， ， ， (.湖北省農(nóng)科院中藥材研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心中藥材分中心， 湖北 恩施 445000；.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

·種子檢驗(yàn)·

續(xù)斷種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究

艾倫強(qiáng)1，王玭2，由金文1，張美德1
(1.湖北省農(nóng)科院中藥材研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心中藥材分中心， 湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 湖北 恩施 445000)

目的：建立續(xù)斷種子的檢驗(yàn)方法。方法：參考國際植物種子檢驗(yàn)規(guī)程和中國農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程的方法。結(jié)果與結(jié)論：采用分樣器法扦樣，種子的凈度高于90%；種子千粒重測(cè)定宜用百粒法；種子水分測(cè)定宜選用高溫烘干法，時(shí)間為3 h；種子發(fā)芽率測(cè)定宜用紙床作發(fā)芽床，溫度為25 ℃；種子生活力測(cè)定采用TTC染色法，在0.2%四唑溶液中45 ℃避光染色1 h。

續(xù)斷； 種子； 質(zhì)量檢驗(yàn)方法

藥材續(xù)斷為川續(xù)斷科植物川續(xù)斷(DipsacusasperityWall.ex Henry)的干燥根，主要用于肝腎不足，腰膝酸軟，風(fēng)濕痹痛，跌撲損傷，筋傷骨折[1]。據(jù)《湖北中藥資源》記載，湖北省的續(xù)斷主要分布在恩施州，具有產(chǎn)量大，品質(zhì)優(yōu)的特點(diǎn)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所艾鐵民教授在對(duì)恩施續(xù)斷進(jìn)行采樣分析后，認(rèn)為其品質(zhì)與川東地區(qū)相媲美，是續(xù)斷的主產(chǎn)區(qū)之一[2]。目前續(xù)斷主要來源于野生資源，作為大宗藥材，年需求量已達(dá)5 000 t左右，野生資源已無法滿足市場(chǎng)的需求，人工栽培被提到計(jì)事日程上。而建立大規(guī)模的規(guī)范化中藥材種植基地，關(guān)鍵在于種子的質(zhì)量好壞[3]。川續(xù)斷在自然環(huán)境是用種子進(jìn)行繁殖的，但由于未進(jìn)行續(xù)斷種子檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的研究與制定，無法對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效控制，從而影響中藥材的質(zhì)量。開展種子種苗質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究與制定相應(yīng)質(zhì)量檢驗(yàn)規(guī)程是國家規(guī)范中藥材生產(chǎn)工作的一項(xiàng)重要任務(wù)[4]，故續(xù)斷種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究十分必要。本研究主要對(duì)川續(xù)斷種子進(jìn)行了扦樣、凈度、千粒重、水分、發(fā)芽率、生活力等主要質(zhì)量指標(biāo)的測(cè)定方法的研究，為續(xù)斷種子質(zhì)量檢驗(yàn)提供依據(jù)，進(jìn)而開展續(xù)斷種子檢驗(yàn)規(guī)程與質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究。

1 材 料

2014年11月收集恩施不同產(chǎn)地、不同生長方式、不同海拔和生態(tài)條件下的續(xù)斷種子，取各產(chǎn)地少量種子混合作為試驗(yàn)樣品。種子經(jīng)湖北省農(nóng)科院中藥材研究所副研究員由金文鑒定為川續(xù)斷科川續(xù)斷的種子。

2 方 法

2.1 扦 樣

2.1.1 常規(guī)扦樣方法

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.2-1995扦樣的規(guī)定執(zhí)行[5]。

2.1.2 樣品保存

試驗(yàn)樣品經(jīng)分取后，裝于樣品袋內(nèi)，通風(fēng)保存。

2.2 凈度分析

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.3-1995凈度分析規(guī)定執(zhí)行[5]。將試樣分離成種子和雜質(zhì)，其中雜質(zhì)包括：沙、土、脫落的外皮等。隨機(jī)取待檢測(cè)續(xù)斷種子試樣50 g，將種子和雜質(zhì)分離，將每份試樣中各成分分別稱重，計(jì)算各成分所占的百分率，試樣的增失差距未偏離原始重量的5%，測(cè)定值有效[6]。

2.3 重量測(cè)定

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.3-1995其他項(xiàng)目規(guī)定執(zhí)行[5]。選用百粒法和千粒法測(cè)定續(xù)斷種子的重量，百粒法：用手搖篩和手從試驗(yàn)樣品中隨機(jī)取8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)100粒，計(jì)算重復(fù)間變異系數(shù)，若小于4.0，則測(cè)定值有效；千粒法：用手搖篩和手從試驗(yàn)樣品中隨機(jī)取2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 000粒，計(jì)算2個(gè)重復(fù)間差數(shù)與平均數(shù)之比，若小于5%，則測(cè)定值有效。

2.4 水分測(cè)定

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.3-1995水分測(cè)定規(guī)定執(zhí)行[5]。選用低溫烘干法和高溫烘干法。低溫烘干法：將試樣放置在溫度(105±2)℃ 的恒溫真空干燥箱內(nèi)，分別烘2，4，6，8，10，12，14，16，18 h取出放入干燥器內(nèi)冷卻、稱重，計(jì)算續(xù)斷種子含水量(即水分)。高溫烘干法：將試樣放置在溫度(133±2)℃ 的恒溫真空干燥箱內(nèi)，分別烘1，2，3，4 h取出放入干燥器內(nèi)冷卻、稱重，計(jì)算續(xù)斷種子含水量(即水分)[6]。

表2 百粒法測(cè)定續(xù)斷種子千粒重結(jié)果

樣品/份(g)12345678平均值(g)標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)(%)0．42620．39750．39710．39320．40820．40670．40620．39950．40430．012．4

2.5 發(fā)芽率測(cè)定

參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》GB/T 3543.3-1995發(fā)芽試驗(yàn)的規(guī)定執(zhí)行[5]。發(fā)芽床試驗(yàn)：設(shè)置紙床、砂床、珍珠巖、海綿及蛭石共5個(gè)處理，光照24 h，20 ℃；發(fā)芽光照試驗(yàn)：設(shè)置黑暗條件、光照12 h、光照24 h共3個(gè)處理，紙床，20 ℃；發(fā)芽溫度試驗(yàn)：設(shè)置15，20，25，30 ℃共4個(gè)處理，紙床，黑暗條件。上述各個(gè)試驗(yàn)每處理重復(fù)4次，每重復(fù)100粒種子。

2.6 生活力測(cè)定

用TTC法對(duì)種子進(jìn)行生活力測(cè)定。隨機(jī)取試樣4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒，用解剖刀將種子沿種脊線切開，選用其中一半，濃度梯度設(shè)定為0.05%、0.10%、0.20%、0.40%，染色時(shí)間為0.5，1，2，4 h，溫度為45 ℃，避光染色，觀察并記錄染色的數(shù)目，未被染色的種子為死種子，被染色的即為活種子。

3 結(jié)果與分析

3.1 扦 樣

扦樣采用分樣器法，續(xù)斷種子最大千粒重約為4 g，2 500個(gè)種子單位不超過10 g，加上雜質(zhì)，進(jìn)行凈度分析的樣品大約12 g，送檢樣品應(yīng)為10倍即120 g。

3.2 凈度分析

根據(jù)2.2所述的方法測(cè)定結(jié)果見表1，試樣的增失差距偏離原始重量的0.1%，小于規(guī)定的5%，故此方法切實(shí)可行。

表1 續(xù)斷種子凈度測(cè)定結(jié)果

分取樣品質(zhì)量(g)凈種子質(zhì)量(g)雜質(zhì)質(zhì)量(g)凈度后總質(zhì)量(g)凈度(%)47．7444．113．6847．7992．30

3.3 重量測(cè)定

選用百粒法和千粒法測(cè)定種子千粒重。

百粒法測(cè)定的結(jié)果見表2。

千粒法測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 千粒法測(cè)定續(xù)斷種子千粒重結(jié)果

樣品/份(g)12平均值(g)重復(fù)間差數(shù)差數(shù)和平均數(shù)之比(%)4．0193．9884．0040．0310．77

此2種測(cè)定方法均可測(cè)定，由于百粒法測(cè)定操作較簡單，所以選用百粒法。

3.4 水分測(cè)定

3.4.1 低溫烘干法

根據(jù)2.4所述的方法進(jìn)行低溫烘干，測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 續(xù)斷種子低溫烘干水分測(cè)定結(jié)果

3.4.2 高溫烘干法

根據(jù)2.4所述的方法進(jìn)行高溫烘干，測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 續(xù)斷種子高溫烘干水分測(cè)定結(jié)果

3.4.3 2種烘干方法結(jié)果比較

續(xù)斷種子在高恒溫條件下烘干3 h前，含水量有明顯的上升趨勢(shì)，3 h之后種子的含水量趨于穩(wěn)定，見圖2；在低恒溫條件下，種子含水量一直呈上升趨勢(shì)，未趨于穩(wěn)定，說明種子在實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)仍然有水分，未完全烘干，見圖1。綜合2種方法，鑒于低溫烘干法所需時(shí)間太長且效果不佳，含水量測(cè)定方法選用高溫烘干法烘3 h。

3.5 發(fā)芽率測(cè)定

發(fā)芽床選擇試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 續(xù)斷種子發(fā)芽床結(jié)果比較

處理發(fā)芽率(%)1234平均值差異顯著性5%1%紙床7065657869．50aA砂床5651656459．00abA珍珠巖4353576153．50bA海綿6442616858．75abA蛭石5880708272．50aA

光照選擇試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表5。

表5 續(xù)斷種子光照條件結(jié)果比較

處理發(fā)芽率(%)1234平均值差異顯著性5%1%黑暗條件7471759077．50aA光照12h7872707072．50aA光照24h7065657869．50aA

溫度選擇試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 續(xù)斷種子發(fā)芽溫度結(jié)果比較

處理發(fā)芽率(%)1234平均值差異顯著性5%1%15℃3850403240．00bB20℃9090908488．50aA25℃7894708682．00aA30℃8280828682．50aA

比較5種發(fā)芽床，紙床和蛭石作為發(fā)芽床都有很好的效果，考慮到紙床操作簡單方便，選擇紙床作為發(fā)芽率檢驗(yàn)的發(fā)芽床。比較不同光照條件下續(xù)斷種子的發(fā)芽情況，并無顯著差異，故可以不考慮光照條件。比較4個(gè)溫度，20 ℃及以上的溫度下，發(fā)芽率均達(dá)到了80%以上，考慮到25 ℃接近室溫，所以選用此溫度作為發(fā)芽率檢驗(yàn)的溫度。發(fā)芽率最佳檢驗(yàn)條件是：紙床為發(fā)芽床，在25 ℃的條件下連續(xù)觀察25 d，可以較好地測(cè)定發(fā)芽率。

3.6 生活力測(cè)定

3.6.1 TTC法

染色溶液濃度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表7。

染色時(shí)間試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果見表8。

表7 續(xù)斷種子染色濃度結(jié)果比較

處理號(hào)濃度(%)時(shí)間(h)溫度(℃)著色率(%)10．0514511．3c20．1014535．0b30．2014595．0a40．4014573．8a

表8 續(xù)斷種子染色時(shí)間結(jié)果比較

處理號(hào)濃度(%)時(shí)間(h)溫度(℃)著色率(%)10．200．54582．5b20．2014595．0a30．2024598．8a40．2044598．8a

3.6.2 染色結(jié)果

用濃度為0.20%的TTC時(shí)染色效果能達(dá)到90%以上，與在0.05%和0.10%濃度下的染色效果具有顯著性差異，與在0.40%濃度下的染色效果無顯著性差異，TTC染色1 h時(shí)的染色效果即達(dá)到90%以上，與染色0.5 h的效果具有顯著性差異，與染色3 h和4 h的效果無顯著性差異，故選用0.20%TTC染色1 h。

4 討 論

4.1續(xù)斷種子在25 ℃，紙床作為發(fā)芽床的條件下最適合發(fā)芽，萌發(fā)需要一定濕度，在種子播種前進(jìn)行適當(dāng)浸泡有利于種子萌發(fā)，但浸泡時(shí)間以10 h左右為宜。

4.2續(xù)斷種子無后熟現(xiàn)象，采收后的儲(chǔ)藏一定要注意水分控制，切不可密封，否則容易造成提前發(fā)芽和腐爛。

4.3一般要等到續(xù)斷種子完全成熟才能采集，時(shí)間在10月至12月，海拔1 000 m以下地區(qū)在10月底可以開始采集，海拔在1 000 m以上地區(qū)要到11月底。

4.4在采用TTC法測(cè)定生活力的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，溶液濃度越大，染色溫度越高，染色時(shí)間則越短。然而，并不是TTC的濃度越大，溫度越高，所測(cè)定生活力就越高。染色深淺程度主要表現(xiàn)生活力的強(qiáng)弱，并不是判斷生活力有無的標(biāo)準(zhǔn)，濃度過大反而影響染色情況的正確鑒別，溫度過高也會(huì)破壞種子生活力[3]。

4.5在進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)過程中，應(yīng)定期管理和檢查，并經(jīng)常補(bǔ)給適量水分，切不可干燥。如果發(fā)現(xiàn)種子發(fā)霉，應(yīng)將霉?fàn)€種子取出；如果僅種子表面生霉，則洗凈后仍放回發(fā)芽床；如果種子內(nèi)部已腐爛，應(yīng)予剔除，將情況記錄在試驗(yàn)記載本上。

[1]中國藥典,一部[S].2015:329-330.

[2]董玉瓊.川續(xù)斷種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].北京:中醫(yī)藥大學(xué),2007.

[3]何伶俐.白花前胡種子檢驗(yàn)規(guī)程和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)研究[D].武漢:湖北中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[4]任德全,周榮漢.中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GAP)實(shí)施指南[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003:26.

[5]全國農(nóng)作物種子標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì),全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心.GB/T 3543.2《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》實(shí)施指南[S].

[6]艾倫強(qiáng),李婷婷,由金文,等.半夏種苗質(zhì)量檢驗(yàn)方法研究[J].中國種業(yè),2012(9):45-46.

Testing Methods for Seed Quality ofDipsaciradix

AILunqiang1,WANGPin2,YOUJinwen1,ZHANGMeide1

2016-04-28

艾倫強(qiáng)(1980—)，男，湖北武漢人；助理研究員，研究方向：藥用植物資源調(diào)查、育種與栽培。

張美德，E-mail：406572231@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.122

S 567.23+9

A

1001-4705(2016)09-0122-04