， ，

(鄭州大學(xué)河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450000)

離子束介導(dǎo)小麥變異材料貯藏蛋白及農(nóng)藝品質(zhì)性狀分析

韓利濤，谷運(yùn)紅，焦湞

(鄭州大學(xué)河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450000)

離子束誘導(dǎo)技術(shù)是一項(xiàng)非常有效的致使植物突變的技術(shù)，為提高小麥的品質(zhì)性狀，采用離子束介導(dǎo)外源全基因組的方法，轉(zhuǎn)化選育出一批有價(jià)值的小麥變異材料。本研究對這批小麥變異材料的農(nóng)藝性狀、品質(zhì)性狀、各貯藏蛋白組分進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)變異材料的株高、千粒重、葉面積、濕面筋、SDS沉淀值、蛋白含量與對照相比均有明顯的變化，并達(dá)到顯著差異水平，但有一些變異材料存在抗病性不好或蛋白含量高但是品質(zhì)不好的問題，需進(jìn)一步的改進(jìn)。變異材料的各蛋白組分含量與對照相比均有明顯的差異且蛋白含量、濕面筋含量都有明顯增加的趨勢。研究結(jié)果表明，離子束介導(dǎo)技術(shù)產(chǎn)生豐富的變異，而且變異情況與基因受體密切相關(guān)，需要對這批變異材料進(jìn)行進(jìn)一步的特定培育，從而選育出種質(zhì)資源良好、蛋白含量高且質(zhì)量好的品種。

離子束介導(dǎo)； 農(nóng)藝品質(zhì)性狀； 貯藏蛋白

小麥?zhǔn)侨蠊任镏?主要的糧食作物[1-2]，在世界各地廣泛種植。小麥生產(chǎn)與經(jīng)濟(jì)發(fā)展、社會(huì)穩(wěn)定和國家安全息息相關(guān)[3]。我國的小麥產(chǎn)量雖然逐年上升，但是品質(zhì)質(zhì)量不容樂觀，其品質(zhì)特性還有待進(jìn)一步優(yōu)化[2]。離子束誘變技術(shù)是由中科院等離子體所余增亮[4-6]研究員發(fā)現(xiàn)的，是一種非常有效的致使植物突變的手段[7]，擁有較高的突變率和更寬的突變譜[8]，是選育作物新品種的重要途徑[9-11]。采用離子束介導(dǎo)的方法將N+注入受體溫六(溫麥六號(hào))的種子，然后將受體種子浸泡在供體燕麥六倍體小黑麥的全基因組DNA中,經(jīng)過多年選育，獲得一批非常有價(jià)值的變異材料。本試驗(yàn)以其中的一批特殊的變異材料為研究對象，對其農(nóng)藝性狀及品質(zhì)性狀進(jìn)行調(diào)查分析，并對對照、親本、變異材料的蛋白含量進(jìn)行比對分析，以此來探討離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化對變異材料的農(nóng)藝品質(zhì)性狀和蛋白影響問題，從而篩選出特定的抗自然災(zāi)害性好、蛋白含量高的株系，也證明離子束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)可以應(yīng)用在植物遺傳育種上，為遺傳工作者提供新的思路。

圖1 離子束介導(dǎo)小麥變異材料收獲種子對比(從左至右依次為E 101～E 109)

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料為2004年用離子束介導(dǎo)的方法將N+注入受體溫麥六號(hào)(3×1017N+/cm2)，然后將受體種子浸泡在供體燕麥(150μg/mL)、六倍體小黑麥(200μg/mL)的全基因組DNA中，浸泡24 h后將試驗(yàn)種子播種在試驗(yàn)田中。按照常規(guī)育種方法，經(jīng)過多年的選育獲得一批變異材料，為研究方便，選取其中一批材料，如表1，圖1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 變異材料農(nóng)藝性狀調(diào)查

2014—2015年種植于鄭州大學(xué)新鄉(xiāng)小麥試驗(yàn)田。播種規(guī)格為E 102與E 103兩個(gè)親本各種4行，其余材料各種8行，行長2.0 m，行距25.0 cm，株距3.0 cm。調(diào)查葉綠素(2015年4月21日，每個(gè)材料測5株，每株測3次)、葉面積(2015年4月25日，每個(gè)材料測5株，每株測3次)、株高、穗型、穗長、穗數(shù)、千粒重等指標(biāo)，其中葉綠素含量指標(biāo)采用SPAD值計(jì)算，采用的儀器為日本產(chǎn)SPAD-502 pIus型便攜式葉綠素儀，SPAD值可以預(yù)測籽粒成熟期蛋白質(zhì)含量[9]。

1.2.2 變異材料品質(zhì)性狀調(diào)查

蛋白含量(干基)、水分、容重、吸水率利用FOSS 公司的NIRS 5000 近紅外品質(zhì)分析儀和WINISI軟件進(jìn)行光譜的采集和測定。SDS沉淀值和濕面筋含量及濕面筋指數(shù)在周口市農(nóng)科院測量。

1.2.3 變異材料貯藏蛋白含量測定

變異材料貯藏蛋白的提取分離參照Herbert Wieser[13]，Verbruggen I M[14]楊學(xué)舉[15]等的方法并有所改進(jìn)，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法按照清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、麥谷蛋白的順序[16]測定各蛋白組分的含量，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

表1 離子束介導(dǎo)小麥變異材料

編號(hào)組合E101(受體)溫六E102(供體)燕麥E103(供體)六倍體小黑麥E104溫六/燕麥E105溫六/燕麥E106溫六/燕麥E107溫六/六倍體小黑麥E108溫六/燕麥E109溫六/燕麥

取0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)牛血清溶液分別加入試管中，各加重蒸水1 mL和考馬斯亮藍(lán)G-250試劑5 mL，蓋上塞子搖勻，放置3 min，于595 nm波長下測量吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。

圖3 對照與部分變異材料穗型對比(從左至右依次為E 101～E 109)

表2 離子束介導(dǎo)小麥變異材料的農(nóng)藝性狀差異性分析(Mean±SD)

編號(hào)株高(cm)穗長(cm)芒長(cm)千粒重(g)葉綠素含量(%)E10170．33±1．128．87±0．476．67±0．8148．13±0．1355．30±1．04E102159．00±3．1312．10±0．264．83±1．1427．71±0．0344．80±0．98E103111．33±1．1513．47±0．909．43±0．4732．13±0．1763．37±0．47E10499．33±2．89??11．63±0．87?5．10±0．2654．25±2．84??53．60±2．36E10550．33±1．15??9．53±0．255．00±0．3544．02±1．7166．40±0．50??E10688．00±1．52??11．40±0．46?4．47±0．5544．57±0．81?56．50±0．75E10765．33±1．009．40±0．877．33±0．3152．66±0．11??57．10±0．66?E10868．67±1．7313．43±1．08??6．57±1．2347．7±2．6562．60±1．66??E10961．00±2．31?7．33±0．964．83±0．38??50．25±0．96?56．53±2．00

注：“*”和“**”分別表示0.05和0.01顯著水平。下同。

圖2 考馬斯亮藍(lán)G-250法測定貯藏蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 變異材料主要農(nóng)藝性狀分析

對種植于鄭州大學(xué)新鄉(xiāng)小麥試驗(yàn)田的變異材料進(jìn)行農(nóng)藝及品質(zhì)性狀測量分析，發(fā)現(xiàn)部分變異材料的葉面積與穗型與對照相比發(fā)生了明顯變化(圖3、圖4)。隨機(jī)選取變異材料株系5株，測量葉綠素、葉面積、株高、穗長等性狀，每株測3次，記錄數(shù)據(jù)(表2)。

用SPSS軟件對變異材料的株高、穗長、千粒重等指標(biāo)進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)這一批變異材料與對照相比發(fā)生了顯著的變化。E 105和E 108的SPAD值與對照相比極顯著增加。在株高方面，變異材料E 104、E 106與對照相比極顯著增加，其中E 104高達(dá)99.33 cm，而E 105極顯著降低，只有50.33 cm， E 109與對照相比顯著降低；在穗長方面，材料E 104、E 106、E 108與對照相比均有一個(gè)極顯著增加的水平，分別增長了31.12%、28.52%和51.41%，有一個(gè)增加的趨勢；材料E 104、E 105、E 106和E 109在芒長方面與對照相比極顯著降低；材料E 109在千粒重方面與對照相比顯著增加，材料E 104和E 107極顯著增加，分別達(dá)到54.25 g和52.66 g。

由表3可知，對照組E 101的穗數(shù)均值為12.50，材料E 109有一個(gè)最大的穗數(shù)值，高達(dá)22.00，最小值為18，比對照組的最大值大。所以變異材料E 109在穗數(shù)方面較對照組有一定的優(yōu)勢，可用于下一步的遺傳改進(jìn)。

表3 離子束介導(dǎo)小麥變異材料的穗數(shù)分析

編號(hào)最大值最小值極值均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)(%)E101158712．502．4317．74E1022418621．332．4210．36E1032317619．832．5611．79E1042011915．333．1418．70E1052112915．143．4419．47E10620101014．432．4819．20E107149510．860．8213．42E108159610．571．3320．13E1092518722．002．5310．50

圖4 對照與部分變異材料葉面積對比(從左至右依次為E 101、E 103、E 109)

2.2 變異材料主要品質(zhì)性狀分析

變異材料的主要品質(zhì)性狀見表4。由表4可知，材料的干基蛋白質(zhì)含量最小值和最大值分別為13.8%和19.0%，變異材料E 109的蛋白質(zhì)含量達(dá)到最大，與對照相比極顯著增加，除材料E 106外，其余變異材料與對照相比均有明顯的增加。

在吸水率方面，所有變異材料與對照相比均有增加。在濕面筋方面，所有的變異材料均高于對照，其中材料E 109高達(dá)40.4%，明顯高于對照，達(dá)到極顯著水平。說明變異材料在蛋白含量、濕面筋含量、吸水率方面均有明顯的增加趨勢。

以新麥26和鄭麥366為參考，測得所有樣品的SDS沉淀值(表5)。表5中d值為10 min和5 min讀數(shù)的差值，其中d值越小，說明該樣品蛋白質(zhì)量、結(jié)構(gòu)越好，穩(wěn)定時(shí)間越長。當(dāng)dlt;0.5時(shí)，蛋白質(zhì)量最好，d值在0.5～0.8之間的次之，dgt;0.8的為最差。由此可知，變異材料E 104、E 105和E 106的蛋白質(zhì)量最好，材料E 109的蛋白質(zhì)量較差。

表4 離子束介導(dǎo)小麥變異材料主要品質(zhì)性狀

樣品編號(hào)蛋白含量(%)吸水率(%)濕面筋(%)E10113．854．226．4E10214．761．229．7E10315．061．333．0E10414．961．731．7E10514．862．6??31．2E10613．660．027．9E10715．659．332．0?E10814．858．230．1E10919．0??59．040．4??

表5 離子束介導(dǎo)小麥變異材料SDS沉淀值

樣品編號(hào) 5min10min差值d E10197．91．1 E10296．22．8 E1035．85．30．5 E1046．86．20．6 E10576．50．5 E1066．76．20．5 E1078．98．10．8 E1086．35．50．8 E1097．56．41．1 鄭麥366(ck)8．47．11．3 新麥26(ck)7．47．10．3

2.3 變異材料貯藏蛋白分析

變異材料貯藏蛋白含量見表6。由表6可知，變異材料E 106和E 107的清蛋白與對照相比明顯增多(圖5 a)，達(dá)到極顯著水平，E 108和E 109顯著增加；在球蛋白和醇溶蛋白方面，變異材料的蛋白含量均比對照多(圖5 b，c)，所以其面筋的延展性比對照好；在麥谷蛋白方面，受體E 103蛋白含量最低(圖4 d)，為23.23μg，變異材料E 105、E 106、E 107和E 109的蛋白含量與對照相比極顯著增加，其中，E 105的蛋白含量最高(圖5 d)，達(dá)到3.274 1μg/mL。小麥籽粒麥谷蛋白組分越高，小麥的面筋彈性越好，所以變異材料E 105的面筋彈性最好。

表6 離子束介導(dǎo)小麥變異材料貯藏蛋白含量(μg)

樣品編號(hào)清蛋白球蛋白醇溶蛋白麥谷蛋白E101195．28127．86186．11230．87E102298．83161．30131．64138．11E103220．09218．47219．55023．23E104194．74238．96??212．54288．58E105279．41?234．65??284．80??327．41??E106327．41??213．07??207．68310．15??E107322．02??202．29??235．19?307．46??E108275．10?234．65??206．60268．62E109268．09?229．25??208．22309．61??

3 總 結(jié)

圖5 離子束介導(dǎo)小麥變異材料貯藏蛋白含量分析

通過對離子束介導(dǎo)小麥變異材料的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)變異材料的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀與對照相比存在非常明顯的差異變化。在變異材料中E 109株系最高，株高達(dá)99.33 cm，E 105最低，僅為50.33 cm。材料E 104、E 106、E 108在穗長方面與對照相比均有一個(gè)極顯著增加的水平，分別增長了31.12%、28.52%和51.41%。在芒長方面，材料E 104、E 105、E 106和E 109與對照相比極顯著降低，其中材料E 109最短，僅為4.83 cm。材料E 109在千粒重方面與對照相比顯著增加，材料E 104和E 107極顯著增加。

在品質(zhì)性狀方面，變異材料與對照相比也具有明顯的區(qū)別，其中材料E 109的蛋白質(zhì)含量最大，達(dá)到19.0%，與對照相比極顯著增加，所有變異材料的濕面筋含量均高于對照。由表5可以看出，變異材料E 104、E 105和E 106的蛋白質(zhì)量最好，材料E 109的蛋白質(zhì)量較差。

通過變異材料農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀及蛋白分析，發(fā)現(xiàn)離子束介導(dǎo)小麥之后的變異材料均發(fā)生顯著的變化，在培育的過程中發(fā)現(xiàn)變異材料E 109的穗偏短，抗病性和抗蟲性很弱，但是其穗數(shù)多且蛋白含量高;E 108的穗較其它材料來說要大很多， 且E 105的抗銹病能力弱，但是其蛋白品質(zhì)好。下一步需要對這批變異材料作進(jìn)一步的特定培育，從而選育出種質(zhì)資源良好、蛋白含量高且質(zhì)量好的品種。

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Analysis of Storage Protein and Agronomic Traits of Mutanted Wheat by Ion-beam

HANLitao，GUYunhong，JIAOZhen

(Henan Key Laboratory of Ion Beam Bioengineering,Zhengzhou University，Zhengzhou Hen’an 45000，China)

The technology of ion-beam mediation is a very effective method resulting in plant mutation.In order to improve the quality characters of wheat, we adopt the method of ion beam mediated exogenous total DNA,transformed and bred a number of valuable wheat variation materials.Then we analyzed the agronomic traits,quality traits and storage protein of variants,found obvious changes on height,thousand grain weight,leaf area,wet gluten content,SDS sedimentation value and protein content compared the control,and these changes had reached significant difference level.However,there are still some problems on the material whose disease resistance were not well or protein content was high but had not better quality.So these materials need further improvement.The content of storage protein of the variant materials had obvious difference with the control,and the content of protein and wet gluten had obvious increase.These results show that the ion beam mediated process help to produce rich variation,and the variation has a close relation to the receptor gene.we need to cultivate this batch of variation materials,and then breed some variety with good germplasm resources,high protein content and better quality.

ion-beam; agronomic and quality traits; storage protein

2016-07-17

國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：11375154)；國家自然科學(xué)基金(編號(hào)：11405147)；2014年度河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃(編號(hào)：2014 GGJS-009)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：142300413204)。

韓利濤 (1990—)，男，河南中牟人；碩士研究生，主要從事作物遺傳育種及生物物理學(xué)研究；E-mail：hanlitao@gs.zzu.edu.cn。

谷運(yùn)紅(1976—)，女，河南新密人；教授，主要從事作物遺傳育種及生物物理學(xué)研究；E-mail：guyunhong@zzu.edu.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.012

S 512.1

A

1001-4705(2016)12-0012-06