閆曉曉 穆靈敏

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

幾種增加小鼠骨髓染色體中期細(xì)胞數(shù)方法的比較

閆曉曉 穆靈敏

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

目的：探索提高小鼠骨髓染色體中期分裂相的獲得的方法。方法：小鼠隨機(jī)分成3組，對(duì)照組、兩次注射秋水仙素組和酵母組秋水仙素組，每組分別用注射沖洗法、剪碎靜置法和剪碎震蕩法收集骨髓細(xì)胞。結(jié)果：與對(duì)照組相比，兩次注射秋水仙素組和酵母組秋水仙素組中期細(xì)胞有明顯增加；與注射沖洗法相比，剪碎法獲得的中期細(xì)胞數(shù)有明顯增加。

小鼠 染色體 中期細(xì)胞

染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目是研究生物體遺傳、變異、發(fā)育的基礎(chǔ)，而動(dòng)物的骨髓細(xì)胞具有分裂旺盛、數(shù)量多等的特點(diǎn)，可以直接進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備，不需體外培養(yǎng)和無菌操作，還可以真實(shí)反映完整機(jī)體所受的環(huán)境影響［1］。染色體是生物體遺傳信息的載體，在細(xì)胞分裂時(shí)期（體細(xì)胞的有絲分裂和生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂）特定存在，對(duì)處于分裂期的細(xì)胞經(jīng)秋水仙素處理，阻斷其紡錘絲微管的組裝，使細(xì)胞分裂停止于中期，此時(shí)染色體達(dá)到最大收縮，具有典型的形態(tài)。染色體制備對(duì)人類遺傳病、血液病的研究和診斷有著重要的臨床意義，在醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)中是經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之一。

在教學(xué)中用，學(xué)生可以通過實(shí)驗(yàn)了解小鼠染色體的數(shù)目及形態(tài)特征，掌握中期染色體制備的實(shí)驗(yàn)原理和方法。該實(shí)驗(yàn)操作步驟簡(jiǎn)單，但容易出現(xiàn)中期分裂相少、染色體過于短小、染色體分散不好、染色體邊緣發(fā)毛等情況［2］，另外該實(shí)驗(yàn)需要實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理，且耗時(shí)時(shí)間長(zhǎng)，不利于在教學(xué)中推廣。本文參考比較各種改進(jìn)方法，先總結(jié)如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠45只，體重（22±2）g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

解剖盤；眼科剪；低速臺(tái)式離心機(jī)（上海手術(shù)器械廠）；電子天平（上海衡平儀器儀表廠）；雙目光學(xué)顯微鏡；電熱恒溫水浴箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；隔水式培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；震蕩器（常州國(guó)宇儀器制作有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑

秋水仙素（上海撫生生物科技有限公司）；酵母粉；葡萄糖粉；甲醇；冰醋酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；低滲液（0.075mol/LKcl）、生理鹽水；Giemsa染液（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理：將酵母粉1g，葡萄糖粉2.2g，充分溶解于10ml蒸餾水中，放置于40℃恒溫水浴箱中，1.5-2h。取小鼠45只；15只為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)前4h腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（體重）；15只為實(shí)驗(yàn)組1，在取材14h前，腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（體重），實(shí)驗(yàn)前4h腹腔注射秋水仙素10ug/gBW（體重）；15只為實(shí)驗(yàn)組2，取材前24h在小鼠背部皮下注射配置的酵母葡萄糖液10ul/gBW，實(shí)驗(yàn)前2h腹腔注射秋水仙素5ug/gBW（體重）。（2）骨髓細(xì)胞收集：用頸椎脫臼法處死小鼠，用剪刀剪開四肢骨的皮膚和肌肉，用紗布將附在股骨上的肌肉搓凈凈，小心去除股骨兩端，暴露出骨髓腔。將對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2再分為3組，每組5只小鼠，分別用三種方法收集細(xì)胞，一種是注射器吸取低滲液反復(fù)沖洗至股骨泛白，第二種，將股骨剪碎后放入培養(yǎng)皿中，加入3ml低滲液，靜止8min，然后將上清液吸入離心管中備用；第三種，將小鼠股骨剪碎后移入離心管中，再加入3ml低滲液，然后用SK-1型震蕩混勻器震蕩30s，使骨髓細(xì)胞充分游離到低滲液中，離心取上清液。（3）預(yù)固定：取37℃的預(yù)熱的低滲液5ml加入有骨髓細(xì)胞的離心管中，吹打混勻后至于37℃的恒溫水浴箱中，保溫30min后取出，加1ml固定液（甲醛：冰乙酸=3：1），1500r/min，離心10min，棄上清。（4）固定：于沉淀中加6ml固定液，吹打混勻，2000r/min，離心3min，棄上清。（5）制細(xì)胞懸液：于沉淀中加0.2ml-0.3ml固定液（視細(xì)胞量的多少），混勻。（6）制片：取-20℃預(yù)冷的玻片，于25cm處快速滴下，吹片是細(xì)胞懸液分散，與酒精燈火焰出烤片，往返5次，自然晾干。（7）染色：至于Giemsa染液中染色8min，取出標(biāo)本，流水沖洗，室溫晾干，在顯微鏡下鏡檢。

2　結(jié)果

小鼠染色體數(shù)為2n=40，制作成功好的染色體呈圓盤狀分散分布，近端著絲粒染色，形態(tài)呈“U”形，極少有短小、聚集成團(tuán)及相互纏繞等現(xiàn)象。

實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2較對(duì)照組染色體數(shù)有明顯升高，特別是實(shí)驗(yàn)組2用剪碎法，染色體中期分裂相有明顯的增多，而實(shí)驗(yàn)組1與實(shí)驗(yàn)組2的注射沖洗法相比，染色體中期分裂相沒有明顯的增高，各組間用剪碎震蕩法和剪碎靜置法獲得染色體中期分裂相也沒有明顯升高，但較常規(guī)的注射沖洗法獲得的中期分裂相有明顯升高。如表1所示。

3　討論

染色體制備是生命科學(xué)研究和遺傳學(xué)研究中的重要技術(shù)，小鼠骨髓染色體的制備操作過程雖然簡(jiǎn)單，但是制作過程中的微小改變，就能造成染色體中期分裂相少、染色體短小、重疊甚至斷裂，相互纏繞等，影響檢測(cè)效果［3］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，取材前分兩次注射秋水仙素和用酵母液加秋水仙素的方法可明顯增加染色體中期分裂相；用剪碎法去骨髓細(xì)胞相比用沖洗法取骨髓細(xì)胞能更大量的獲得染色體中期分裂相；但取材前用酵母液加秋水仙素混合注射比分兩次注射秋水仙素，中期分類相雖有所增加，但沒有明顯的增多。由于

············樣本的量小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)存在誤差，需要在課程實(shí)踐中增大樣本檢測(cè)量，進(jìn)一步改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法。

綜上所述，取材前分兩次注射小鼠、收集細(xì)胞過程中采用震蕩法收集細(xì)胞，較傳統(tǒng)的提前4h注射秋水仙素和用沖洗骨髓收集的方法，細(xì)胞的獲得率，及中期分裂相的得率有很大提升，能夠提高分裂中期染色體制備的效果。

［1］劉星，馮昆，張青峰等.小鼠骨髓細(xì)胞中期染色體標(biāo)本制備方法的改進(jìn)［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育，2015，18（33）：101-102.

［2］劉涌濤，馬全祥，劉慧娟等.小鼠骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本制備中的失誤與對(duì)策［J］.生物學(xué)通報(bào)，2003，38（6）：53-54.

［3］崔向清，馬鑫，李麗等.增加中期細(xì)胞數(shù)的染色體標(biāo)本制備方法研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2014，7（16）：8-9.