， ， ， (四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610064)

利用野生甘藍(lán)抗性遺傳資源獲得高抗菌核病甘藍(lán)型油菜的抗性與分子標(biāo)記初步分析

王浩杰，牛顯飛，宋驗(yàn)紅，王茂林
(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 成都 610064)

菌核病是甘藍(lán)型油菜最嚴(yán)重的病害之一，自身抗性低，而甘藍(lán)野生資源中存在高抗遺傳資源。以部分抗性的甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)和高抗性的甘藍(lán)野生資源為親本雜交得到F1(ACC)，F(xiàn)1連續(xù)用中雙9號(hào)回交6代，得到育性基本恢復(fù)正常植株自交，培育成了高抗菌核病材料，命名為F 6。染色體計(jì)數(shù)顯示，F(xiàn) 6有38條染色體，和甘藍(lán)型油菜(AACC，2 n=38)一致。菌核病抗性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明F 6對(duì)菌核病的抗性高于中雙9號(hào)而弱于甘藍(lán)。通過(guò)在親本和子代間比較229個(gè)分布于甘藍(lán)型油菜19個(gè)遺傳連鎖群的SSR分子標(biāo)記以及16個(gè)與甘藍(lán)抗菌核病特異性位點(diǎn)有關(guān)的SSR分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)抗菌核病主要特異性區(qū)段9號(hào)連鎖群已滲入甘藍(lán)型油菜基因組中。

甘藍(lán)； 甘藍(lán)型油菜； 菌核??； SSR標(biāo)記

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)(AACC，2 n=38)是由蕓薹(BrassicarapaL.)(AA，2 n=20)與甘藍(lán)(Brassicaoleracea)(CC，2 n=18)通過(guò)自然種間雜交后雙二倍化進(jìn)化而來(lái)的一個(gè)復(fù)合種，是僅次于大豆的世界第二油料作物[1]。核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)是一種非宿主特異性的寄生真菌，可以感染400多種植物并且造成感染部位的腐爛，其中宿主包括一些重要的農(nóng)作物，例如油菜、大豆等[2]。菌核病可造成巨大的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失[3]，甘藍(lán)型油菜一直以來(lái)受到核盤(pán)菌的嚴(yán)重危害，在中國(guó)每年核盤(pán)菌導(dǎo)致油菜減產(chǎn)達(dá)10%到80%[4]。因?yàn)楦仕{(lán)型油菜對(duì)核盤(pán)菌高度敏感，目前只有少數(shù)部分抗性品種，如中雙9號(hào)，但是沒(méi)有完全抗性或高抗性的品種[5]。盡管目前市場(chǎng)上有幾種殺真菌劑可以用來(lái)預(yù)防和治愈菌核病，但這種藥物的有效性高度依賴于使用的時(shí)間、植物的生長(zhǎng)時(shí)期和環(huán)境，并且化學(xué)藥物會(huì)造成環(huán)境污染以及高成本[6-7]。因此，培育自身對(duì)菌核病具有高抗性的新型甘藍(lán)型油菜是一種環(huán)保、高效、低成本的對(duì)抗核盤(pán)菌為害的方法。

圖1 F 6中期染色體

雖然甘藍(lán)型油菜中沒(méi)有高抗品種，但油菜的近緣物種甘藍(lán)中存在高抗性的資源[4]，可以通過(guò)甘藍(lán)型油菜與甘藍(lán)雜交從而將后者的高抗性基因轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中[8]。本實(shí)驗(yàn)以部分抗性的甘藍(lán)型油菜中雙九號(hào)和一種高抗性野生甘藍(lán)為親本，通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交培育出具有更高抗性的甘藍(lán)型油菜育種新資源。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

以具有菌核病部分抗性的甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)(簡(jiǎn)稱ZS 09)為母本和高抗性野生甘藍(lán)Olera 2(從瑞典Uppsala 遺傳中心引進(jìn)，簡(jiǎn)稱O)為父本雜交獲得少許子代F1，F(xiàn)1表現(xiàn)雄性不育，再以F1植株為母本用ZS 09為回交父本連續(xù)回交6代，得到1株有花粉的植株，可自交結(jié)實(shí)，自交獲得遺傳性狀穩(wěn)定的品系，命名為F 6。2年田間自然觀測(cè)及人工接種鑒定均表現(xiàn)為高抗菌核病。

1.1.2 核盤(pán)菌

核盤(pán)菌購(gòu)買(mǎi)自北京豫鼎鑫捷科技有限公司，PDA培養(yǎng)基22 ℃接種4～5 d，待培養(yǎng)基表面布滿白色菌絲后，用9 mm打孔器打孔，獲取PDA菌絲塊。

1.2 方 法

1.2.1 提取DNA

提取DNA用的是天根Plant Genomic DNA Kit試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取的DNA保存在4 ℃冰箱。

1.2.2 染色體計(jì)數(shù)

參照蘭澤蘧等[9]的方法：發(fā)芽的油菜根部達(dá)到15 cm左右后剪下，0.2%秋水仙素處理4 h后用蒸餾水沖洗干凈，卡諾氏固定液4 ℃固定24 h再用蒸餾水沖洗干凈，分別在95%、85%的乙醇中放置30 min，轉(zhuǎn)到70%乙醇4 ℃保存。 將保存的材料洗滌后轉(zhuǎn)入1 mol/L HCl中，60 ℃解離10 min左右，蒸餾水沖洗干凈，用卡寶品紅染液染色10～15 min，壓片后放在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 SSR分析

實(shí)驗(yàn)所用的SSR(simple sequence repeat，微衛(wèi)星DNA)標(biāo)記中有229個(gè)是由Piquemal等[10]所開(kāi)發(fā)，這些引物均勻地分布在甘藍(lán)型油菜的19個(gè)連鎖群上；另有16個(gè)是從Mei et al[11]中篩選的甘藍(lán)抗菌核病特異性位點(diǎn)SSR標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)步驟參照史慧娟等[12]的方法：PCR加樣體系和反應(yīng)體系不變，擴(kuò)增產(chǎn)物用10%非變性PAGE凝膠電泳分離，0.2% AgNO3染色，顯色后照相并保存。

1.2.4 葉片菌核病抗性鑒定

實(shí)驗(yàn)參照王漢中等[5]的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，待樣品植株成長(zhǎng)到10葉期左右，采摘新鮮葉片放入墊有濕毛巾和濾紙的白瓷盤(pán)，每組5片葉，葉柄用濕紗布包裹。核盤(pán)菌PDA菌絲塊倒置接種于葉片表面。接種后用透明保鮮膜密封，保持空氣濕度大于80%，于22 ℃下接種4 d后記錄菌斑面積，計(jì)算公式為：面積 = (長(zhǎng)軸 × 短軸)π/4。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

使用軟件SPSS 21.0和Excel來(lái)進(jìn)行離體葉片菌斑面積數(shù)據(jù)的方差分析(ANOVA)與t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 F 6染色體數(shù)目分析

通過(guò)壓片法可以清晰地觀察中期染色體(圖1)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，F(xiàn) 6個(gè)體擁有38條染色體，與甘藍(lán)型油菜(AACC，2 n=38)染色體數(shù)目一致，表明F 6確實(shí)是一種甘藍(lán)型油菜。

注：從左到右：ZS 09、Olera 2、F 6。圖2 接種核盤(pán)菌96 h后的葉片

2.2 離體葉片菌核病抗性鑒定實(shí)驗(yàn)

在ZS 09、O及F 6葉片上接種核盤(pán)菌96 h后，三者葉片上呈現(xiàn)不同大小的菌斑(圖2)。菌斑面積大小如表1，結(jié)果顯示ZS 09的菌斑面積最大，F(xiàn) 6次之，甘藍(lán)最小，表明甘藍(lán)對(duì)菌核病的抗性最強(qiáng)，F(xiàn) 6次之，ZS 09抗性最低。該實(shí)驗(yàn)證明了F 6是比ZS 09菌核病抗性更高的油菜資源。

2.3 親本和子代SSR分子標(biāo)記分析

229個(gè)位于甘藍(lán)型油菜連鎖群上的SSR標(biāo)記在ZS 09、O、F 6基因組中分別有181、148、168個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增出條帶(圖3)。其中，F(xiàn) 6擴(kuò)增出與ZS 09相同條帶的標(biāo)記有67個(gè)，與O相同的標(biāo)記38個(gè)，與ZS 09、O都不相同的特異性標(biāo)記有52個(gè)。與親本Olera 2擴(kuò)增出相同條帶而ZS 09沒(méi)有的38個(gè)SSR分子標(biāo)記分布在甘藍(lán)型油菜的18個(gè)遺傳連鎖群上(N 8號(hào)連鎖群無(wú))，其中主要的連鎖群為N 1、N 13、N 14，證明了F 6的確含有甘藍(lán)Olera 2部分遺傳物質(zhì)且較為均勻穩(wěn)定地分布在F 6的基因組中。

16個(gè)甘藍(lán)抗菌核病特異性位點(diǎn)SSR標(biāo)記結(jié)果顯示(圖4)，有10個(gè)SSR標(biāo)記在Olera 2和F 6中擴(kuò)增出來(lái)的條帶一致，占62.5%，其中有1個(gè)標(biāo)記位于甘藍(lán)1號(hào)連鎖群，2個(gè)位于6號(hào)連鎖群，7個(gè)位于9號(hào)連鎖群。該結(jié)果說(shuō)明F 6遺傳了約三分之二甘藍(lán)抗菌核病特異性位點(diǎn)。

3 討 論

由于起源和馴化的時(shí)間短加上育種方法效率不高，導(dǎo)致甘藍(lán)型油菜品種少，遺傳學(xué)基礎(chǔ)薄弱。相反，其親本之一的甘藍(lán)包含許多遺傳資源，并且擁有許多優(yōu)異的品質(zhì)，例如對(duì)核盤(pán)菌的高抗性[13]。常用的油菜育種方法有2種：一種是用甘藍(lán)型油菜與其親緣物種雜交來(lái)培育新品種[14]；另一種則是模仿自然狀態(tài)下甘藍(lán)型油菜的產(chǎn)生，即用蕓薹與甘藍(lán)雜交，通過(guò)胚胎挽救和染色體加倍的方法得到異源四倍體油菜[15]。本實(shí)驗(yàn)以具有部分抗性的甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào)和具有高抗性的甘藍(lán)為親本，進(jìn)行雜交將甘藍(lán)中的抗性遺傳物質(zhì)遺傳給子代F1，子代F1與ZS 09連續(xù)回交6代克服了雄性不育得到一株有花粉的植株，并通過(guò)自交來(lái)穩(wěn)定和累加自身遺傳性狀。F 6的染色體數(shù)目為整倍體并和甘藍(lán)型油菜(2 n=38)一致，這是F 6自交可育性的基礎(chǔ)并證明了F 6是一種甘藍(lán)型油菜。229個(gè)甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖群SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn) 6有52個(gè)親本不具有的條帶，可能是因?yàn)樵谟N過(guò)程部分染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生變異，甘藍(lán)型油菜和甘藍(lán)基因組部分同源導(dǎo)致染色體互換。菌核病抗性鑒定實(shí)驗(yàn)證明了F 6的抗性顯著性高于中雙9號(hào)，但低于甘藍(lán)，這是由于核盤(pán)菌抗抗性位點(diǎn)是數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，分布在多條染色體上，未能全部遺傳到F 6基因組中，SSR標(biāo)記方法證明F 6只繼承了約2/3的抗性位點(diǎn)，另外本研究中標(biāo)記的這些位點(diǎn)并不能包含甘藍(lán)全部的抗性基因，這促使著我們接下來(lái)要找出更多的抗性位點(diǎn)，提高這些位點(diǎn)從甘藍(lán)轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)型油菜中的成功率。需要注意的是抗性鑒定實(shí)驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室操作的，需進(jìn)行田間抗性鑒定實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢驗(yàn)F 6在自然狀態(tài)下的抗性大小。本次研究目的是培育菌核病高抗性甘藍(lán)型油菜，重點(diǎn)是其菌核病抗性，而和田間產(chǎn)量相關(guān)的其他油菜品質(zhì)如油菜籽重量、含油量高低、開(kāi)花時(shí)間、抗(耐)性等等則需要未來(lái)進(jìn)一步探索。

表1 離體葉片接種核盤(pán)菌96 h后菌斑面積

樣品名稱 菌斑面積(cm2) ZS09 2．52±0．41 O 1．03±0．20?? F6 1．88±0．22?

注：“**”代表p=0.01水平上對(duì)ZS 09的顯著性差異，“*”代表p=0.05水平上對(duì)ZS 09的顯著性差異。

注：M為DL 500 DNA Maker；F為F 6；O為Olera 2；RA-E 04、SWUC 731、RA2-F 11、SWUC 679、SWUC 81、SWUC 177、SWUC 205、SWUC 59、SWUC 455、NA 1-C 08、SWUC 227為SSR標(biāo)記名稱。圖4 甘藍(lán)抗菌核病特異性位點(diǎn)SSR標(biāo)記部分?jǐn)U增圖譜

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BreedingSclerotiniasclerotiorumResistantBrassicanapusL.by Using WildBrassicaoleraceawith the Analysis of Resistance and Molecular Marks

WANGHaojie,NIUXianfei,SONGYanhong,WANGMaolin
(College of Life Science,Sichuan University,Chengdu 610064,China)

Sclerotiniastem rot is one of most serious diseases inBrassicanapusL.because of its low resistance,but high resistant varieties are found in wildBrassicaoleracea.Hybridizing partially resistantBrassicanapusL.Zhongshuang No.9 and highly resistantBrassicaoleraceaOlera 2 to obtain F1(ACC).F 6 was generated by continuously backcrossing Zhongshuang No.9 to F16 times followed by selfing.The chromosomal number of F1was 38,it was according withBrassicanapusL.Resistance assessment indicating that the resistance of F1was higher than Zhongshuang No.9 but lower than Olera 2.Lastly,through comparing the amplified maps of 229 pairs of SSR marks distributed on the genetic linkage groups ofBrassicanapusL.as well as 16 pairs of SSR mark represented peculiar resistant loci ofBrassicaoleraceagainstSclerotiniasclerotiorumbetween parents and progeny,we found that the No.9 linkage group of Olera 2 had permeated into the the genome of F 6.

Brassicaoleracea;BrassicanapusL.;SclerotiniaSclerotiorum; SSR maker

2016-05-13

國(guó)家科技支撐計(jì)劃( 編號(hào): 2013 FBAD 01 B 03)；國(guó)家“863” 計(jì)劃( 編號(hào):2011 AA 10 A 10401) ；四川省“十二五” 油菜育種攻關(guān)項(xiàng)目( 編號(hào):2011 yz gg 05) 。

王浩杰(1991—)，男，安徽六安人；碩士研究生，研究方向：植物遺傳；E-mail: wanghoajie@sina.cn。

王茂林，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物分子生物學(xué)研究和油菜遺傳育種研究；E-mail: mlwang@scu.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.11.009

S 565.4

A

1001-4705(2016)11-0009-04