， ， (天津市植物保護研究所， 天津 300381)

黃瓜種子攜帶真菌的檢測研究

高葦，王勇，張春祥
(天津市植物保護研究所， 天津 300381)

為明確不同黃瓜品種種子攜帶真菌的種類及其帶菌率差異，采用洗滌法和PDA平板法對12個黃瓜栽培品種進行種子外部和內(nèi)部帶菌檢測。結(jié)果表明，供試種子外部帶菌量差異較大，分離真菌的種類主要為青霉(Penicilliumspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)、木霉(Trichodermaspp.)、根霉(Rhizopusspp.)等腐生菌及鐮刀菌(Fusariumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)、蛭孢(Cladosporiumspp.)等疑似病原真菌。種子內(nèi)部寄藏真菌較少，疑似病原菌檢出率顯著降低，其中攜帶的鐮刀菌分離頻率最高，種殼內(nèi)表皮的帶菌率顯著高于種胚。

黃瓜； 種子； 寄藏真菌； 帶菌檢測

種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生產(chǎn)資料，其質(zhì)量直接決定農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量。在種子生產(chǎn)、儲藏和運輸過程中，會與多種微生物接觸，從而導(dǎo)致種子帶菌。種子生產(chǎn)過程中易接觸到植物病原菌，種子攜帶的病原菌可以作為植物病害的初侵染源，成為病害傳播的主要途徑[1]；種子儲藏或運輸時，攜帶的非致病菌可能對種子質(zhì)量及其萌發(fā)或活力造成影響[2]。種子的安全生產(chǎn)、種子帶菌的檢測和處理是確保農(nóng)作物安全生產(chǎn)的首要前提。

黃瓜是我國主要的蔬菜栽培品種，在其整個生長過程中會受到多種植物病原真菌的侵染，其中部分病原真菌可以在土壤和種子上越冬越夏成為下茬初侵染源。目前，生產(chǎn)上對病害的防治倡導(dǎo)選用抗病品種、生物防治、化學(xué)防治等綜合防控手段，而對于其種傳病原真菌的控制最有效的措施就是及時檢測，及時采取種子消毒及種衣劑包衣等預(yù)防措施[3]。目前，關(guān)于黃瓜種子攜帶真菌種類的調(diào)查鑒定的相關(guān)報道較少，研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜種子上可檢測到的真菌有7～8種[4-5]，檢測到的病原菌較少[6-7]。本研究參考國際種子檢驗規(guī)程和農(nóng)作物種子健康檢測方法[8]，以黃瓜種子為研究對象，對收集的天津和北京地區(qū)未包衣的黃瓜種子進行其攜帶真菌檢測與鑒定，以期明確黃瓜種子帶菌量及主要的優(yōu)勢真菌類型，為生產(chǎn)中黃瓜種子的藥劑消毒處理和種衣劑的選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜品種共12個，分別為:來自天津的黃瓜品種津春3號、津春4號、德瑞特D 19號，博新20號和德瑞特2號；來自北京的黃瓜品種中農(nóng)5號、中農(nóng)6號、中農(nóng)8號、中農(nóng)10號和中農(nóng)12號；來自山東的黃瓜品種山東密刺和春秋大豐1號。

1.2 種子帶菌檢測

1.2.1 種子外部攜帶真菌的檢測

將12個黃瓜品種隨機各選取200粒種子，放入250 mL的三角瓶中，加入50 mL的無菌水，在25 ℃，120 r/min的搖床上充分振蕩1 h。然后收集懸浮液10 mL于已滅菌的離心管中，在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心20 min，去上清液，沉淀即為收集的菌體等。加入少量的無菌水使沉淀懸浮，并對其進行10倍系列的梯度稀釋，每個稀釋度菌懸液100μL涂布于9 cm的加有鏈霉素的PDA平板上，每個濃度3皿重復(fù)，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d觀察平板上的菌落，根據(jù)稀釋倍數(shù)和種子檢測數(shù)計算種子外部攜帶真菌的孢子負荷量和檢出真菌的比例[2]。孢子負荷量(個/粒)=每皿菌落總數(shù)/0.1 mL×稀釋倍數(shù)×50 mL/200粒，分離比例(%)=某類真菌菌落數(shù)/菌落總數(shù)×100%。

1.2.2 種子內(nèi)部攜帶真菌的檢測

將各品種100粒黃瓜種子在1% NaClO溶液中浸泡2 min，用無菌水沖洗3遍，取45粒種子在無菌的條件下將其種殼和種胚解剖開；將種胚再放置在1%NaClO溶液中浸泡3 min，用無菌水沖洗3遍。將晾干后的種殼(內(nèi)殼朝下)、種胚均勻的擺放在直徑為9 cm的有鏈霉素的PDA平板上，每皿15粒種子組織塊，每個處理3次重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d觀察平板上的菌落數(shù)。種子帶菌率(%)=帶菌種子數(shù)/檢測種子總數(shù)×100%；某特定菌分離頻率(%)=帶某類菌種子數(shù)/帶菌種子總數(shù)×100%。

表1 供試黃瓜種子外部分離的真菌及其分離頻率

供試品種孢子負荷量分離到真菌的種類及分離頻率(%)鐮刀菌鏈格孢蛭孢木霉青霉毛霉根霉曲霉其它津春3號972a18．523．702．473．7022．2220．993．70—24．69津春4號66de5．453．641．8221．8212．7316．36—32．735．45德瑞特D19號68．4de14．04—3．5128．07—17．5412．28—24．56博新20號732b9．846．561．649．8421．3119．678．20—22．95德瑞特2號82．8d14．4915．944．35—20．2917．391．4524．641．45中農(nóng)5號64．8de—9．26—9．26—20．373．7031．4829．63中農(nóng)6號576c2．0814．58—16．6718．75—12．50—35．42中農(nóng)8號69．6de5．176．903．4518．97—24．148．6213．7918．97中農(nóng)10號62．4de3．85——19．2332．695．77—11．5426．92中農(nóng)12號38．4ef3．1318．759．38—15．636．25—34．3812．50山東密刺948a15．196．332．535．0611．3925．328．861．2724．05春秋大豐1號74．4de3．2316．13—11．2922．5811．29—25．819．68

1.3 種傳真菌初步鑒定

將分離到的真菌進行純化、鏡檢和保存。根據(jù)真菌的培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)特征，參照工具書及鑒定資料進行分類鑒定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜種子外部攜帶真菌

通過洗滌離心法和PDA平板法檢測發(fā)現(xiàn)，不同黃瓜種子攜帶的真菌具有較大的差異(表1)，山東密刺和津春3號外部帶菌量最高，每粒種子攜帶孢子量達到900多，顯著高于其它品種；博新20號種子攜帶孢子量為732；其它品種的種子孢子帶菌量低于100，各品種間差異不顯著；其中，中農(nóng)12號種子帶菌量最低。

從12個黃瓜品種的種子上分離到的疑似致病菌為鐮刀菌(Fusariumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)、蛭孢(Cladosporiumspp.)，其中鐮刀菌的分離頻率最高，津春3號、德瑞特D 19號、德瑞特2號和山東密刺上鐮刀菌的分離率在15%左右；其次是鏈格孢菌，德瑞特2號、中農(nóng)6號和春秋大豐1號上該病原的分離率在15%左右；蛭孢菌的分離率較低。鐮刀菌、鏈格孢菌也是腐生菌的一種，所以對分離到的疑似病原菌還需進一步的致病力鑒定確定其是否為病原菌。通過分離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北京中農(nóng)系列品種的帶菌率顯著低于天津的幾個品種。另外，通過分離發(fā)現(xiàn)黃瓜種子表皮攜帶的腐生菌種類主要為木霉(Trichodermaspp.)、青霉(Penicilliumspp.)、毛霉(Mucorspp.)、根霉(Rhizopusspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)等。不同品種黃瓜上腐生菌的主要類群差異較大。

2.2 黃瓜種子內(nèi)部攜帶真菌

對不同黃瓜品種種子內(nèi)部攜帶真菌進行檢測鑒定，結(jié)果表明，供試品種種子內(nèi)部攜帶真菌種類差異不顯著，與種子外部攜帶真菌種類相似，帶菌量顯著低于種子表皮，種子內(nèi)部種胚和內(nèi)殼表皮帶菌率最高的品種均為山東密刺，帶菌率分別為33.33%和53.33%(表2和表3)。種胚帶菌率介于0～33.33%，中農(nóng)系列種子種胚帶菌率均較低，其中中農(nóng)6號胚上未分離到真菌。種胚上攜帶的真菌多為腐生菌，攜帶的致病菌以鐮刀菌居多，津春3號、津春4號、德瑞特2號、山東密刺和春秋大豐1號上均分離到了鐮刀菌；其次是鏈格孢，在津春3號和中農(nóng)5號分離培養(yǎng)到了鏈格孢菌；在供試品種上均未分離到蛭孢菌。德瑞特D 19號、博新20號、中農(nóng)6號、中農(nóng)8號、中農(nóng)10號和中農(nóng)12號6個品種上未分離到致病菌。種子內(nèi)部種殼內(nèi)表皮帶菌率明顯高于種胚。德瑞特D 19號、博新20號、中農(nóng)6號和中農(nóng)8號4個品種種殼上未分離到致病菌。

表2 供試黃瓜種子種胚寄藏疑似病原真菌及其分離頻率

供試品種種子帶菌率(%)分離頻率(%)鐮刀菌鏈格孢蛭孢其它津春3號26．678．3316．67—75．00津春4號17．7825．00——75．00德瑞特D19號22．22———100．00博新20號13．33———100．00德瑞特2號24．4427．27——72．73中農(nóng)5號11．11—40．00—60．00中農(nóng)6號0．00————中農(nóng)8號8．89———100．00中農(nóng)10號6．67———100．00中農(nóng)12號11．11———100．00山東密刺33．3326．67——73．33春秋大豐1號15．5614．29——85．71

表3 供試黃瓜種子種殼內(nèi)部寄藏疑似病原真菌及其分離頻率

供試品種種子帶菌率(%)分離頻率(%)鐮刀菌鏈格孢蛭孢其它津春3號42．2215．7915．79—68．42津春4號24．449．09——90．91德瑞特D19號22．22———100．00博新20號28．89———84．62德瑞特2號26．6716．67—8．3375．00中農(nóng)5號22．22—20．00—80．00中農(nóng)6號8．89———100．00中農(nóng)8號22．22———100．00中農(nóng)10號17．78—37．50—62．50中農(nóng)12號15．5614．29——85．71山東密刺53．3325．008．33—66．67春秋大豐1號26．6725．00——75．00

3 結(jié)論與討論

本研究對天津、北京和山東地區(qū)生產(chǎn)的黃瓜品種采用洗滌離心和PDA平板培養(yǎng)的方法對種子表皮、種子內(nèi)殼和種胚上攜帶的真菌進行檢測和鑒定。試驗結(jié)果表明，不同黃瓜品種上攜帶的真菌主要包括疑似種傳病原菌和部分腐生菌。疑似病原菌為鐮刀菌、鏈格孢和蛭孢菌，其中鐮刀菌是一種主要的種傳根部病原菌，鏈格孢和蛭孢菌可以引起黃瓜葉片發(fā)生黑斑病和黑星病，本研究從供試品種上均分離到了這3種病原菌，但由于其也可能是一種腐生菌，所以對于分離到的疑似病原菌的致病性仍需進一步的接種試驗證明。通過分離培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，黃瓜種子上攜帶的真菌種類與西瓜、玉米、水稻等其他作物具有一定的相似性[2,10-13]，種子表皮攜帶的真菌多為腐生菌，分離到的病原菌較少。種子內(nèi)部攜帶的真菌數(shù)量顯著低于種子表皮，其中種胚上攜帶的真菌數(shù)量最低。通過分離培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)德瑞特D 19號、博新20號、中農(nóng)6號和中農(nóng)8號4個品種僅分離到了腐生菌，未分離到致病菌。對于種胚和種子內(nèi)殼上分離到疑似病原菌的品種，其病原菌的致病性有待進一步的研究探討，以衡量其生產(chǎn)使用的安全性。

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Testing of Seed-Associated Fungi of Cucumber Seed

GAOWei，WANGYong，ZHANGChunxiang

2016-04-28

天津市自然科學(xué)基金青年項目“多主棒孢毒素cassiicolin對黃瓜致病機制的研究”(編號：13 JCQNJC 14900)。

高 葦(1982—)，女，遼寧瓦房店市人；助理研究員，博士，主要從事植物病原真菌的檢測和防治方面的研究；E-mail:gaowei5277@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.091

S 642.2； S 432.1

A

1001-4705(2016)09-0091-03