斯儀器有限公司生產(chǎn)。

1.4.5 電鏡樣品制備 收集菌株FJAT-1458在不同時間(6、24、48、72 h)的發(fā)酵液樣本，取2～5 μL樣本至銅網(wǎng)，靜置2 min，濾紙吸干，滴適量2%磷鎢酸染色30 s，自然晾干，于HT7700透射電鏡下觀察菌體形態(tài)并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計分析，并利用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 菌株FJAT-1458發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定

(1)培養(yǎng)基的確定：菌株FJAT-1458在SPA培養(yǎng)基中的生長最好，30℃、170 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h的菌濃度為1.56×108cfu·mL-1，在LB培養(yǎng)基中的生長量與SPA培養(yǎng)基相當，為1.39×108cfu·mL-1，差異不顯著，在NA培養(yǎng)基中的生長最差，菌濃度為0.93×108cfu·mL-1，與其在SPA和LB培養(yǎng)基中生長量差異達顯著水平(表1)。確定菌株FJAT-1458的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為SPA培養(yǎng)基。

(2)培養(yǎng)溫度的確定：菌株FJAT-1458的生長溫度為20～35℃，最適生長溫度為30℃，該溫度下，菌株生長量最大，達1.77×108cfu·mL-1，溫度超過40℃時，菌株不能生長(表1)。因此，確定菌株FJAT-1458的最適培養(yǎng)溫度為30℃。

(3)裝液量的確定：結果見表1。菌株FJAT-1458在不同裝液量的SPA培養(yǎng)基中，長勢相當，差異不顯著。在250 mL三角瓶中裝液量35 mL時，菌株FJAT-1458的菌體濃度略高于其他裝液量?？稍诰闒JAT-1458發(fā)酵培養(yǎng)時選用此種裝液量。

表1 植物疫苗菌株FJAT-1458在不同培養(yǎng)條件下的生長量

Table 1 Growth of avirulent strain, FJAT-1458, under varied culture conditions

測定項目FJAT-1458菌體濃度/(×108cfu·mL-1)培養(yǎng)基SPA1.56±0.12aNA0.93±0.05cLB1.39±0.11a溫度20℃1.14±0.06bc25℃1.27±0.12b30℃1.77±0.10a35℃0.91±0.06c40℃0裝液量15mL1.82±0.07a25mL1.75±0.07a35mL1.87±0.11a45mL1.77±0.04a55mL1.71±0.06a

注：同例不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。表2同。

2.2 菌株FJAT-1458發(fā)酵過程狀態(tài)參數(shù)的變化

菌株FJAT-1458發(fā)酵過程各狀態(tài)參數(shù)發(fā)生一定的變化，試驗結果見表2。菌體數(shù)量呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，0～6 h菌體濃度變化不大，為發(fā)酵適應期；6～36 h菌株FJAT-1458進入對數(shù)生長階段，菌體濃度由6 h的1.37×108cfu·mL-1增至36 h的12.48×108cfu·mL-1，36～60 h菌株FJAT-1458進入穩(wěn)定生長期，72 h后，菌體數(shù)量明顯下降，為消亡期。菌株FJAT-1458在發(fā)酵過程中弱化指數(shù)無明顯變化，其值為0.832～0.855，均大于0.8，為無致病力菌株。菌株FJAT-1458在發(fā)酵過程，發(fā)酵液pH值變化值從7.23的中性環(huán)境上升至8.78的弱堿性，可能與發(fā)酵過程分泌一些代謝物有關。

表2 植物疫苗菌株FJAT-1458發(fā)酵過程各參數(shù)變化

Table 2 Changes on parameters during fermentationprocess of avirulent strain, FJAT-1458

時間/hFJAT-1458菌體濃度/(×108cfu·mL-1)菌株弱化指數(shù)pH值01.12±0.07a0.84±0.03a7.23±0.01h61.37±0.15a0.84±0.01a7.51±0.01g123.05±1.56b0.84±0.03a8.27±0.01f249.37±1.02c0.85±0.01a8.53±0.03d3612.48±2.55d0.85±0.01a8.38±0.02e4811.72±1.82e0.85±0.01a8.72±0.01b6011.05±1.22f0.85±0.02a8.67±0.01c728.32±0.43g0.83±0.03a8.78±0.03a

2.3 菌株FJAT-1458發(fā)酵過程菌體形態(tài)的變化

利用透射電鏡觀察菌株FJAT-1458在發(fā)酵過程菌體細胞形態(tài)的變化。菌株FJAT-1458細胞為短桿狀，菌體大小為(1.0～1.5)μm ×(0.5～0.8)μm。發(fā)酵適應期，菌體細胞顏色較淺，細胞膜完整，細胞邊緣呈透明狀(圖1-A)；對數(shù)生長期觀察到細胞分裂現(xiàn)象，細胞顏色加深，邊緣呈透明狀(圖1-B)；發(fā)酵穩(wěn)定期，觀察到細胞已分裂兩個獨立的細胞(圖1-C)；消亡期，部分細胞開始變形、裂解(圖1-D)。

3 討論與結論

植物疫苗防治作物青枯病具有安全無毒、無農(nóng)殘、對環(huán)境友好等特點，是今后生物農(nóng)藥發(fā)展的方向，前景廣闊[8]。植物疫苗的推廣應用必須建立在其工業(yè)化生產(chǎn)上，而工業(yè)化生產(chǎn)中降低成本是商家追求的最終目標，因此植物疫苗工業(yè)化生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)之一就是植物疫苗生產(chǎn)工藝和制備工藝研究[16]。菌株的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化試驗是走向中試及工業(yè)化生產(chǎn)的必要步驟，本研究對植物疫苗菌株FJAT-1458的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行研究，結果發(fā)現(xiàn)， FJAT-1458在LB、SPA和NA培養(yǎng)基上均能生長，最適培養(yǎng)基為SPA，生長的溫度范圍為20～35℃，最適培養(yǎng)溫度為30℃，通氣量對其發(fā)酵效果影響不明顯。有關生防細菌的培養(yǎng)條件研究有不少文獻報道[17-19]，本研究中植物疫苗菌株FJAT-1458的培養(yǎng)條件與其他生防細菌的培養(yǎng)條件不同，如周青等[17]報道青枯病和根腫病生防細菌解淀粉芽胞桿菌ZBS2004最適培養(yǎng)基為NA，最適培養(yǎng)溫度為35℃；馬耀華等[18]報道石榴干腐病生防細菌解淀粉芽胞桿菌Z2的優(yōu)化培養(yǎng)條件為溫度27℃和LB培養(yǎng)基。說明不同種屬甚至同種不同生境來源的細菌最優(yōu)培養(yǎng)條件不同。菌株FJAT-1458培養(yǎng)條件的研究為該菌株的產(chǎn)業(yè)化和大田應用奠定基礎。

微生物生長一般經(jīng)歷4個時期：適應期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和消亡期。車建美等[20]對青枯雷爾氏菌強致病力菌株FJAT-91的生長曲線測定結果顯示，菌株FJAT-91的對數(shù)生長期為5～15 h，之后進入穩(wěn)定生長期。陳燕萍等[16]研究Tn-5轉座子插入致弱菌株T8發(fā)酵過程菌株的生長周期，發(fā)現(xiàn)0～16 h為發(fā)酵適應期，對數(shù)生長期為24～32 h。本研究對植物疫苗菌株FJAT-1458發(fā)酵過程中生長周期的測定結果與陳燕萍等[16]相吻合，說明不同致病力的青枯雷爾氏菌生長速度不同，強致病力菌株較弱/無致病力菌株生長速度快，更早進入穩(wěn)定生長期，因此，利用無致病力青枯雷爾氏菌研發(fā)植物疫苗防治作物青枯病時應該提早接種，最好在育苗時接種，使植株預先產(chǎn)生免疫抗病力，抵御病原菌侵染。

在自然條件下，青枯雷爾氏菌易發(fā)生致病力分化，傳統(tǒng)對青枯雷爾氏菌的致病力測定采用接種盆栽苗的生物測定法，這種方法不但耗時而且不靈敏[21]。劉波等[12]建立了弱化指數(shù)作為青枯雷爾氏菌致病力的量化指標，將分離獲得的青枯雷爾氏菌分為3個類型：無致病力菌株(AI>0.75)、過渡型菌株(AI=0.65～0.75)和致病性菌株(AI<0.65)[15]。本研究測定了菌株FJAT-1458在不同發(fā)酵時期的弱化指數(shù)，結果表明，菌株FJAT-1458在發(fā)酵過程弱化指數(shù)變化小，介于0.832～0.855，從生物學特性可視為變化無差異。

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(責任編輯：黃愛萍)

Optimization of Culture Conditionsand Analysis of Fermentation Process for Plant Vaccine-producing Bacterium, FJAT-1458

ZHENG Xue-fang, ZHU Yu-jing, LIU Bo, GE Ci-bin

(AgriculturalBio-resourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003,China)

Conditions to culture FJAT-1458,a bacterium that produces plant vaccine against the tomato bacterial wilt caused byRalstoniasolanacearum, were optimized by asingle factor experiment. They were determined to be the use of an SPA medium containing peptone 5 g·L-1,sugar 20 g·L-1, KH2PO40.5 g·L-1, and MgSO40.25 g·L-1at 30℃ with 35 mL of broth in a 250 mL shaking flask. Subsequently, in a 50 L fermentation tank, the fermentation was carried out and the process monitored. During the fermentation, the cell count on FJAT-1458 increased initially and followed by a gradual decline with a 4-stage growth period that included the adaptive (0-6 h), logarithmic (6-36 h), stationary (36-60 h), and decline phases (after 72 h). In addition, it was observed that(a) the pathogenicity indicator, attenuation index, of FJAT-1458 ranged from 0.832 to 0.855 showing no significant difference (P>0.05) throughout the entire process; (b) the pH of the fermentation broth increased from 7.23 to 8.78; (c) morphologically, the bacteria appeared to be(1.0-1.5)μm×(0.5-0.8)μm rods with a darkening color as the process proceeded; (d) the cellular secretion from the bacteria increased with time; and, (e) some of the bacterial cells deformed and lysed near the end of fermentation.

tomato bacterial wilt;Ralstoniasolanacearum; plant vaccine; culture condition optimization

2016-03-29初稿；2016-05-25修改稿

鄭雪芳(1977-)，女，副研究員，博士，主要從事植物病害生物防治的研究(E-mail:zhengxuefangfz@163.com)

*通訊作者：劉波(1957-)，男，博士，研究員，主要從事生物技術和生物農(nóng)藥的研究(E-mail：liubofaas@163.com)

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303015)；福建省自然科學基金項目(2015J01103)；福建省科技計劃項目——省屬公益類科研院所基本科研專項(2014R1018-8)

S 436

A

1008-0384(2016)08-858-05

鄭雪芳，朱育菁，劉波，等.番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458的培養(yǎng)條件優(yōu)化及發(fā)酵過程狀態(tài)參數(shù)研究[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2016，31(8)：858-862.

ZHENG X-F，ZHU Y-J，LIU B，et al.Optimization of Culture Conditionsand Analysis of Fermentation Process for Plant Vaccine-producing Bacterium, FJAT-1458[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：858-862.