王欣，李培旭

(解放軍150醫(yī)院婦產科，洛陽 471003)

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封閉抗體陰性的反復自然流產患者采用配偶淋巴細胞主動免疫治療效果觀察

王欣，李培旭*

(解放軍150醫(yī)院婦產科，洛陽 471003)

目的 觀察配偶淋巴細胞主動免疫治療封閉抗體陰性的反復自然流產的效果。 方法 收集2010年1月至2015年1月于我院行封閉抗體陰性的經治療后獲得首次妊娠的反復自然流產患者97例，依據不同治療方法分為研究組76例和對照組21例。研究組采用丈夫外周血淋巴細胞主動免疫治療后觀察封閉抗體的變化，對照組采用小劑量免疫抑制劑等治療，比較兩組治療后首次妊娠的結局。 結果 研究組76例孕婦，妊娠成功51例，妊娠成功率67.11%；對照組21例孕婦，妊娠成功8例，妊娠成功率38.10%。研究組妊娠成功率顯著高于對照組妊娠成功率(P<0.05)。研究組76例免疫治療后復查封閉抗體，27例轉陽性孕婦19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，49例仍陰性孕婦32例妊娠成功，妊娠成功率為65.31%；兩者比較妊娠成功率差異無統計學意義(P>0.05)。 結論 免疫治療可顯著提高反復自然流產患者的妊娠成功率，封閉抗體轉陽只是其紛繁復雜的機理之一。

反復自然流產； 封閉抗體； 免疫治療

Methods：The data of 97 patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody who received their first pregnancy in our hospital from Jan.2010 to Jan.2015 were collected.The patients were divided to two groups：the patients in the study group were treated with paternal lymphocyte(n=76)，and the patients in control group were treated with small doses of immunosuppressants(n=21).The first pregnant outcomes were compared between the two groups.

Results：The pregnancy rate(67.11% vs.38.10%)of the study group is significantly higher than that of the control group(P<0.05).In the studying group，the pregnancy rate(70.37%)in 27 patients whose APLA turned positive was higher than that(65.31%)in 49 patients whose APLA was still negative after immunotherapy(P>0.05).

Conclusions：The pregnancy rate is significantly increased after immunotherapy with paternal lymphocyte；but the results are not always consistent with the changes in APLA.

(JReprodMed2016，25(11)：998-1001)

自然流產是指妊娠20周以前或者胎兒體重小于450克，或在獲得有生機兒之前的自然流產或胚胎宮內停止發(fā)育；反復自然流產(RSA)是指連續(xù)2次及以上發(fā)生自然流產[1]。收集我院近5年因反復自然流產就診、經臨床檢查排除生殖器官器質性病變、染色體異常、黃體功能不足、動靜血栓前狀態(tài)等，封閉抗體(APLA)檢測結果為陰性、經過小劑量免疫抑制劑治療或者丈夫外周血淋巴細胞免疫治療(immunotherapy)后獲得首次妊娠的患者97例，根據治療方法不同分為兩組：研究組(76例)采用配偶淋巴細胞主動免疫治療；對照組(21例)采用小劑量免疫抑制劑等治療，結果報告如下。本研究通過分析兩組患者治療后妊娠結局及封閉抗體轉陽情況，旨在探尋新的臨床RSA患者進行淋巴免疫治療后療效評價和妊娠預后判斷的參考指標。

材料與方法

一、臨床資料

收集我院2010年1月至2015年1月因兩次及以上自然流產就診的重復流產患者97例，經臨床檢查排除生殖器官器質性病變、染色體異常、黃體功能不足、動靜血栓前狀態(tài)等，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測封閉抗體為陰性經治療后獲得首次宮內妊娠，年齡20～32歲、平均(25.60±5.95)歲，流產2～6次、平均(3.75±1.88)次。臨床詳細詢問患者每次流產的情況：包括孕周、出血、腹痛、尿及血HCG、彩色多普勒超聲檢查等，以確認妊娠和流產的診斷成立，并且無淋巴細胞免疫治療史及輸血史。常規(guī)檢查：①男方精液正常且無淋球菌、支原體、衣原體感染；②夫妻雙方染色體正常且Rh血型陽性、雙方血常規(guī)和血紅蛋白正常、雙方艾滋病和梅毒篩查陰性；③女方常規(guī)婦科及彩色多普勒超聲檢查或子宮輸卵管造影檢查排除子宮及宮頸畸形，宮頸管陰道內無滴蟲、霉菌、淋球菌、支原體、衣原體感染，自身免疫性抗體抗心磷脂抗體、抗子宮內膜抗體、抗β2-糖蛋白1抗體均陰性，內分泌激素正常，凝血四項及血脂四項正常，不孕及優(yōu)生抗體全套篩查陰性。

二、實驗方法

對照組21例，皆因丈夫乙型或丙型肝炎病毒感染或攜帶，不宜采用其血液分離淋巴細胞給妻子做免疫治療的患者，從試孕前6周開始每日口服強的松5 mg(浙江仙琚制藥)+腸溶阿司匹林25 mg(石家莊歐意藥業(yè))+維生素E 100 mg(浙江醫(yī)藥)，直至妊娠滿36周止，每一月查血小板計數、凝血功能及纖溶指標；研究組76例，簽署淋巴免疫治療知情同意書，于試孕前6周開始，取丈夫肘靜脈空腹血20 ml，加入適量肝素鈉溶液(2 ml，12 500 U，上海第一生化藥業(yè))防止血液凝固，將血液用生理鹽水按1∶1的比例稀釋；在4根無菌離心試管底部加入3 ml淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品)，再將稀釋均勻的血液平均加入到這4根離心管中使其兩兩平衡，并保持血液和淋巴細胞分離液形成的界面清晰；將離心管平衡放入離心機內以2 000 r/min的速度離心20 min，集中4根離心管中的淋巴細胞到清潔無菌的離心管內，加入10 ml生理鹽水以2 000 r/min的速度離心10 min，去上清液；反復生理鹽水洗滌淋巴細胞3次，調整懸液淋巴細胞濃度到2x108個/ml；于妻子前臂內側行皮內注射，每個點約0.2 ml，共6個點。間隔兩周重復1次共3次；第3次治療后兩周酶聯免疫吸附試驗復查封閉抗體，同時安排試孕，待確定懷孕后重復上述免疫治療1次。

三、觀察指標

觀察淋巴細胞免疫治療后APLA的表達情況、妊娠結局；妊娠成功評定標準：妊娠超過28周且B超提示胎兒宮內發(fā)育良好，包括早產及妊娠足月分娩。

APLA的檢測：每例研究對象抽取外周靜脈血3 ml，離心析出血清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA，萊姆德，美國)進行血清APLA的檢測，嚴格按照試劑盒操作說明進行操作。

四、統計學方法

結 果

一、對照組與研究組一般情況比較

比較兩組患者年齡、流產次數，差異無統計學意義(P>0.05)(表1)。對照組21例患者服藥期間無不良反應，研究組有3例患者治療期間注射部位偶感瘙癢。

二、兩組妊娠成功率比較

對照組和研究組妊娠成功率比較：對照組21例孕婦，妊娠不成功13例，10例再次發(fā)生自然流產，3例胚胎停止發(fā)育；妊娠成功8例，其中7例妊娠至足月順利分娩存活新生兒，1例合并妊娠高血壓疾病重度子癇，孕36周行剖宮產術新生兒存活，妊娠成功率為38.10%。研究組76例孕婦，妊娠不成功25例，15例再次自然流產，10例胚胎停止發(fā)育；妊娠成功51例，其中50例妊娠至足月順利分娩存活新生兒(其中1例胎兒宮內生長受限)，1例早產，妊娠成功率67.11%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示免疫治療顯著提高了反復自然流產患者的妊娠成功率(表2)。

表1 兩組一般資料比較(x-±s)

注：與對照組比較，P>0.05

表2 兩組妊娠成功率比較[n(%)]

注：與對照組比較，P<0.05

三、研究組免疫治療后封閉抗體的變化

研究組76例免疫治療后復查封閉抗體，27例轉陽性孕婦中5例再次自然流產，3例胚胎停止發(fā)育，19例妊娠足月順利分娩存活新生兒，妊娠成功率70.37%，49例仍陰性孕婦中10例再次自然流產，7例胚胎停止發(fā)育，31例妊娠足月順利分娩存活新生兒(其中1例胎兒宮內生長受限)，1例早產，妊娠成功率為65.31%；兩者比較無統計學差異(P> 0.05)。提示免疫治療能顯著提高反復自然流產患者的妊娠成功率，但并不一定能使封閉抗體轉陽。

討 論

反復自然流產的病因很多，目前已經明確的病因包括：染色體異常、生殖系統結構異常、黃體功能不足、抗磷脂抗體綜合征、動靜脈血栓前狀態(tài)、甲狀腺功能低下及感染等因素，但仍約有50%～70%的患者病因不明，稱為原因不明性復發(fā)性流產(URSA)[2]，病因可能主要與免疫因素造成封閉抗體缺乏有關[3-4]。人類白細胞抗原(HLA)、滋養(yǎng)層及淋巴細胞交叉反應抗原(TLX)等對母體免疫系統發(fā)生刺激所產生的一類IgG抗體稱為封閉抗體[5]。Taylor等[6]首次報導淋巴細胞主動免疫治療復發(fā)性流產并獲得了81.5%以上的活嬰出生率。淋巴細胞主動免疫治療復發(fā)性流產的療效近年來已得到肯定，國內外文獻報道其有效率可達70%～90%[7]，楊章莉等[8]報道淋巴細胞主動免疫聯合地屈孕酮治療封閉抗體陰性所致復發(fā)性流產患者妊娠成功率高(83.3%)，陳建玲[9]通過對380例淋巴細胞主動免疫療法治療不明原因的復發(fā)性流產療效觀察，認為該方案治療不明原因的復發(fā)性流產有效率為89.7%。本研究結果研究組76例孕婦，妊娠成功51例，妊娠成功率67.11%；對照組21例孕婦，妊娠成功8例，妊娠成功率38.10%；兩者比較，研究組妊娠成功率顯著高于對照組妊娠成功率(P<0.05)；且研究組復查封閉抗體，27例轉陽性孕婦獲得19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，與文獻報道一致，說明淋巴主動免疫治療確能提高封閉抗體陰性所致復發(fā)性流產患者的妊娠成功率。本研究把孕前經3次淋巴免疫治療APLA仍陰性的反復自然流產患者仍作為一部分觀察對象，不管淋巴免疫治療后APLA為陽性或陰性，這是本研究與其他同類研究選取淋巴免疫治療后復查APLA陽性的有復發(fā)流產病史患者為研究對象的不同之處。

淋巴免疫治療(LIT)治療機制：1、主要是將外源體淋巴細胞注射到患者體內，從而對患者的免疫系統產生刺激，誘導產生APLA，當其再次妊娠時，APLA抗體就能識別胚胎上來自配偶的抗原，并與之結合，繼而產生封閉作用，可使胚胎得到保護并生長；2、可改變不明原因復發(fā)性流產患者外周血T細胞的功能，降低Th1/Th2比值，使患者處于以Th2為主的免疫狀態(tài)而有利于成功妊娠[10]。Th1和Th2細胞是CD4+T細胞的兩個亞群，Th1細胞的作用為分泌TNF-α，IFN-γ和IL-2等促炎因子參與移植排斥反應，而TH2細胞分泌的IL-10和IL-13等抑炎因子可以誘導機體對移植物的耐受，正常妊娠中Th1細胞比例降低而Th2細胞比例上升。3、妊娠中外周血NK細胞的細胞毒性調節(jié)就是妊娠成功與否的關鍵[11-12]，LIT能降低NK細胞活性，保護細胞滋養(yǎng)細胞免受NK細胞損傷。目前對LIT機制的探討主要集中在“封閉抗體”、Th1/Th2平衡、NK細胞活性等方面，研究認為LIT治療能夠糾正母胎界面紊亂的免疫反應[13]，維持正常妊娠。

本研究結果顯示研究組76例免疫治療后復查封閉抗體，27例轉陽性孕婦獲得19例妊娠成功，妊娠成功率70.37%，49例未轉陽性孕婦獲得32例妊娠成功，妊娠成功率為65.31%；兩者比較無統計學差異；提示淋巴免疫治療能顯著提高復發(fā)流產患者的妊娠成功率，但并不一定能使封閉抗體轉陽。由此可見淋巴免疫治療提高妊娠成功率的機理應該極其復雜，使能夠被檢測的封閉抗體轉陽只是其機理之一；這也是不明原因復發(fā)性流產的復雜性所決定的。目前臨床上對于RSA的診斷和治療監(jiān)測主要是通過ELISA法檢測母體血液中是否含有足量的抗混合HLA抗體[14-17]，由于封閉抗體的復雜性和多樣性，目前還無法對各種封閉抗體進行全面、準確、快速的定量檢測，因此封閉抗體的檢測具有難把握性，所以也就無法全面反映免疫治療的效果。妊娠是復雜的，不明原因復發(fā)性流產是更復雜的，不是單純封閉抗體缺乏都能解釋的，是否有其他的指標可以明確評價淋巴免疫治療后效果，有待于我們進一步去探索。

綜上所述，免疫治療可顯著提高反復流產患者的妊娠成功率，封閉抗體轉陽只是其紛繁復雜的機理之一。

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[編輯：王慧萍]

Effect of immunotherapy with paternal lymphocyte for patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody

WANG Xin，LI Pei-xu*

DepartmentofGynecology，The150thHospitalofPLA，Luoyang471003

Objective：To observe the effect of immunotherapy with paternal lymphocyte for the patients with recurrent spontaneous abortion & negative anti-paternal lymphocyte antibody(APLA).

Recurrent spontaneous abortion； Anti-paternal lymphocyte antibody； Immunotherapy

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.11.009

2016-03-01；

2016-04-20

王欣，女，河南南陽人，學士，主治醫(yī)師，婦產科專業(yè)(*