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(1.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省遵義市龍馳生物科技有限公司， 貴州 遵義 563100)

第3代雜交狼尾草優(yōu)質(zhì)種苗快速繁育技術(shù)研究

劉紅美1，李玉權(quán)1，石建龍2，方小波2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院， 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省遵義市龍馳生物科技有限公司， 貴州 遵義 563100)

建立了第3代雜交狼尾草優(yōu)質(zhì)種苗快速繁育技術(shù),即選用雜交狼尾草頂芽為材料, MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+3%白砂糖為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+3%白砂糖為繼代增殖培養(yǎng)基，1/2 MS+NAA 0.2 mg/L為生根壯苗培養(yǎng)基，用市售育苗基質(zhì)和漂盤進(jìn)行馴化栽培，成活率高達(dá)95%以上，整個(gè)育苗周期為180 d左右，降低了成本，縮短了育苗周期。

雜交狼尾草； 種苗； 快速繁育

雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpu-reum)是美洲狼尾草和象草的雜種一代，屬禾本科，是畜牧專家推薦的在淮北地區(qū)目前產(chǎn)量最高的夏季牧草，其特性為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，再生能力強(qiáng)，可多次刈割，無(wú)病蟲害，羊、牛、兔、鵝、魚等草食動(dòng)物喜食，既可鮮喂，也可青貯[1]。第3代雜交狼尾草蛋白質(zhì)含量較前2代更高，適應(yīng)地區(qū)范圍較廣，而且光合作用效率強(qiáng)，生物產(chǎn)量高。隨著精準(zhǔn)扶貧政策的推進(jìn)，養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，市場(chǎng)對(duì)產(chǎn)量高的第3代雜交狼尾草優(yōu)質(zhì)種苗需求量大。但是，雜交狼尾草屬于熱帶和亞熱帶植物，因此有些地區(qū)只能靠溫室保護(hù)種苗越冬，不能自然越冬，只能1 年生栽培；另外其種子敗育，不能結(jié)實(shí)[2]，只能通過(guò)莖節(jié)扦插繁育方式育苗，所以對(duì)母本的需求量較大，不利于快速繁殖。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是建立在無(wú)菌操作基礎(chǔ)之上的一個(gè)高新生物技術(shù)，是保護(hù)瀕危植物及快速繁殖特色農(nóng)作物的有效手段[3]。該技術(shù)的關(guān)鍵是無(wú)菌體的獲得和高繁殖倍數(shù)的增殖體系。綜合魏進(jìn)莉等[4]、謝妤等[5]研究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選用雜交狼尾草的頂芽(莖尖)作為實(shí)驗(yàn)材料，建立了快速繁育第3代雜交狼尾草優(yōu)質(zhì)種苗的技術(shù)體系，能在短時(shí)間繁育大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗，從而滿足市場(chǎng)需求。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與所需培養(yǎng)基

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

第3代雜交狼尾草,由貴州雙高畜牧有限公司提供。

1.1.2 所需培養(yǎng)基

叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+3%白砂糖+0.45%瓊脂，pH值5.80～6.00；

繼代增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+3%白砂糖+0.45%瓊脂， pH值5.80～6.00；

生根壯苗培養(yǎng)基：1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+3%白砂糖+0.45%瓊脂，pH值5.80～6.00。

3種培養(yǎng)基在121 ℃下滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體滅菌與叢芽誘導(dǎo)

將采集的雜交狼尾草頂芽在流水下沖洗20 min除去雜質(zhì)，用75%酒精溶液浸泡10 s進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5次，重復(fù)2次升汞消毒，放置有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中晾干待用。

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用無(wú)菌刀片切去頂芽前端葉片，然后用無(wú)菌鑷子剝離莖尖，將莖尖接種到叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，作好標(biāo)記，置培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度23～27 ℃，光照強(qiáng)度1 800 lx，光照時(shí)間12 h/d，保持濕度80%左右。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng)

將1.2.1誘導(dǎo)出的新芽進(jìn)行分切，以每瓶10株接種到繼代增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度23～27 ℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光照時(shí)間12 h/d，保持濕度80%左右。

1.2.3 生根壯苗培養(yǎng)

將步驟1.2.2中培養(yǎng)30 d左右的苗進(jìn)行分切，以每瓶10株接種到生根壯苗培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為溫度23～27 ℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光照時(shí)間12 h/d，保持濕度70%左右。

1.2.4 馴化栽培

將在生根壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后的狼尾草種苗進(jìn)行馴化栽培，所用馴化栽培基質(zhì)為遵義市龍馳生物科技有限公司研發(fā)的育苗基質(zhì)(已申請(qǐng)專利)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌與叢芽誘導(dǎo)

消毒后的狼尾草頂芽(莖尖)接種到叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中7～10 d，可觀察到頂芽伸長(zhǎng)，葉片展開，15 d左右開始有不定芽出現(xiàn)，30 d后可見有4～5個(gè)叢生芽。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，葉片開始出現(xiàn)枯黃(圖1)。

圖1 叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d生長(zhǎng)情況

2.2 繼代增殖培養(yǎng)

將叢芽誘導(dǎo)基中培養(yǎng)30 d后，葉片開始出現(xiàn)枯黃的芽進(jìn)行切割，剝?nèi)ネ鈱影?，切去頂端葉片，接種到繼代增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d左右，又有新芽形成(圖2)。30 d左右，叢生芽倍數(shù)可高達(dá)6倍。反復(fù)多次進(jìn)行繼代增殖，種苗數(shù)量將得到指數(shù)級(jí)增加。

2.3 生根與壯苗培養(yǎng)

將繼代增殖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)30 d左右的健壯芽切下，接種到大量元素減半的、只含有少量生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中，5 d左右可見有根生成,苗生長(zhǎng)健壯，15 d左右即可進(jìn)行種苗馴化。

2.4 組培苗馴化栽培

選擇生長(zhǎng)健壯苗高為6～8 cm、根有3～4條的狼尾草幼苗進(jìn)行馴化移栽：先將組培苗置育苗溫室進(jìn)行瓶?jī)?nèi)煉苗2～3 d，然后去瓶蓋1～2 d，讓組培苗逐漸適應(yīng)溫室環(huán)境；隨后用鑷子輕輕夾出組培苗，洗去多余的培養(yǎng)基，移栽于160孔漂盤，所用基質(zhì)為遵義市龍馳生物科技有限公司研發(fā)的育苗基質(zhì)，覆蓋保鮮膜保持濕度90%以上。10 d后，打開保鮮膜，按正常規(guī)定管理；15 d噴1次營(yíng)養(yǎng)液和殺菌劑，成活率達(dá)95%以上；30 d后，苗即可移栽大田。

圖2 繼代增殖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的狼尾草幼苗

3 討 論

3.1 外植體滅菌與消毒劑的選擇

狼尾草組織培養(yǎng)中選常用的外植體有莖節(jié)(側(cè)芽)，頂芽(莖尖)。由于受內(nèi)生菌的影響，莖節(jié)外植體污染較大，而頂芽由于生長(zhǎng)快，消毒容易。在消毒劑的選擇上，表面消毒劑酒精使用時(shí)間要盡量短，控制在20 s以下，時(shí)間過(guò)長(zhǎng),部分頂芽會(huì)變褐死亡。采用次氯酸鈉2次滅菌，污染率也達(dá)10%左右，而且苗的長(zhǎng)勢(shì)較弱。選擇消毒穿透能力強(qiáng)的升汞，并分2次滅菌，污染率在5%以下。

3.2 繼代增殖培養(yǎng)

禾本科植物種苗繁育大多走愈傷誘導(dǎo)、再分化途徑。本實(shí)驗(yàn)中，芽的誘導(dǎo)對(duì)培養(yǎng)基激素種類和比例要求不嚴(yán)。而在繼代增殖階段，所用激素種類和配比將嚴(yán)重影響到增殖倍數(shù)和繼代時(shí)間。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了細(xì)胞分裂素6-BA、生長(zhǎng)素NAA、IBA不同濃度配比的繼代增殖培養(yǎng)基。當(dāng)6-BA與NAA成濃度比例時(shí)，利于苗的生長(zhǎng)和生根；當(dāng)6-BA與IBA成濃度比例時(shí)，更有利于叢生芽的增殖培養(yǎng)。在MS+6-BA 2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+3%白砂糖培養(yǎng)基中苗不僅生長(zhǎng)健壯,而且增殖倍數(shù)在5倍以上。另外, 若不將老枯或褐化的葉片和組織處理干凈，會(huì)影響苗的生長(zhǎng)，使培養(yǎng)基產(chǎn)生色素。

整個(gè)繁育體系周期為5個(gè)月左右，此體系繁育狼尾草優(yōu)質(zhì)種苗比較穩(wěn)定，可以使莖節(jié)扦插繁殖效率變高、周期變短，并且在較短時(shí)間里獲得更大量的小苗。該體系的建立對(duì)促進(jìn)狼尾草人工栽培產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

[1]王寶全,左福元,曾子健,等.雜交狼尾草莖桿無(wú)性繁殖技術(shù)研究[J].四川畜牧獸醫(yī),2002,29(1):23-24.

[2]王憑青,段傳人,王伯初,等.雜交狼尾草不同外植體材料組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[J].重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,28(6):118-120.

[3]鞏振輝,申書興.植物組織培養(yǎng)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2011.

[4]魏進(jìn)莉,李麗芳,于學(xué)斌.紫葉狼尾草的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].植物生理學(xué)報(bào),2015,51(2):207-211.

[5]謝妤,張子雯.雜交狼尾草離體培養(yǎng)植株再生體系的建立[J],宜春學(xué)院學(xué)報(bào),2012,34(12):97-99.

(本欄目責(zé)任編輯：周忠燕)

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Study on Plantlet Regeneration System ofPennisetumPureumX P.Purpureum

LIUHongmei1，LIYuquan1，SHIJianlong2，F(xiàn)ANGXiaobo2

2016-07-26

劉紅美(1975—)，女，貴州人；博士，副教授，研究方向：藥用植物生物技術(shù)及病害防治研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.121

S 54

A

1001-4705(2016)12-0121-03