， ， (沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 遼寧 沈陽 110866)

二月蘭種子生活力與耐鹽能力研究

祝朋芳，潘志超，張佳惠
(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 遼寧 沈陽 110866)

研究了不同貯存年限二月蘭種子的生活力，并采用單鹽和復(fù)鹽脅迫，系統(tǒng)研究了二月蘭干種子與萌動種子在鹽脅迫下的致死率與耐鹽機理。結(jié)果表明：常溫貯存2年的種子與貯存1年的種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢均較高，2013年種子生活力雖總體上好于2014年種子，但二者差異不顯著。與干種子相比，萌動種子更耐鹽脅迫；單鹽脅迫下，干種子半致死濃度和臨界濃度分別為1.6%和1.8%，萌動種子半致死濃度和臨界濃度分別為1.8%和2.0%；復(fù)鹽脅迫下，干種子半致死濃度和臨界濃度分別為0.4%～0.6%和0.6%～0.8%，萌動種子半致死濃度和臨界濃度分別為0.6%～0.8%和0.8%～1.0%。在干種子萌發(fā)過程中，隨著鹽脅迫濃度的增大，萌發(fā)高峰期延遲，發(fā)芽率下降。游離脯氨酸含量在單鹽脅迫中呈持續(xù)增大趨勢，而在復(fù)鹽脅迫下則先上升后下降。相對電導(dǎo)率在單鹽與復(fù)鹽脅迫下雖然總體上均呈上升趨勢，但出現(xiàn)了不同程度的小高峰。

二月蘭種子； 生活力； 鹽脅迫； 臨界濃度； 耐鹽機理

土壤鹽漬化及次生鹽漬化現(xiàn)象是目前世界性的重大環(huán)境問題之一[1]。在我國，鹽漬土廣泛分布于西北、華北、東北及沿海地區(qū)，耕地中也有大量鹽漬化土壤分布[2]。鹽漬化的土地不僅會導(dǎo)致作物減產(chǎn)，還會對當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境綠化、植物保護、作物生產(chǎn)等方面產(chǎn)生巨大的負面影響，嚴重影響我國農(nóng)林經(jīng)濟的發(fā)展[3]。因此，高效利用并改善鹽漬化土地成為了一個亟待解決的問題。二月蘭(Orychophragmusviolaceus)是十字花科諸葛菜屬植物，耐寒性強，易于栽培，不僅是美化早春園林綠地的重要植物材料，還對鹽漬化土壤具有有效的培肥效果[4]。對于二月蘭的研究主要集中在種間雜交、遺傳多樣性、生物學(xué)特性、培肥效果、抗旱性與耐鹽性等方面[5-10]，但對于鹽漬化土壤中種子萌發(fā)后的存活與生長情況缺乏系統(tǒng)的研究。本試驗以二月蘭種子自播繁殖習(xí)性為依據(jù)，系統(tǒng)研究了常溫貯存條件下不同貯存時間的二月蘭種子生活力，以及不同種類與濃度鹽脅迫下二月蘭干種子與萌動種子的生長狀況與耐鹽機理，旨在為二月蘭在鹽漬化立地條件下的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的二月蘭種子采集于遼寧省實驗中學(xué)，采集后常溫貯存。種子萌發(fā)及耐鹽性試驗于2015年2—5月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)進行。

1.2 方 法

1.2.1 不同貯存時間種子生活力測定

分別稱量2013、2014年收獲的二月蘭種子千粒重。將2013、2014年收獲的種子用75%乙醇浸泡3 min進行表面消毒后，用蒸餾水沖洗干凈并浸泡2 h，播于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿播100粒，在25 ℃人工氣候箱暗培養(yǎng)，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)，測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率。重復(fù)3次。

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

發(fā)芽勢為浸種處理第3天時的發(fā)芽率。

1.2.2 鹽脅迫處理

以2013年收獲的二月蘭種子為試材，浸種預(yù)處理方法同1.2.1。鹽脅迫處理分為干種子處理和萌動種子處理。干種子處理是指浸種預(yù)處理后直接進行耐鹽試驗，萌動種子是指胚根伸出種皮后進行耐鹽試驗。分別設(shè)置單鹽脅迫(NaCl濃度為0%～2.0%，按質(zhì)量百分比計算，下同；梯度為0.2%，下同)與復(fù)鹽脅迫(NaCl∶NaHCO3=1∶1，濃度為0%～1.0%)2種處理，以蒸餾水作對照(ck)，每隔24 h補充相應(yīng)處理濃度的溶液，以剛浸透底部濾紙為宜。重復(fù)3次。

處理后每天記錄不同脅迫下二月蘭種子的萌發(fā)和生長情況，統(tǒng)計發(fā)芽率、發(fā)芽勢及致死率，干種子在脅迫處理至種子不再萌發(fā)時統(tǒng)計致死率，萌動種子在脅迫處理7 d后統(tǒng)計致死率。

1.2.3 鹽脅迫下生理指標的測定

脅迫處理7 d后，測定二月蘭子葉幼苗的游離脯氨酸含量和相對電導(dǎo)率。游離脯氨酸含量用茚三酮法，相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份二月蘭種子生活力測定

2013年種子千粒重略大于2014年種子，二者差異不顯著(表1)，表明發(fā)育良好的二月蘭種子貯存2年與貯存1年內(nèi)含物質(zhì)量變化不明顯。

種子浸種后， 2013年種子從浸種處理第2天開始萌發(fā)，并出現(xiàn)萌發(fā)高峰，萌發(fā)率達67.33%(表1)。2014年種子在浸種處理的第1天即開始萌發(fā)，第2天出現(xiàn)萌發(fā)高峰期，萌發(fā)率為62.33%；第4天時，發(fā)芽率仍均有不同程度的上升；第4天后，發(fā)芽率再無上升。2014年種子總發(fā)芽率與發(fā)芽勢均低于2013年種子。經(jīng)差異顯著性分析，發(fā)芽處理第1天時，2年種子萌發(fā)率存在極顯著差異；第2、3天即種子萌發(fā)高峰前期及高峰期時，二者間無顯著差異；第4天為萌發(fā)終期，二者間也未出現(xiàn)顯著差異；總發(fā)芽率和發(fā)芽勢均無顯著差異。由此可見，2013年種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢雖然總體上好于2014年，但二者間差異不顯著，說明二月蘭種子在常溫貯存條件下，貯存2年與貯存1年生活力均較好，這有利于困難立地條件二月蘭種群的復(fù)蘇。

表1 不同年份二月蘭種子萌發(fā)率比較

種子類型2013年(%)2014年(%)千粒重(g)2．10±0．007aA2．05±0．005aA處理時間(d)10aA9．00±0．577aB267．33±1．764aA62．33±2．333aA394．67±1．667aA88．00±0．577aA499．33±0．333aA96．67±0．667aA總發(fā)芽率(%)99．33±0．333aA96．67±0．667aA發(fā)芽勢(%)94．67±1．667aA88．00±0．577aA

注：小寫字母表示顯著水平(p<0.05)，大寫字母表示極顯著水平(p<0.01)。

2.2 二月蘭干種子耐鹽性

2.2.1 單鹽脅迫下萌發(fā)能力分析

選取0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%濃度下種子萌發(fā)情況繪制成圖(圖1)。單鹽脅迫處理第2天后，二月蘭種子開始萌發(fā)，萌發(fā)大致集中在前4 d，處理4 d后萌發(fā)曲線趨于平緩。鹽脅迫濃度不同，萌發(fā)高峰期出現(xiàn)的時間不同，在濃度為0.4%或低于0.4%時，萌發(fā)高峰期為處理后第2天；在濃度為0.4%～1.6%時，萌發(fā)高峰期為處理后第3天；在濃度大于1.6%時，萌發(fā)高峰期為處理后第4天。由此可見，隨著鹽脅迫濃度的增大，萌發(fā)高峰期延遲。此外，鹽脅迫濃度越高，種子發(fā)芽率越低。

圖1 單鹽脅迫下種子萌發(fā)結(jié)果

2.2.2 復(fù)鹽脅迫下萌發(fā)能力分析

復(fù)鹽脅迫處理第3天后，二月蘭種子開始萌發(fā)，種子萌發(fā)數(shù)與鹽脅迫濃度呈負相關(guān)關(guān)系,隨著脅迫濃度的增大，二月蘭種子萌發(fā)率逐漸降低(圖2)。在鹽脅迫濃度低于或等于0.4%時，萌發(fā)高峰期為處理后第3天；在濃度為0.6%時，萌發(fā)高峰期為處理后第4天；在濃度高于或等于0.8%時，種子萌發(fā)數(shù)較少，且萌發(fā)緩慢。

圖2 復(fù)鹽脅迫下種子萌發(fā)結(jié)果

2.2.3 單鹽與復(fù)鹽脅迫下干種子致死性

不同鹽脅迫下，二月蘭干種子致死情況見表2。在單鹽脅迫下，二月蘭干種子的半致死濃度和臨界濃度分別為1.6%和1.8%。在復(fù)鹽脅迫下，干種子的半致死濃度為0.4%～0.6%(圖版1-C,D)，臨界濃度為0.6%～0.8%(圖版1-D,E)。

2.3 二月蘭萌動種子耐鹽性

2.3.1 單鹽脅迫對二月蘭游離脯氨酸含量和相對電導(dǎo)率的影響

單鹽脅迫下，游離脯氨酸含量隨脅迫濃度的增大呈上升趨勢，并且在1.6%～2.0%的濃度下急劇上升，2.0%濃度時游離脯氨酸含量為24.98μg/g，約為空白對照的8倍(圖1)，表明在鹽脅迫下，游離脯氨酸逐漸積累，這對組織細胞液起到了滲透調(diào)節(jié)作用，增強了二月蘭的耐鹽能力。

表2 不同鹽脅迫下二月蘭種子致死率

材料 半致死濃度(%) 臨界濃度(%) 單鹽復(fù)鹽單鹽復(fù)鹽干種子1．60．4～0．61．80．6～0．8萌動種子1．80．6～0．82．00．8～1．0

圖3 單鹽脅迫下游離脯氨酸含量與相對電導(dǎo)率變化

在鹽脅迫下，相對電導(dǎo)率隨脅迫濃度的增大總體呈上升趨勢。在濃度為0.4%時，出現(xiàn)第一個小高峰，表明二月蘭受到鹽脅迫時，細胞迅速作出反應(yīng)，細胞膜透性增大，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率增大。在濃度為0.4%～1.0%時，相對電導(dǎo)率維持在了一個相對穩(wěn)定的水平，表明該濃度下細胞液達到了一個新的平衡，足以抵抗逆境脅迫，從而不會對二月蘭造成嚴重傷害。同樣，在濃度為1.2%出現(xiàn)第2個小高峰，表明細胞內(nèi)含物出現(xiàn)較大程度的外滲，從而造成相對電導(dǎo)率的增大。在1.2%～1.6%濃度時維持在了一個新的平衡，表明經(jīng)過再次緩沖和自我調(diào)節(jié)后，二月蘭細胞液又維持在了新的耐鹽水平上。在脅迫濃度達到1.8%時，相對電導(dǎo)率迅速上升，表明細胞液電解質(zhì)濃度明顯增大，這可能是導(dǎo)致二月蘭萌動種子半致死的主要原因。在2.0%時，相對電導(dǎo)率持續(xù)上升，達到74.8%，此時大部分試材出現(xiàn)死亡，這也正是二月蘭萌動種子單鹽脅迫下的臨界劑量。

圖版2 復(fù)鹽脅迫下二月蘭萌動種子生長狀況

2.3.2 復(fù)鹽脅迫對二月蘭游離脯氨酸含量和相對電導(dǎo)率的影響

復(fù)鹽脅迫下，游離脯氨酸含量隨鹽脅迫濃度呈先上升后下降趨勢(圖2)。在濃度低于0.6%時，游離脯氨酸含量緩慢上升，這表明隨著鹽脅迫的遞進，二月蘭細胞內(nèi)游離脯氨酸逐漸積累。在濃度為0.6%時達到一個轉(zhuǎn)折點，在濃度大于0.6%時，游離脯氨酸含量上升速度加快，在濃度為0.8%時達到最大值(11.71μg/g)，約為空白對照的7倍，0.6%～0.8%濃度正是二月蘭萌動種子復(fù)鹽脅迫下的臨界劑量。當(dāng)脅迫濃度升高到1.0%時，游離脯氨酸含量迅速下降，這可能是細胞內(nèi)催化其降解的酶活性受到不同程度的限制[12]，此時試材已大量死亡。

相對電導(dǎo)率在0.2%濃度時出現(xiàn)小高峰，隨后下降，在0.4%濃度時出現(xiàn)低谷，緊接著持續(xù)快速穩(wěn)定上升，表明在復(fù)鹽脅迫下，二月蘭萌動種子細胞反應(yīng)比單鹽脅迫更加迅速，而后細胞膜通過自身調(diào)節(jié)通透性緩解了脅迫壓力，當(dāng)脅迫濃度大于0.4%時，細胞電解質(zhì)呈現(xiàn)出大量的不可逆性外滲，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率持續(xù)穩(wěn)定增大。

2.3.3單鹽及復(fù)鹽脅迫下萌動種子致死性

由表2可看出，在單鹽脅迫下，二月蘭萌動種子的半致死和臨界濃度分別為1.8%和2.0%。在復(fù)鹽脅迫下，萌動種子的半致死濃度為0.6%～0.8%(圖版2-D,E)，臨界濃度為0.8%～1.0%(圖版2-E,F)。從表2中還可以看出，無論是單鹽還是復(fù)鹽脅迫處理，萌動種子的半致死濃度和臨界濃度均高出干種子約0.2%，由此可見，與干種子相比，二月蘭的萌動種子具有更強的耐鹽性。

3 討 論

在常溫貯存條件下，貯存2年與貯存1年的二月蘭種子千粒重、發(fā)芽率、發(fā)芽勢差異均不顯著，二月蘭種子的生活力與貯存年份不存在正相關(guān)關(guān)系，表明發(fā)育良好的二月蘭種子在貯存過程中內(nèi)含物質(zhì)量變化和活力變化均不明顯，貯存2年與貯存1年的種子生活力均較好，這為困難立地下二月蘭的種群繁育和復(fù)蘇奠定了理論基礎(chǔ)。張俊莉在研究2003—2005年種子生活力過程中發(fā)現(xiàn)，雖然2005年種子萌發(fā)力最好，但2003年種子較2004年種子萌發(fā)力好[13]，這與本試驗的研究結(jié)果一致。

不同的鹽分及鹽分組合可能對二月蘭種子及幼苗生長造成不同的影響，試驗選用鹽漬土中廣泛存在的Na+溶液模擬自然環(huán)境下的鹽脅迫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單鹽和復(fù)鹽處理條件下，萌動種子均比干種子耐鹽，半致死和臨界濃度差均達到了0.2%，這可以在種子萌發(fā)期通過人工灑水或自然降雨，使土壤中的鹽濃度稀釋，而使二月蘭的種子萌發(fā)后得以成活。

植物體內(nèi)游離脯氨酸含量在一定程度上可以反映植物在逆境下受傷害的程度，當(dāng)植物受到鹽脅迫時，體內(nèi)會積累大量的游離脯氨酸來維持細胞的正常功能，其含量也會隨著鹽脅迫程度的增大而升高。本試驗中，在單鹽和復(fù)鹽脅迫下，在二月蘭不受到嚴重傷害而失去生命力的情況下，游離脯氨酸含量總體上均呈上升趨勢，與鹽脅迫程度呈正相關(guān)，說明游離脯氨酸對維持細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，提高植物對外界環(huán)境的干擾能力上起到了一定的作用。復(fù)鹽脅迫下，在濃度為1.0%時，游離脯氨酸含量明顯下降，此濃度也是二月蘭萌動種子的臨界濃度，大部分試材死亡。質(zhì)膜相對透性的大小反映植物受傷害的程度，其透性越大，相對電導(dǎo)率越大，植物受傷害的程度越大。二月蘭相對電導(dǎo)率隨鹽脅迫程度的增大大致呈正相關(guān)關(guān)系，單鹽脅迫下，在濃度為0.4%～0.8%和1.2%～1.6%時，存在降低的情況，這可能與植物體內(nèi)脯氨酸等內(nèi)含物的含量增加有關(guān)，在受到脅迫失水時，會主動吸收可溶性物質(zhì)來調(diào)節(jié)細胞滲透壓[14]，降低外滲液濃度以減輕傷害。在鹽脅迫下，本實驗得出的游離脯氨酸含量和相對電導(dǎo)率變化與半致死脅迫濃度和臨界脅迫濃度相一致。

[1]謝振宇,楊光穗.牧草耐鹽性研究進展[J].草業(yè)科學(xué),2003,20(8):11-17.

[2]楊勁松.中國鹽漬土研究的發(fā)展歷程與展望[J].土壤學(xué)報,2008,45(5):837-845.

[3]牛東玲,王啟基.鹽堿地治理研究進展[J].土壤通報,2002,3(6):449-455.

[4]趙秋,高賢彪,吳迪,等.越冬綠肥二月蘭耐鹽能力及在鹽堿耕地上的培肥效果[J].中國土壤與肥料,2010(4):65-68.

[5]羅鵬,李義文,黃邦全.優(yōu)質(zhì)油料種源諸葛菜[J].中國油料,1993(4):73-75.

[6]劉旻.白菜和白菜型油菜與諸葛菜雜種及后代的遺傳研究[D].湖北:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[7]吳林園.四種形態(tài)類型諸葛菜的遺傳多樣性分析[D].安徽:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[8]吳岱鑣.地被綠化植物二月蘭的生物學(xué)研究[D].湖南:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[9]劉佳.二月蘭的營養(yǎng)特性及其綠肥效應(yīng)研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

[10]潘秀秀.二月蘭種子及幼苗抗旱性和耐鹽堿性研究[D].黑龍江:東北林業(yè)大學(xué),2011.

[11]李合生,孫群,趙世杰,等.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2000．

[12]謝虹,楊蘭,李忠光.脯氨酸在植物非生物脅迫耐性形成中的作用[J].生物技術(shù)通報,2011(2):23-27.

[13]張俊莉.二月蘭遺傳多樣性研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2008:33-38.

[14]張小艾,李名揚,汪志輝,等.重金屬及鹽堿對二月蘭幼苗生長和生理生化的影響[J].草業(yè)學(xué)報,2013,22(2):187-194.

Studies on Viability and Salt Tolerance inOrychophragmusviolaceusSeeds

ZHUPengfang,PANZhichao,ZHANGJiahui
( College of Forestry, Shenyang Agricultural University,Shenyang Liaoning 110866，China)

This paper studied seeds germination rate and energy under different harvest years,and focused on fatality rates and salt tolerance mechanism of dry and germinated seeds.The results showed that seeds stored two years and one year were both very good.Compared to dry seeds,germinated seeds tolerated higher salt content.The median lethal and critical concentrations of dry seeds were 1.6% and 1.8%,respectively,while the median lethal and critical concentration of germination seeds were 1.8% and 2.0%,respectively,under single salt stress.Under the double salt stress,the median lethal and critical concentrations of dry seeds were 0.4%-0.6% and 0.6%-0.8%,respectively,while the median lethal and critical concentration of germination seeds were 0.6%-0.8% and 0.8%-1.0%,respectively.In the process of dry seed germination,the germination peak delayed and the germination rate declined with the increase of salt stress.The content of free proline showed a trend of continuous increase when single salt stress,while rose firstly and then fall down under double salt stress.The relative conductivity both presented ascending trends under single and double salt stresses with different small peaks.

seeds ofOrychophragmusviolaceus; viability; salt stress; critical concentration;mechanism of salt tolerance

2016-04-10

祝朋芳(1971-)，女，遼寧朝陽人；博士，教授，主要從事園林植物遺傳育種研究工作；E-mail:pfz2013@126.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.046

S 688.4

A

1001-4705(2016)09-0046-05