鄭麗娜，呂火烊，胡慶豐，張姣麗

(1. 浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310005; 2. 浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014；3.嘉興市第二人民醫(yī)院，浙江 嘉興 314012)

·基礎與臨床研究·

16S rRNA在鑒定害肺戴阿里斯特桿菌中的應用

鄭麗娜1,2，呂火烊2@，胡慶豐2，張姣麗3

(1. 浙江省新華醫(yī)院，浙江 杭州 310005; 2. 浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014；3.嘉興市第二人民醫(yī)院，浙江 嘉興 314012)

目的：評估Vitek-2 Compac全自動微生物鑒定系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS )和16S核糖體RNA(16S rRNA)對害肺戴阿里斯特桿菌(Dialister pneumosintes)的鑒定能力。方法分別用Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀、MALDI-TOF MS以及16S rRNA測序?qū)Ψ未靼⒗锼固貤U菌進行鑒定。結(jié)果16S rRNA測序鑒定出該致病菌為害肺戴阿里斯特桿菌，而Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀和MALDI-TOF MS均無法鑒定。結(jié)論對于害肺戴阿里斯特桿菌，16S rRNA的鑒定方法具有優(yōu)勢。

血培養(yǎng)；害肺戴阿里斯特桿菌；全自動微生物鑒定系統(tǒng)；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜；16S核糖體

目前已知戴阿里斯特菌屬(Dialister Spp.)有4個菌種，害肺戴阿里斯特桿菌(Dialister pneumosintes,簡稱Dp)為菌屬中的主要菌種[1]，革蘭陰性專性厭氧小桿菌。在哥倫比亞血平板上培養(yǎng)形成圓形、透明、表面有光澤、光滑的小菌落。革蘭染色，油鏡下呈單個，成對或短鏈分布。害肺戴阿里斯特桿菌是潛在的牙周炎致病菌，是目前臨床上牙周組織中較常見的細菌之一，但具體致病機制尚不清楚，再者因為它鑒定比較困難，所以害肺戴阿里斯特桿菌的藥敏仍然未知。我們從一例結(jié)腸癌患者血培養(yǎng)中分離到該菌，因該致病菌的報道較少，鑒定機制尚不完善，使用常規(guī)方法不能及時作出鑒定。為此，本研究以害肺戴阿里斯特桿菌為例，平行對比Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀、MALDI-TOF MS以及以16S rRNA 3種方法的鑒定率，為臨床害肺戴阿里斯特桿菌的鑒定提供方法學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2015年9月27日，從浙江省人民醫(yī)院一例結(jié)腸癌患者血培養(yǎng)中分離得到一株害肺戴阿里斯特桿菌。9月27日，患者因高熱，體溫39.2℃，行雙側(cè)雙瓶抽取血液進行血培養(yǎng)，血培養(yǎng)2天后于29日凌晨4點右側(cè)厭氧瓶報陽性，隨后接種于哥倫比亞血瓊脂平板37℃厭氧培養(yǎng)，同時做需氧對照。培養(yǎng)48h，厭氧培養(yǎng)的血平板上培養(yǎng)形成小的、圓形、透明、表面有光澤、光滑的菌落。

1.2 儀器與試劑

BactAlert 3D 240 型自動血培養(yǎng)分析儀，革蘭染液，顯微鏡，Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀購自法國生物梅里埃公司；MALDI-TOFMS 鑒定儀購自德國Bruker公司；MALDI—TOFMS所用試劑如三氟乙酸( TFA )、α-氰-4-羥基苯丙烯酸(HCCA )、色譜純乙腈、甲酸、無水乙醇購自美國Sigma公司Biometra 公司；T-personal PCR擴增儀購自德國；基因組提取試劑盒購自美國Axygen公司；PCR反應試劑盒、DNA標準帶購自日本Takara公司。

1.3 革蘭染色及Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定

按常規(guī)方法對分離菌株進行革蘭染色鏡檢和Vitek-2 Compac全自動微生物鑒定。

1.4 MALDI-TOF MS鑒定[2]

1.4.1 滅活 挑取2～3個中等大小菌落于1.5ml離心管中，加入300μl蒸餾水混勻，然后加900μl無水乙醇混勻，12000X g離心2min。

1.4.2 提取蛋白 離心后棄去上層乙醇，下層沉淀加入50μl 70%甲酸混勻，然后加入50μl乙腈混勻，12000X g離心2min。

1.4.3 加樣 取上清1μl加入德國Bruker公司特制的96孔加樣板，待干燥后，加入1μl基質(zhì)(飽和HCCA溶液)覆蓋加樣位置。

1.4.4 校準定標 每次實驗前需對儀器進行校準定標，以大腸埃希菌DH5α作為標準品。將所取得的特征性質(zhì)譜峰圖與MALDI Biotype 3.0 軟件(德

國Bruker 公司)中的數(shù)據(jù)庫進行比較，并用匹配分值來給結(jié)果定級。

1.5 16S rRNA測序及比對[3]

1.5.1 細菌DNA提取 從血平板上挑取2～3個中等大小菌落于0.5ml離心管中，加入50μl蒸餾水吹打混勻，煮沸10min，12000 X g離心2min，上清液作為模板DNA。

1.5.2 PCR體系配置 取0.25μl Taq酶，5μl Buffer，4μl dNTP，引物F 1μl，引物R 1μl，模板DNA 2μl，加水至配制成50μl體系。

1.5.3 PCR反應 94℃×5min，94℃×50s→55℃×50s→72℃×50s 30個循環(huán)，72℃×5min。

1.5.4 瓊脂糖凝膠電泳 PCR擴增產(chǎn)物在含溴化已錠的1.0%瓊脂糖凝膠上100V恒壓電泳30min，紫外燈下觀察結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后所得DNA序列與GenBank中的數(shù)據(jù)庫進行比對。

2 結(jié)果

2.1 革蘭染色和Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定

革蘭染色為革蘭陰性小桿菌，見圖1，Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀無法鑒定。

2.2 MALDI-TOF MS鑒定

由于尚未建立未知菌株的數(shù)據(jù)庫，故無法鑒定。

2.3 16S rRNA測序比對結(jié)果

分離菌株PCR擴增核苷酸序列長度1532bp，與害肺戴阿里斯特桿菌相似度為100%。(見圖2，Query：為分離菌株16S rRNA序列，Sbjct：害肺戴阿里斯特桿菌JCM 10004序列)。

圖2 分離菌株16S rRNA序列和害肺戴阿里斯特桿菌JCM 10004序列比較

3 討 論

Vitek-2 Compact全自動微生物鑒定儀具有操作簡便、標準化及快速準確等特點，能夠?qū)ΤＲ娭虏【M行鑒定，基本滿足疾病預防控制的需要，為細菌檢驗鑒定提供準確性和有效性。但是對于生長較為緩慢、生化反應模式相近的細菌種類以及少見疑難細菌誤鑒概率較高[4]。MALDI-TOF MS能夠快速地完成鑒定，成本較低，是目前應用和研究的熱點。不足之處在于儀器購置成本較高，大部分的醫(yī)院沒有能力購買，同時技術在細菌藥物敏感性試驗和細菌耐藥性研究方面的能力仍然有限[5]。16S 核糖體RNA(16S ribosomal RNA)[6]是原核生物的核糖體中30S 亞基的組成部分，長度約為1,542 nt，一個細菌的細胞中可包含多種具有不同序列的16S rRNA。 16S rRNA是細菌菌落最常用的基因序列[7]，是獲得基因序列研究細菌多樣性的克隆擴增，篩選克隆，測序克隆片段最經(jīng)典的方法。16S rRNA具有高效、準確、簡便、特異性強的優(yōu)點。早在2008年，Bittar F等人就提出了痰液中的復雜生物群，特別是厭氧菌在培養(yǎng)過程中很可能被忽視，他用分子生物學方法檢測了多個新興的病原菌[8]，彌補了細菌培養(yǎng)和表型鑒定的弊端。同時隨著基因組學的迅猛發(fā)展,細菌16S rRNA間隔區(qū)序列數(shù)據(jù)庫不斷擴大,序列分析技術對微生物進行分類與鑒定,確定微生物在進化中的位置[9]，已成為微生物分類學中最重要的方法之一。

害肺戴阿里斯特桿菌主要涉及口腔疾病，如牙周炎、急性壞死性潰瘍性牙齦炎和根管感染。Colombo AP等人用微生物鑒定基因芯片(homim)發(fā)現(xiàn)難治性牙周炎的齦下菌群截然不同于治療過的牙周炎以及健康的牙周[10]，難治性牙周炎的齦下菌群會持續(xù)性地破壞牙周，引起全身感染。害肺戴阿里斯特桿菌也可從呼吸道，包括呼吸機相關性肺炎[11]的感染處分離到。近期研究發(fā)現(xiàn)羊水、腦膿腫、腎移植患者的尿標本以及各種臨床患者的骨和血培養(yǎng)均可檢到。目前文獻已報道了2例害肺戴阿里斯特桿菌引起的血源性感染。Kogure M等人報道一位62歲的日本婦女住院時2瓶血培養(yǎng)陽性，經(jīng)16S rRNA鑒定為害肺戴阿里斯特桿菌，增強CT和磁共振成像確定患者患有鼻竇炎和齲齒[12]。Lee MY等用16S rRNA在另一例全身乏力和發(fā)熱的菌血癥患者血培養(yǎng)中鑒定出害肺戴阿里斯特桿菌和還原天芥菜堿消化鏈球[13]?？梢妼Ρ揪蔫b定均有賴于16S rRNA技術。

本例分離到的菌株，在其他方法均無法鑒定的情況下，選用了16S rRNA方法成功進行了鑒定，提示16S rRNA方法可用于害肺戴阿里斯特桿菌的鑒定。為此建議有條件的實驗室均應建立多種檢測方法，當使用常規(guī)鑒定方法和MALDI-TOF MS無法鑒定時可考慮使用16S rRNA方法。

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Theapplicationof16SrRNAinidentificationofdialisterpneumosintes

ZHENGLina1,2，LVHuoyang2@，HUQingfeng2，ZHANGJiaoli3

(1.Zhejiang Xinhua Hospital ,Hangzhou 310005,China;2.Zhejiang Province People's Hospital, Hangzhou 310014,China; 3. The Second People's Hospital of Jiaxing, Zhejiang 314012, China)

ObjectiveTo evaluate thedifferent identification of dialisterpneumosintes.MethodVitek-2 Compact, matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF MS)and 16S ribosomal RNA (16S rRNA) were respectively used to identifydialisterpneumosintes.Result16S rRNA can identificatedialisterpneumosintes and Vitek-2 Compact and MALDI-TOF MS can not.ConclutionForDialister pneumosintes, the identification method of 16S rRNAhas more advantage than the others.

Blood culture；Dialister pneumosintes；Vitek-2 Compact；MALDI-TOF MS；16S rRNA；

鄭麗娜(1988-)，女，浙江杭州人，本科，初級檢驗技師。研究方向：臨床微生物學檢驗

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呂火烊 lab_lhx@126.com

R37

B

1672-0024(2016)03-0041-04