曹奕鴦， 江金蘭，李永清，雷伏貴，葉 煒

(福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所，福建 沙縣 365051)

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基于葉綠體DNA rps16序列的福建泰寧野生鐵皮石斛多樣性分析

曹奕鴦， 江金蘭，李永清，雷伏貴，葉 煒*

(福建省三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所，福建 沙縣 365051)

為了解福建泰寧野生鐵皮石斛種源的多樣性，對75份泰寧野生鐵皮石斛及其他石斛屬藥用植物葉綠體DNArps16序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：75份石斛屬藥用植物種間平均遺傳距離為0.006 6，泰寧野生鐵皮石斛種內(nèi)平均遺傳距離為0.00 06。38份泰寧野生鐵皮石斛葉綠體DNArps16序列比對后，共得到5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)占總數(shù)的25%，種內(nèi)基于K-2P遺傳距離最大為0.003 4，表明泰寧野生鐵皮石斛葉綠體DNArps16序列變異較大，多樣性較高。此外，在泰寧野生鐵皮石斛的5種rps16核苷酸序列中，T2型、T65型、D5型為參比鐵皮石斛種質(zhì)中的獨(dú)有類型。

鐵皮石斛；葉綠體DNA；rps16序列

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale是蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是重要的傳統(tǒng)名貴藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效[1]，主要分布于我國安徽、浙江、福建、廣西、四川、云南等地[2]。福建省是鐵皮石斛的原產(chǎn)地之一，野生資源豐富，目前已在縱跨境內(nèi)的武夷山脈多處發(fā)現(xiàn)野生的鐵皮石斛資源，泰寧位于武夷山脈中段的杉嶺支脈東南側(cè)，海拔落差大，境內(nèi)大面積的丹霞地貌以丘陵及山地形式分布，蘊(yùn)藏著豐富的野生鐵皮石斛群落[3]。此前，本課題組通過對泰寧及其他來源地鐵皮石斛的親緣關(guān)系的ISSR分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)泰寧野生鐵皮石斛具有較豐富的多樣性和較高的種群分化系數(shù)，且可能與其他來源地的鐵皮石斛存在基因交流[3-5]。由于鐵皮石斛可在種內(nèi)和種間雜交[6]，細(xì)胞核染色體基因組易發(fā)生重組，增加了利用細(xì)胞核染色體DNA分子標(biāo)記技術(shù)分析鐵皮石斛多樣性原因的復(fù)雜性，因此，尋找更合適的方式研究泰寧野生鐵皮石斛多樣性的程度與原因具有重要意義。

葉綠體DNA作為獨(dú)立的遺傳單位，進(jìn)化過程中不經(jīng)歷重組，受到的選擇壓力小，能直接反映植物在長期進(jìn)化過程中積累的遺傳變異[7]，葉綠體DNArps16序列為基因間區(qū)(intergenic spacer)或內(nèi)含子(intron)非編碼區(qū)，進(jìn)化速率較快，已經(jīng)用于桑樹、桑屬、枇杷、浮萍、肉蓯蓉屬、中國櫻桃等系統(tǒng)進(jìn)化、親緣關(guān)系分析[8-13]，已有利用葉綠體DNAmatK、rbcL、psbK-psbI、psbA-trnH序列用于鐵皮石斛種間和種內(nèi)變異研究[14-17]，但利用葉綠體DNArps16序列分析福建泰寧野生鐵皮石斛種內(nèi)遺傳距離及遺傳多樣性等還未見報(bào)道。

本研究利用葉綠體DNArps16序列，對泰寧野生鐵皮石斛進(jìn)行多樣性分析，旨在研究其遺傳多樣性及變異情況，揭示泰寧野生鐵皮石斛群落內(nèi)部以及與其他來源地鐵皮石斛的遺傳相似性和復(fù)雜性，為制定相應(yīng)的保護(hù)策略及探討泰寧野生鐵皮石斛的起源和進(jìn)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

收集包括38份福建泰寧野生鐵皮石斛種質(zhì)在內(nèi)的鐵皮石斛種質(zhì)46份(表1)，其中1～19號泰寧野生鐵皮石斛種質(zhì)由泰寧紅石山生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供(從158份泰寧野生鐵皮石斛單株經(jīng)ISSR親緣關(guān)系分析劃分的4個(gè)類群中選出[18])，20～38號泰寧野生鐵皮石斛種質(zhì)分別采集自泰寧杉城鎮(zhèn)江家坊、杉城鎮(zhèn)洋川、寨下大峽谷、朱口鎮(zhèn)、梅口鄉(xiāng)，39～46號栽培種鐵皮石斛種質(zhì)收集自云南文山、云南玉溪、福建連城、福建武夷山、江西龍虎山、廣西容縣、浙江天目山，所有材料均保存于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)室及種質(zhì)資源圃，所測定的rps16序列均已在GenBank注冊(登錄號見表1)。

此外，從GenBank上下載包括4份鐵皮石斛種質(zhì)在內(nèi)的29份石斛屬植物葉綠體DNArps16序列，與上述 46份石斛種質(zhì)一起，進(jìn)行rps16序列分析，編號47～75(表2)。

1.2 主要試劑

Taq酶和Marker購自上海寶生物工程有限公司，引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司，膠回收試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA 的提取 采用改良CTAB法提取鐵皮石斛葉片基因組總DNA[4]。

表1 46份泰寧和不同地區(qū)鐵皮石斛種質(zhì)及來源

Table 1 Orgins of 46D.officinaleisolates from Taining and other areas

表2 已在 GenBank中登錄的石斛屬rps16序列Table 2 rps16 sequences of Dendrobium species listed at Genbank

1.3.2 PCR擴(kuò)增及序列測定 PCR引物序列依據(jù)Jing Luo等[19]所述，分別為rps16F(5′-GGT GTA GAT ATG ATC GAA AT-3′)和rps16R(5′-CCG ATA AAG AAT CAA ACT TA-3′)擴(kuò)增反應(yīng)在20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行[4]，包含ddH2O 9 μL，2×TaqMasterMix 9 μL，引物1 μL，模板DNA 1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，51～62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色，割取目的條帶，用GeneJET膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物送至深圳華大基因研究院測序(單鏈正向測序)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用MEGA6.06軟件，對測序序列進(jìn)行比對，參考測序圖，去除前端21 bp堿基和末端279 bp序列，保留599 bp進(jìn)行序列特征分析，利用K-2P(Kimura 2-parameter)模型計(jì)算鐵皮石斛種內(nèi)遺傳距離，通過1 000次重復(fù)的自展程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)誤的檢測，采用鄰接法NJ(Neighbor-Joining)構(gòu)建基于K-2P距離的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建泰寧野生鐵皮石斛葉綠體DNArps16序列特征分析

通過對50份鐵皮石斛(包括GenBank上已登錄的4份鐵皮石斛)rps16序列比對分析(表3)，共得到20個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中38份泰寧野生鐵皮石斛共得到5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(分別在1、29、38、41、136 bp處)，多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)占總數(shù)的25%，包括1、29 bp處單個(gè)堿基的缺失、41 bp處單個(gè)堿基的插入及38、136 bp處單個(gè)堿基的顛換。泰寧野生鐵皮石斛共包含5種類型的rps16核苷酸序列，具有與T1相同核苷酸序列的包括T4、T45、T54、T109、T117、T136、T151、T153、T199、B2、B3、B4、B5、B6、C、D3、D4、F1、F2共20份種質(zhì)；具有與T2相同核苷酸序列的包括T42、T64、T73、T108、T144、T164、B1共8份種質(zhì)；具有與T65相同核苷酸序列的僅有T156和D1共3份種質(zhì)；與 A1相同核苷酸序列的有A2、A3、A4、A5、A6共6份種質(zhì)；以及D5種質(zhì)。與來自福建泰寧的T1型rps16核苷酸序列一致的鐵皮石斛種質(zhì)還包括H(云南玉溪)、I(連城冠豸山)、O(廣西容縣)、P1(浙江天目山)、P2(浙江天目山)、DC1和DC4；與來自福建泰寧的A1型rps16核苷酸序列一致的鐵皮石斛種質(zhì)還包括N(江西龍虎山)，泰寧野生鐵皮石斛T2型、T65型、D5型的rps16核苷酸序列為參比鐵皮石斛種質(zhì)中的獨(dú)有類型。

2.2 福建泰寧野生鐵皮石斛種內(nèi)的遺傳距離分析

應(yīng)用MEGA6.06軟件，基于K-2P距離模型計(jì)算鐵皮石斛種內(nèi)的遺傳距離，結(jié)果(表4)表明：來源于福建泰寧的38份野生鐵皮石斛種內(nèi)遺傳距離變化范圍為0～0.003 4，平均遺傳距離為0.000 6，以來源于泰寧杉城鎮(zhèn)江家坊的A1～A6號鐵皮石斛與來源于泰寧朱口鎮(zhèn)蛤蟆巖的D5號鐵皮石斛間遺傳距離為最大，遺傳距離為0.003 4，而50份不同來源鐵皮石斛種內(nèi)遺傳距離變化范圍為0～0.018 9，平均遺傳距離為0.001 3，種內(nèi)最大遺傳距離發(fā)生在來源于云南文山(G)的鐵皮石斛與泰寧杉城鎮(zhèn)江家坊(A1～A6)、泰寧朱口鎮(zhèn)蛤蟆巖(D5)、江西龍虎山(N)、DC2號、DC3號鐵皮石斛之間。

表3 泰寧野生鐵皮石斛葉綠體DNA rps16序列比對后的差異位點(diǎn)

注：圓點(diǎn)表示該位點(diǎn)核苷酸同T1鐵皮石斛種質(zhì)；-代表缺失。T1型表示與T1鐵皮石斛種質(zhì)具有相同的核苷酸序列的編號T開頭的泰寧野生類型(包括T1、T4、T45、T54、T109、T117、T136、T151、T153、T199)下同，T2型(包括T2、T42、T64、T73、T108、T144、T164)，T65型(包括T65、T156)

表4 基于K-2P模型構(gòu)建的鐵皮石斛種內(nèi)的遺傳距離

2.3 基于葉綠體DNArps16序列構(gòu)建的石斛屬植物系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

葉綠體DNArps16序列基于K-2P遺傳距離構(gòu)建的石斛屬藥用植物的NJ聚類分析(圖1)表明，不同石斛屬藥用植物首先分為2支，其中1支由尖刀唇石斛D.heterocarpumKJ672769.1、 疏花石斛D.henryiKJ672767.1組成，表明二者之間遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近(支持率78%)，并與其他石斛屬藥用植物間遺傳距離較大，另外1支由單獨(dú)聚為1支的鉤狀石斛D.aduncumKJ672761.1和其他石斛屬藥用植物組成。除DC2號D.catenatumKJ672782.1、DC3號D.catenatumKJ672781.1鐵皮石斛外，其余鐵皮石斛種質(zhì)均位于進(jìn)化樹的末端。此外黃石斛D.tosaenseKJ672788.1、 黃石斛D.tosaenseKJ672787.1與T1型、T2型、T65型鐵皮石斛種質(zhì)聚在1支，表明它們之間遺傳距離較小，葉綠體DNArps16序列差異較小，親緣關(guān)系較近。

3 討 論

葉綠體DNA作為獨(dú)立的遺傳單位，進(jìn)化過程中不經(jīng)歷重組，受到的選擇壓力小，能直接反映植物在長期進(jìn)化過程中積累的遺傳變異[7]，而葉綠體基因組編碼區(qū)與非編碼區(qū)序列進(jìn)化速率相差較大，適合不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究[20]。鐵皮石斛葉綠體DNA種間變異研究屬較低分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究，有文獻(xiàn)表明，鐵皮石斛葉綠體DNAmatK基因在4個(gè)不同居群間遺傳距離均較小，為0.001[16]、鐵皮石斛葉綠體DNArbcL基因序列在6地間遺傳距離均為0[17]、葉綠體DNApsbK-psbI序列在4個(gè)鐵皮石斛種內(nèi)均無變異位點(diǎn)[14]、鐵皮石斛葉綠體DNApsbA-trnH基因間隔區(qū)序列在6個(gè)不同居群間沒有變異位點(diǎn)[15]，而本研究的結(jié)果表明，葉綠體DNArps16序列在50份不同來源的鐵皮石斛種內(nèi)遺傳距離最大達(dá)0.018 9，總共存在20個(gè)變異位點(diǎn)的差別，這與Luo等[19]研究結(jié)果，包括鐵皮石斛在內(nèi)的6種蘭科植物葉綠體DNA序列中，rps16序列進(jìn)化速率較快的結(jié)果相一致。本研究初步表明不同來源鐵皮石斛葉綠體DNArps16序列間遺傳距離較大，變異位點(diǎn)較多，因此，葉綠體DNArps16序列可作為研究鐵皮石斛種內(nèi)變異的DNA條形碼序列之一。

中國植物志記載福建分布的石斛屬植物有劍葉石斛D.acinaciforme、細(xì)莖石斛D.moniliforme、鐵皮石斛和廣東石斛D.wilsonii，石斛屬藥用植物種類較相鄰的省份廣東、江西、浙江更為豐富[2]。福建是野生鐵皮石斛的原產(chǎn)地之一，本課題組在泰寧的杉城鎮(zhèn)江家坊、杉城鎮(zhèn)洋川、寨下大峽谷、朱口鎮(zhèn)蛤蟆巖、梅口鄉(xiāng)野趣源等多地發(fā)現(xiàn)野生鐵皮石斛群落，且在葉型、葉色、莖色等性狀上與現(xiàn)有栽培種呈現(xiàn)豐富的多樣性[4]，通過ISSR標(biāo)記進(jìn)一步的分析表明泰寧野生鐵皮石斛具有較豐富的多樣性和較高的種群分化系數(shù)[3]。在本研究中，泰寧野生鐵皮石斛不同群落中共產(chǎn)生5種類型的葉綠體DNArps16核苷酸序列，呈現(xiàn)較為豐富的細(xì)胞質(zhì)葉綠體基因組核苷酸序列的多樣性，其中T2型、T65型、D5型這3種類型為參比鐵皮石斛種質(zhì)中的獨(dú)有類型，表明泰寧鐵皮石斛種群內(nèi)產(chǎn)生新的葉綠體基因組核苷酸序列堿基突變類型，而堿基突變在形成生物個(gè)體多樣性中起重要作用[21]，因此泰寧是福建及周邊地區(qū)野生鐵皮石斛的起源中心之一。

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(責(zé)任編輯：林海清)

Diversity Analysis Based on Chloroplast DNArps16 Sequence for WildDendrobiumofficinalefrom Taining, Fujian

CAO Yi-yang，JIANG Jin-lan，LI Yong-qing，LEI Fu-gui，YE Wei*

(InstituteofMedicinalPlants,SanmingAcademyofAgriculturalScience,Shaxian，F(xiàn)ujian365051，China)

A diversity analysis based upon therps16 sequence of chloroplast DNA for the wildDendrobiumofficinalefound in Taining, Fujian and other areas was conducted. The results indicated an average genetic distance among 75 species ofDendrobiumto be 0.006 6, and 0.000 6 for those from Taining. There were 5 polymorphic sites (i.e., 25% of the total) detected in the 38 wildD.officinalefrom Taining. The maximal genetic distance calculated by K-2P was 0.003 4, indicating significant sequence variations and high diversities among the Taining species.In addition, among the 5 different types ofrps16 sequence,T2, T65, and D5 were found only inD.officinalecollected from Taining.

Dendrobiumofficinale; chloropast DNA;rps16 sequence

2016-04-05初稿；2016-05-12修改稿

曹奕鴦(1984-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：藥用植物資源與利用(E-mail：caoyiyang@yeah.net)

*通訊作者：葉煒(1980-)，男，博士，副研究員，研究方向：園藝植物生物技術(shù)(E-mail：yewei922@qq.com)

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2014GA720032)；福建省種業(yè)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化工程項(xiàng)目(FJZZZX-1540)；福建省三明市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-N-3)

S 567

A

1008-0384(2016)08-833-06

曹奕鴦， 江金蘭，李永清，等.基于葉綠體DNArps16序列的福建泰寧野生鐵皮石斛多樣性分析[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2016，31(8)：833-838.

CAO Y-Y，JIANG J-L，LI Y-Q，et al.Diversity Analysis Based on Chloroplast DNArps16 Sequence for WildDendrobiumofficinalefrom Taining, Fujian[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(8)：833-838.