曾玉翠，陳蕓，曾荔蘋，湯惠茹，吳瑞芳，3*

(1.北京大學深圳醫(yī)院婦產科，2.北京大學深圳醫(yī)院超聲科，3.深圳市婦科腫瘤醫(yī)學工程技術研究開發(fā)中心，深圳 518036)

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·實驗研究·

不同玻璃液凍存卵巢組織移植于雞胚前后的氧化應激和細胞凋亡研究

曾玉翠1，陳蕓2，曾荔蘋1，湯惠茹1，吳瑞芳1，3*

(1.北京大學深圳醫(yī)院婦產科，2.北京大學深圳醫(yī)院超聲科，3.深圳市婦科腫瘤醫(yī)學工程技術研究開發(fā)中心，深圳 518036)

目的 研究不同玻璃液(VS)保護下凍存的卵巢組織移植于雞胚前后的氧化應激和細胞凋亡情況，以評估不同玻璃液的冷凍保護效果。 方法 將卵巢組織分割成1～2 mm×1 mm×1 mm的小塊分別放入VS1、VS2、VS3、VS4 4種不同的玻璃液中，經過4種玻璃液平衡后凍存并復蘇的卵巢組織稱為凍存卵巢組織(FOT)，分別將經4種玻璃液凍存的FOT移植到胚齡10 d的雞卵絨毛尿囊膜(CAM)上培養(yǎng)，于雞卵胚齡16 d取出移植于CAM的卵巢組織(TOT)，以未經玻璃液平衡的新鮮卵巢組織為對照(COT)，分析4種玻璃液保存的FOT、TOT、COT中線粒體活性、細胞內活性氧自由基(ROS)水平和間質細胞凋亡情況。 結果 線粒體活性：經過VS1、VS3和VS4凍存的FOT和TOT中的線粒體活性低于COT，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經VS2凍存的TOT與COT中線粒體活性無顯著性差異(P>0.05)。細胞內ROS水平：經過VS1、VS3和VS4凍存的FOT和TOT細胞內ROS水平低于COT，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；經VS2凍存的FOT細胞內ROS水平與COT組比較無顯著性差異(P>0.05)。間質細胞凋亡情況：經過VS1、VS2、VS3和VS4平衡的FOT間質細胞凋亡率和COT組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 結論 由玻璃液VS2保護凍存卵巢組織的冷凍損傷小、移植后缺血損傷輕，是本研究優(yōu)化的卵巢冷凍保護玻璃液；玻璃化冷凍對間質細胞損傷小，適于人卵巢組織的冷凍保存。

玻璃液；卵巢組織；氧化應激；凋亡

Methods：Human ovarian tissues were dissected to 1-2 mm×1 mm×1 mm size，and then put into in four kinds of vitrification solutions(VS1，VS2，VS3，VS4)for cryopreservation.Part of the frozen ovarian tissues(FOT)was grafted into CAM.The transplanted ovarian tissues(TOT)were collected 5 days after transplantation.The tissue without treatment was as control ovarian tissue(COT).The mitochondrial activity，reactive oxygen species(ROS)and apoptosis of stromal cells in COT，F(xiàn)OT and TOT after cryopreservation with four different vitrification solutions were evaluated and compared.

Results：Mitochondrial activity of tissue after cryopreservation with VS1，VS3 or VS4 was significantly lower than COT(P<0.05).TOT after cryopreservation with VS2 was not significant different with COT(P>0.05).ROS levels in FOT and TOT after cryopreservation with VS1，VS3 or VS4 were significantly lower than COT(P<0.05).ROS levels in FOT with VS2 were not significantly different with COT(P>0.05).There was no significant difference in apoptosis between FOT and COT among the four VS groups(P>0.05).

Conclusions：VS2 results in a higher level of mitochondrial activity and ROS，therefore，it is an optimal solution.Vitrification cryopreservation shows little damage to stromal cells，which is an alternative way to protect human ovarian tissue.

(JReprodMed2016，25(11)：1006-1012)

近年來隨著腫瘤診療技術的提高，越來越多的年輕腫瘤患者治療后可長期生存。然而，大劑量的放化療藥物對生殖腺毒性作用，導致患者在腫瘤治療結束后出現(xiàn)卵巢早衰和不孕。研究證實，在抗腫瘤治療前凍存患者卵巢組織來保護其生育力是一個行之有效的方法[1]。

玻璃化冷凍因不需要特殊設備、操作簡單，被認為是慢速冷凍的替代方案。在卵巢組織玻璃化冷凍過程中，玻璃化冷凍保護液，簡稱玻璃液(vitrification solution，VS)對組織的滲透毒性和化學毒性可引起細胞膜結構改變，抗凍保護作用降低，發(fā)生組織的冷凍損傷。本文通過激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)與原位末端標記(TUNEL)法，研究由不同玻璃液凍存的卵巢組織移植于雞胚前后氧化應激水平及細胞的凋亡，用以評估不同玻璃液的冷凍保護效果。

材料和方法

一、材料

1.人卵巢組織的獲?。罕狙芯糠桨傅玫奖本┐髮W深圳醫(yī)院倫理委員會批準，卵巢組織來源于1位因子宮內膜癌行雙側卵巢切除術的39歲患者。手術中卵巢組織離體后立即取材，剖開雙側卵巢組織，各切取一半，置于盛有6 ml 經HEPES緩沖的M199培養(yǎng)液(含20%胎牛血清和100 μg/ml青/鏈霉素)的離心管中，15 min內送至實驗室。

2.卵巢組織的處理與分組：將送至實驗室的卵巢組織去除血跡和髓質及肉眼可見的卵泡與黃體等周期性結構后，分割成40余個1～2 mm×1 mm×1 mm的小塊。將分割的小塊卵巢組織每10塊為一個實驗組，共4組；同時留取4塊新鮮卵巢組織作為對照組(COT)，其中2塊立即用4%多聚甲醛固定，待原位末端標記法(TUNEL)實驗檢測細胞凋亡，另2塊經MitoTracker Orange CMTMRos和2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯孵育后(具體步驟見下文)用2%甲醛固定，待測線粒體活性和氧化應激水平。

二、主要試劑及配制

M199(Gibco，美國)；胎牛血清(FBS，Gibco，美國)；原位細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德)；MitoTracker Orange CMTMRos(M7510，LifeTechnologies，美國)；2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯(DCF)、蔗糖、海藻糖(Sigma，美國)。

4種玻璃液(VS1-VS4)的選擇與配制參閱文獻如下：

VS1：7.5% 乙二醇(EG)+7.5%二甲亞砜(DMSO)+M199，15% EG+15% DMSO+M199[2]；

VS2：7.5% EG+7.5% DMSO+基礎液(M199+20% FBS)，15% EG+15% DMSO+0.5 mol/L蔗糖+M199+20% FBS[3]；

VS3：25%(EG+DMSO)+M199+20% FBS[4]；

VS4：10%(EG+DMSO)+0.1 mol/L蔗糖+0.1 mol/L海藻糖+6% FBS+M199，20%(EG+DMSO)+0.3 mol/L蔗糖+0.1 mol/L海藻糖+6% FBS+M199[5]。

以上滲透性冷凍劑均購于Sigma公司。

三、研究方法

1.卵巢組織的凍存：參閱前期研究[6]，平衡時間見表1。各實驗組卵巢組織塊分別經不同玻璃液平衡后置于金屬網(wǎng)格載體，以滅菌紗布吸走多余玻璃液，投入裝有液氮的泡沫箱中，冷凍后將組織連同載體置于預冷后的1.8 ml冷凍管(Corning)中，投入液氮罐中冷凍保存。

表1 各實驗組卵巢組織平衡時間

2.卵巢組織的凍融：卵巢組織凍存2周后，取出金屬網(wǎng)格載體，置于空氣中30 s，迅速轉入37℃水浴，將卵巢組織依次移入蔗糖濃度梯度為1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L、0.125 mol/L的解凍液中各5 min，復融組織塊，漂洗卵巢組織3次。4個實驗組中每組凍融的10個卵巢組織塊中各取出兩塊以4%多聚甲醛固定，用于細胞凋亡檢測；每組取3塊組織行線粒體活性和活性氧自由基(ROS)水平檢測；剩余的5塊組織用于雞胚移植。

3.凍融卵巢組織塊雞胚移植：雞胚準備同前期研究[6]，將受精雞卵放入37℃孵箱中孵育至雞胚胚齡第10 天取出。內徑為5 mm的硅膠環(huán)置于去除了上細胞層的CAM上，用眼科鑷將復融的卵巢組織塊置于硅膠環(huán)內。如此將4種玻璃液保護下凍融的各5塊卵巢組織分別移植到20個雞胚CAM上，并在雞卵外殼上標記編號。移植卵巢組織塊后雞胚繼續(xù)孵育5 d，于雞胚胚齡第16天取出，將移植的卵巢組織塊連同CAM一起取材。將取下的卵巢組織塊中的2塊以4%多聚甲醛固定，進行細胞凋亡檢測，其余3個卵巢組織塊行線粒體活性和ROS水平檢測。

4.線粒體活性與ROS檢測：經上述實驗，獲得了3類卵巢組織塊，即分別經4種玻璃液平衡后冷凍復融的卵巢組織塊(FOT)；取下移植5 d后的卵巢組織(TOT)；新鮮的對照組卵巢組織(COT)。

參照Martino等[7]介紹的方法，取FOT、TOT與 COT置于10% FBS+PBS+280 nmol/L MitoTracker Orange CMTMRos中，在37℃、6% CO2條件下孵育45 min定位和檢測線粒體活性；再將卵巢組織置于10% FBS+PBS+10 μmol/L 2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯中孵育45 min，檢測ROS水平。上述處理后的卵巢組織于2%甲醛固定。組織脫水、包埋，制作30 μm厚切片，每個組織塊取兩張連續(xù)切片。

將制好的玻片置于CLSM(200×)上，M7510激發(fā)出桔色熒光代表有活性的線粒體。DCF激發(fā)出綠色熒光代表細胞內ROS水平。每張玻片取3個視野(23 000 pixel2)分析熒光強度，涉及熒光強度的所有參數(shù)設置恒定。

5.TUNEL法凋亡檢測：FOT、TOT與 COT制作5 μm厚切片，具體操作步驟參照試劑盒說明書。由于卵巢組織塊小及卵泡數(shù)少，本文僅分析卵巢間質細胞的凋亡情況。間質細胞陽性表現(xiàn)為核染成棕黃色，凋亡率=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用(均數(shù)±標準差)表示，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)LSD法分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、一般情況

4種玻璃液凍存的卵巢組織塊經復融后，各取5塊分別移植到雞胚CAM上，移植后繼續(xù)孵育5 d，移植的卵巢組織上都長了新生血管，質地柔軟，判斷組織塊全部存活。

二、不同玻璃液凍存的卵巢組織中線粒體活性與ROS水平的定性分析比較

將不同玻璃液凍存的凍融卵巢組織塊(FOT)、移植后(TOT)與新鮮組織塊(COT)進行線粒體活性和ROS水平檢測，觀察到卵巢組織切片均標記上了M7510激發(fā)的桔色熒光和DCF激發(fā)的綠色熒光染料，表明熒光染料組織滲透完全。

結果顯示，在CLSM下觀察卵巢FOT、TOT與COT的M7510和DCF激發(fā)熒光強度不一，即4種不同玻璃液凍存的卵巢組織塊冷凍損傷程度不同，新鮮對照組與VS2玻璃液保護的FOT及TOT熒光較強，說明其線粒體活性和ROS水平較高(圖1A～D)；玻璃液VS1、VS3和VS4保存的FOT及TOT熒光較弱，說明其線粒體活性和ROS水平較低(圖1E～H)。

M7510熒光強度代表線粒體活性(桔色)；DCF熒光強度代表ROS水平(綠色)。A：COT的M7510熒光強度；B：玻璃液VS2保護下FOT的M7510熒光強度；C：COT的DCF熒光強度；D：玻璃液VS2保護下FOT的DCF熒光強度；E：玻璃液VS1保護下FOT的M7510熒光強度；F：玻璃液VS4保護下TOT的M7510熒光強度，可見細胞壞死帶(藍色箭頭所指處)，G：玻璃液VS1保護下FOT的DCF熒光強度；H：玻璃液VS4保護下TOT的DCF熒光強度，可見細胞壞死帶(藍色箭頭所指處)圖1 不同玻璃液凍存的卵巢組織復融與CAM移植后的線粒體活性和ROS水平定性分析

三、不同玻璃液凍存的卵巢組織中線粒體活性與ROS水平的定量分析比較

在CLSM下，對反應卵巢組織線粒體活性的M7510和代表氧化應激狀態(tài)的DCF激發(fā)的熒光信號進行定量分析，由不同玻璃液保護下的FOT與TOT的結果如圖2所示。

與同組COT比較，*P<0.05；與同組FOT比較，**P<0.05；與同組TOT比較，▲P<0.05圖2 不同玻璃液凍存的卵巢組織復融與CAM移植后的線粒體生物能和ROS水平定量分析

線粒體活性：FOT線粒體活性在玻璃液VS1(3.32±1.06)、VS2(3.87±1.24)、VS3(5.75±2.14)和VS4(6.44±2.61)中低于COT(15.66±4.22)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TOT線粒體活性在玻璃液VS1(5.44±3.06)、VS3(5.36±3.46)和VS4(4.69±2.09)中與對應的同一種玻璃液的FOT相比，無顯著性差異(P>0.05)；而VS2的TOT(12.57±3.10)與VS2的FOT相比，線粒體活性顯著增強(P<0.01)，說明玻璃化冷凍卵巢組織的線粒體產生了一定程度的損傷，VS2玻璃液保護下冷凍的卵巢組織線粒體活性得到了較好的恢復，而其他3種玻璃液保護下冷凍的卵巢組織移植后線粒體活性無改善。

ROS水平：FOT的ROS水平在玻璃液VS1(6.84±1.67)、VS3(5.23±2.98)和VS4(8.06±3.37)中低于COT(19.58±7.69)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而VS2保護的FOT的ROS水平(15.18±2.80)與COT比較，無顯著性差異(P>0.05)；TOT的 ROS水平在VS1(8.85±2.56)、VS3(5.04±1.37)和VS4(7.94±2.63)中與對應的同一種玻璃液FOT相比，無顯著性差異(P>0.05)，即卵巢組織移植5 d后，ROS水平無改變；而VS2 保護下TOT的ROS水平(7.46±3.34)較移植前(VS2-FOT)為低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

上述結果提示，玻璃液VS1、VS3和VS4保護的FOT與TOT線粒體活性受到損傷，組織ROS下降；而玻璃液VS2保護下組織線粒體損傷程度較輕，移植后線粒體活性恢復好，并與ROS水平保持動態(tài)的平衡。

四、不同玻璃液凍存的卵巢組織塊間質細胞凋亡情況比較

卵巢組織復融后，間質細胞形態(tài)仍保持正常，少量的間質細胞出現(xiàn)凋亡(圖3A紅色箭頭所指處)。復融的卵巢組織移植5 d后，間質細胞排列稀疏，細胞皺縮，較多間質細胞出現(xiàn)凋亡(圖3B藍色箭頭所指處)。

A：FOT凋亡細胞(紅色箭頭所指處)；B：TOT凋亡細胞(藍色箭頭所指處)；C：陽性對照；D：陰性對照；圖3 卵巢組織冷凍復融和移植后間質細胞凋亡情況

數(shù)據(jù)顯示，F(xiàn)OT的間質細胞凋亡率在VS1(9.67±3.71)、VS2(8.50±3.20)、VS3(6.78±4.03)和VS4(9.36±3.48)中，與COT(7.95±2.89)之間并無顯著性差異(P>0.05)。凍融卵巢組織移植后5 d，TOT間質細胞凋亡率在VS1(27.02±2.09)、VS2(13.92±6.27)、VS3(30.18±8.20)和VS4(23.31±11.84)中，顯著高于對應的同一種玻璃液的FOT和COT(P<0.05)；玻璃液VS2的TOT間質細胞凋亡率低于其他3種玻璃液的TOT凋亡率，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4)。

與同種玻璃液的COT和FOT比較，*P<0.05；與不同種玻璃液的TOT比較，☆P<0.05圖4 各玻璃液凍存的卵巢組織的凋亡情況

4種玻璃液復融的卵巢組織間質細胞損傷輕微；VS1、VS3和VS4復融卵巢組織移植5 d后，卵巢組織間質細胞凋亡增加，而VS2保護的TOT間質細胞凋亡較少，提示VS2保護的TOT移植物缺血缺氧損傷較輕。

討 論

在年輕腫瘤患者抗腫瘤治療前對其卵巢組織玻璃化凍存是保存生殖功能的有效方法。研究卵巢玻璃化冷凍及移植后線粒體功能和或氧化應激反應改變的報道較少[8-9]。本文通過CLSM結合TUNEL方法比較以不同玻璃液保護凍存卵巢組織的生物能、氧化應激狀態(tài)及其細胞凋亡，并以此優(yōu)化玻璃液方案。

線粒體作為組織細胞代謝的樞紐，是活性氧自由基(ROS)生成的關鍵場所。ROS可透過細胞膜改變脂類、蛋白質和核酸等大分子物質的結構和功能，從而導致線粒體的功能減退及能量產生障礙[10]。通常情況下細胞內線粒體內多種抗氧化系統(tǒng)調控線粒體ROS的平衡狀態(tài)。一旦ROS穩(wěn)態(tài)被破壞，將會啟動細胞凋亡程序。

不同個體卵巢組織的線粒體生物能存在較大差異，本研究卵巢組織來源于同一個體，避免了人卵巢組織本身的差異。復蘇后，四種玻璃液保護下的卵巢組織生物能均降低，提示卵巢組織線粒體在玻璃化冷凍過程中易受損。VS1、VS3和VS4保護下FOT的ROS水平降低，而VS2 FOT的ROS水平與新鮮對照比較無差異。Rahimi等[10]證實凍融的卵巢組織ROS水平異常升高可導致細胞凋亡。本研究4種玻璃液保護下FOT ROS水平無增高，且間質細胞凋亡率與COT相比亦無增加，提示ROS水平在冷凍復融后卵巢組織的凋亡中起一定作用。

組織移植5 d后，VS1、VS3、VS4的TOT與對應的同一種玻璃液的FOT相比，線粒體的生物能和ROS水平并沒有明顯的改善，說明該3種玻璃液對卵巢組織線粒體的損傷較為嚴重，在卵巢組織移植過程中，線粒體活性恢復慢甚至不能恢復。VS2的TOT線粒體生物能相比FOT明顯增加，同時ROS水平下降。提示，玻璃液VS2冷凍卵巢組織對線粒體損傷較輕。此時ROS水平下降的可能原因是在移植組織重新建立血供過程中，調控生物氧化功能基因未被破壞，組織在缺血應激下線粒體相關基因被激活，但因氧供不足，組織處于“氧債”階段，因此產生的ROS反而減少，另外一方面由于線粒體功能恢復，卵巢組織內抗氧化系統(tǒng)或者超氧化物歧化酶激活對自由基清除能力增加。根據(jù)Fabbri等[8]研究，卵巢組織冷凍損傷分為三種程度，嚴重冷凍損傷時，線粒體和ROS水平均明顯下降，中輕度損傷導致線粒體生物能升高和/或ROS水平升高或者輕微下降，無損傷時線粒體生物能和ROS水平不改變。本研究提示從卵巢組織生物能/氧化應激水平進行分析得出玻璃液VS2保護組織抗冷凍損傷的作用優(yōu)于其他3種玻璃液。

卵巢間質細胞不僅可以影響卵泡外膜的形成，而且通過旁分泌因子來影響卵泡的發(fā)育和成熟。因此，間質細胞不僅起維持卵巢組織結構作用，還關乎凍存卵巢組織移植后內分泌功能的恢復。本研究中復蘇后的卵巢組織間質細胞凋亡率與新鮮的卵巢組織無統(tǒng)計學差異，說明4種玻璃液方案均可以較好地保護卵巢組織間質細胞。許多研究證實玻璃化冷凍后的卵巢組織間質細胞間隙、形態(tài)、超微結構與新鮮組織相似[11-12]。但也有研究報道卵巢組織冷凍因低溫和高濃度冷凍劑等造成的物理損傷和抗氧化代謝損傷而導致卵巢組織細胞凋亡增加[13]。Mazoochi等[14]報道玻璃化冷凍會引起凋亡相關基因如p53、Bcl-2、Bax、Fas和FasLd等表達改變，導致細胞凋亡。

移植后卵巢組織細胞凋亡與移植組織塊血供重建情況直接相關。移植后處于缺血缺氧狀態(tài)下，卵巢組織的損傷較為嚴重。Wang等[15]在移植動物模型體內注射VEGF和bFGF來縮短移植組織塊缺血缺氧的時間，結果發(fā)現(xiàn)移植后細胞凋亡率與新鮮組織無差異，也有研究報道在缺血缺氧應激狀態(tài)下細胞反而會被激活[16]。本研究卵巢組織移植5 d后，卵巢組織間質細胞的凋亡率與新鮮組織和冷凍復蘇后的組織相比明顯增加，但VS2移植組織間質細胞凋亡率較VS1、VS3和VS4的TOT為低，從凋亡角度提示VS2對卵巢組織的凍存效果較好。但Amorim等[17]報道移植1周后間質細胞凋亡率與新鮮對照組差異不明顯，認為間質細胞凋亡與玻璃液方案并無直接的關系。

總之，玻璃化冷凍對卵巢組織間質細胞損傷小適用于人卵巢組織的冷凍保存。玻璃液VS2對卵巢組織冷凍保存效果較好。本研究雞胚的移植時間不長，后期將進一步延長移植時間，觀察血管完全建立后線粒體功能恢復和細胞凋亡情況，另外需要加大樣本量，比較不同病人的卵巢組織線粒體活性/氧化應激水平評估疾病本身的影響及不同玻璃液之間冷凍效果的差異。

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[編輯：侯麗]

Oxidative stress reaction and apoptosis of human ovarian tissue pre/post transplanted into chicken embryos after cryopreservation with different vitrification solutions

ZENG Yu-cui1，CHEN Yun2，ZENG Li-ping1，TANG Hui-ru1，WU Rui-fang1，3*

1.DepartmentofObstetricsandGynecology，BeijingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036 2.DepartmentofUltrasound，BeijingUniversityShenzhenHospital，Shenzhen518036 3.ShenzhenTechnicalResearchandDevelopmentCenteronGynecologicOncology，Shenzhen518036

Objective：To evaluate the effect of cryopreservation with different vitrification solutions on oxidative stress reaction and apoptosis of human ovarian tissues before and after transplantation into chick embryo chorioallantoic membrane(CAM).

Vitrification solution； Ovarian tissue； Oxidative stress reaction； Apoptosis

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.11.011

2016-02-24；

2016-04-04

深圳市科技創(chuàng)新委員會國際合作項目(GJHZ20130417100103783)；廣東省科技計劃項目(社會發(fā)展領域科技計劃項目)(2013B021800095)

曾玉翠，女，江西上饒人，碩士研究生，生殖內分泌專業(yè).(*