， ， ， ， ， (1.貴州省生物技術研究所, 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室, 貴陽 550006；.六盤水師范學院生命科學系, 貴州 水城 55006； .貴州省現(xiàn)代中藥材研究所, 貴陽 550006；5.貴州省農(nóng)業(yè)科學院, 貴陽 550006)

西南地區(qū)市場冰球子分子鑒定

朱英1,2，楊友聯(lián)3，黃永會1,2，劉永翔1,2，張麗娜4，劉作易2,5
(1.貴州省生物技術研究所, 貴陽 550006； 2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室, 貴陽 550006；3.六盤水師范學院生命科學系, 貴州 水城 553006； 4.貴州省現(xiàn)代中藥材研究所, 貴陽 550006；5.貴州省農(nóng)業(yè)科學院, 貴陽 550006)

利用rDNA ITS和葉綠體trnL-F序列，對17份西南地區(qū)冰球子進行分子鑒定。采用改進CTAB法提取獨蒜蘭葉片基因組DNA，利用通用引物ITS 1和ITS 4以及引物trnL-F對其DNA中rDNA ITS區(qū)和葉綠體trnL-F序列進行擴增，對目的片段進行測序并對測序結果進行聚類分析。結果表明，17份西南獨蒜蘭代表3個種，即云南獨蒜蘭、獨蒜蘭和一未定種，藥源基本可靠。

rDNA ITS序列；trnL-F序列； 獨蒜蘭屬； 蘭科植物

獨蒜蘭屬(Pleione)為蘭科植物中具觀賞價值和藥用價值的一個屬，全屬約20個種，我國有16個種。獨蒜蘭屬一般為陸生、巖生或附生，主要分布于我國長江流域及以南的廣大地區(qū)。民間以假鱗莖入藥，有清熱解毒、消腫散結、化痰止咳之功效，用以治瘡癤癰腫、毒蛇咬傷。2010版《中華人民共和國藥典》中將獨蒜蘭與云南獨蒜蘭合稱冰球子列入山慈菇藥材項下。西南地區(qū)藥材市場常有冰球子鮮品出售，但由于僅有藥用部分假鱗莖而無花等重要形態(tài)鑒定依據(jù)，極難準確判定藥源的可靠性。

獨蒜蘭資源種類較多，單純依靠傳統(tǒng)的形態(tài)學方法難以做出精確鑒別。由于ITS序列進化極快，近年來已廣泛用于中藥材以及蘭科的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關系分析[1-2]。而由于植物線粒體基因進化速率較慢、遺傳分化小，而核基因又存在多拷貝、種內變異大、引物通用性差的特性，因此植物學家們最終選定葉綠體基因展開了有關植物DNA條形碼的研究，但目前尚未找到理想的植物DNA條形碼。葉綠體基因組DNA中trnL-F基因內的非編碼區(qū)，其進化速度較快，高度保守，對高度降解的DNA樣本仍可以進行有效擴增[3]。本研究采用ITS和trnL-F序列產(chǎn)物直接測序的方法，對17份西南地區(qū)市場出售的冰球子進行分析，以考證藥源的基本情況，并為獨蒜蘭屬植物系統(tǒng)發(fā)育研究、分類鑒定提供理論依據(jù)。

表1 供試的17份獨蒜蘭材料

編號材料名稱采集地編號材料名稱采集地編號材料名稱采集地1云南云南8涼山6四川18楚雄1云南2涼山1四川9麗江1云南19楚雄2云南3涼山2四川10麗江2云南20其它1云南或四川5涼山3四川11麗江3云南21其它2云南或四川6涼山4四川13雷山1貴州22其它3云南或四川7涼山5四川17雷山2貴州

表2 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的獨蒜蘭屬植物及相近屬植物的rDNA ITS區(qū)序列

種名 登錄號 種名 登錄號 種名 登錄號P．saxicolaC369AF461492．1P．pleionoidesC308AF461480．1P．formosanaC320AF461485．1P．hookerianaC322AF461468．1P．formosanaC319AF461486．1P．formosanaPF?10EU100755．1P．grandifloraC327AF461475．1P．formosanaPF?2EU100747．1P．formosanaPF?9EU100754．1P．grandifloraC325AF461473．1P．formosanaPF?13EU100758．1P．scopulorumC408AF461471．1P．chuniiC311AF461467．1P．formosanaPF?11EU100756．1P．humilisC409AF461495．1P．grandifloraC307AF461477．1P．formosanaPF?3EU100748．1P．coronariaC407AF461470．1P．forrestiiC321AF461478．1P．formosanaPF?15EU100760．1P．yunnanensisC310AF461487．1P．limprichtiiC317AF461489．1P．formosanaPF?1EU100746．1P．praecoxC368AF461491．1P．bulbocodioidesC313AF461482．1P．formosanaPF?14EU100759．1P．formosanaAF302740．1P．pleionoidesC309AF461481．1P．formosanaPF?8EU100753．1P．bulbocodioidesAF302739．1P．bulbocodioidesC312AF461483．1

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于實驗的17份獨蒜蘭材料由貴州省現(xiàn)代中藥材研究所提供(表1)，該所從各地區(qū)藥材市場采購假鱗莖鮮品后種植于貴州省農(nóng)業(yè)科學院中藥材試驗地。

1.2 DNA提取

取獨蒜蘭的幼嫩葉片，參照陶剛等[4]的方法提取DNA。用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測總DNA質量及完整性。

1.3 rDNA ITS序列擴增及純化測序

ITS片段擴增采用通用引物ITS 1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS 4(5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′)，trnL-F序列擴增引物(5′-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3′)和(5′-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′)，由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。擴增反應體系為25μL，各種成分終濃度為Beffer(1×)、MgCl2(2.5 mmol/L)、dNTP Mix(0.5 mmol/L each)、Taqese(1 U)、Primer(0.25 mmol/L each)、DNA(2.0 ng/μL)。PCR反應體系在ABI公司9700型PCR儀上進行，ITS-PCR按照如下流程進行擴增反應：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性60 s，60 ℃復性40 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，8 ℃保溫。trnL-F-P C R擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 S；54 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 S；30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒(俄羅斯Biomed公司)純化后直接用于測序(測序反應由上海英駿生物技術有限公司完成，測序儀器為ABI 3730 DNA測序儀)。

1.4 序列分析

將得到的供試獨蒜蘭材料ITS和trnL-F序列以及來自GenBank與之近似的序列(表2、表3)一起用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析。通過Clustal-X 1.81[5]軟件包對近似序列進行比對，再運用BioEdit version 5.0.9對比對結果進行手工校正，把上述處理的序列數(shù)據(jù)通過PAUP*4.0 beta 10[6]軟件包，使用最大簡約法分析(Maximum Parsimony Analysis,MP)構建系統(tǒng)發(fā)育樹(MP tree)，通過1 000步重復獲得的自展檢驗 (Bootstrap) 數(shù)值標記在分支上。

表3 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的獨蒜蘭屬植物及相近屬植物的葉綠體trnL-F堿基序列

種名 登錄號 種名 登錄號 種名 登錄號P．yunnanensisC3(22)AF503725．1P．pleionoidesC3(21)AF503720．1P．hookerianaC32(26)AF503714．1P．bulbocodioides(19)AF503707．1P．formosanaC314(24)AF503711．1P．grandifloraC3(27)AF503713．1P．limprichtiiC3(18)AF503717．1P．chuniiiC311(23)AF503726．1P．praecoxSBB04(28)AF503719．1P．pleionoidesC3(20)AF503721．1P．hookerianaC40(25)AF503715．1

2 結果與分析

在根據(jù)ITS序列構建的獨蒜蘭屬系統(tǒng)樹中，材料13與云南獨蒜蘭(Pleioneyunnanensis)聚為一進化支，支持率為87%；材料1、材料2等16份材料與獨蒜蘭(P.bulbocodioides)、四川獨蒜蘭(P.limprichtii)和美麗獨蒜蘭(P.pleionoides)親緣關系較近，構成一進化支，但支持率低于50%，其中，材料2等13份材料在該進化支中聚為一亞進化支，支持率為53%(圖1)。

圖1 根據(jù)ITS 1-5.8S-ITS 2序列構建的MP樹，顯示獨蒜蘭材料與相近種參考序列的系統(tǒng)發(fā)育關系。分支顯示大于50%的Bootstrap值。

在據(jù)于葉綠體trnL-F序列構建在系統(tǒng)樹中，材料13與ITS構建的系統(tǒng)樹一樣，與云南獨蒜蘭(Pleioneyunnanensis)聚為一進化支，支持率亦為87%；材料17獨立構成一進化支；材料2等15個材料與獨蒜蘭聚為一進化支，支持率為86%，在該進化支中材料2等13份材料聚為一亞進化支，支持率為60%。

結合ITS、trnL-F構建的系統(tǒng)樹，可確定13號(雷山1號)材料為云南獨蒜蘭，17號(雷山2號)目前暫不能定種，其余15份材料為獨蒜蘭。

圖2 根據(jù)葉綠體trnL-F堿基序列構建的MP樹，顯示獨蒜蘭材料與相近種參考序列的系統(tǒng)發(fā)育關系。分支顯示大于50%的Bootstrap值。

3 結論與討論

由于獨蒜蘭屬種質資源較為豐富、起源馴化途徑多樣、栽培歷史悠久、各地引種現(xiàn)象普遍，導致品種資源類型多且名稱較亂，供試的17份獨蒜蘭種質收集于西南地區(qū)，對其真正的親緣關系不完全清楚。而在親緣關系鑒定上，由于受環(huán)境和栽培措施以及各生長發(fā)育階段等條件的影響，通過植物學、農(nóng)藝性狀或同工酶等手段不易達到鑒別的目的，在評價時具有一定的局限性。分子標記方法為生物資源鑒定評價提供了新的途徑。從ITS和葉綠體trnL-F序列構建的系統(tǒng)樹來看(圖1、圖2)，葉綠體trnL-F序列優(yōu)于ITS序列，分辨率更高。在ITS序列構建的系統(tǒng)樹中，參與分析的該屬多數(shù)近緣種不能有效區(qū)分。

西南地區(qū)藥材市場銷售冰球子藥源總體趨勢較好，除購自雷山的17號材料為非藥典收錄的外，其余16份均為獨蒜蘭或云南獨蒜蘭，其中主要為獨蒜蘭。17號材料目前不能有效定種，一方面是因為目前對獨蒜蘭屬分子鑒定研究較少，可比對的序列有限，其二是形態(tài)上往往難以區(qū)分，故建議加強對該屬的形態(tài)及分子系統(tǒng)學研究。對購自雷山的“冰球子”需引起重視，就目前不知其具體種名，對其藥理及毒性等無法確切考證，勢必造成潛在的危險。

[1]汪小全,洪德元.植物分子系統(tǒng)學近五年的研究進展概況[J].植物分類學報,1997,35(5):465-480.

[2]ZHANG Ming-Yong,SUN Cai-Yun,HAO Gang,et al.A Preliminary Analysis of Phylogenetic Relationships in Cymbidium (Orchidaceae)Based on nrITS Sequence Data[J].Acta Botanica Sinica,2002,44(5):588-592.

[3]Taberlet P,Gielly L,Pautou G,et al.Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J].Plant Molecular Biology,1991(17):1 105-1 109.

[4]陶剛,朱英,劉作易,等.野生黃花白芨的組織快繁及分子鑒定[J].種子,2008,27(8):22-24.

[5]Thompson J D,Gibson T J,Plewniak F,et al.The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic acids research,1997,25(24):4 876-4 882.

[6]Swofford D.L.“PAUP*.Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods).Version 4.”Sinauer Associates, Sunderland,Massachusetts,2003.

Molecular Identification of Bingqiuzi from Market in Southwest China

ZHUYing1,2,YANGYoulian3,HUANGYonghui1,2,LIUYongxiang1,2,ZHANGLi’na4,LIUZuoyi2,5
(1.Guizhou.Institute of Biotechnology,Guiyang 550006，China；2.The Key Laboratory for Agri. Biotechnology of Guizhou,Guiyang 550006，China；3.Department of Life Science，Liupanshui Normal College，Shuicheng 553006，China；4.Guizhou Institute of Modern Chinese Medicinal Materials,Guiyang 550006，China；5.Guizhou Academy of Agri.Sci,Guiyang 550006,China)

The rDNA ITS and chloroplasttrnL-F sequences were applied to molecularly identify 17 pleione in southwest China.The genomic DNA of pleione was extract from leaves with the improved CTAB method.Then,the rDNA ITS and chloroplasttrnL-F in the DNA were amplified with universal primers ITS 1 and ITS 4 and primertrnL-F separately.The expected fragments were sent to sequece and the results for cluster analysis showed that 17 pleione represent three species,Pleioneyunnanensis,P.bulbocodioidesand an unknown species,suggesting that the medicinal resouces of Bingqiuzi in Southwest China was basicly reliable.

rDNA ITS sequences;trnL-F sequences;Pleione; orchid.

2016-05-20

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目(編號：黔科合社字[2009]5036號)；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目(編號：黔科合中藥字[2011]5039號)；貴州省科研機構創(chuàng)新能力建設專項(編號：黔科合院所創(chuàng)能[2010]4002)；貴州省農(nóng)業(yè)科學院資助項目(編號：黔農(nóng)科合(創(chuàng)新基金)2012001號)；貴州省農(nóng)業(yè)科學院基金項目(編號：黔農(nóng)科合(基金)2011021)。

朱 英(1977—)，女，副研究員，主要從事貴州優(yōu)質作物種質資源及重要功能基因的研究；E-mail：hawk2309@163.com。

劉作易，教授，博士；E-mail：gzliuzuoyi@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.09.012

S 567

A

1001-4705(2016)09-0012-04