平秋婷

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所），廣東 廣州 510000）

分光光度法在食品蛋白質中二硫鍵含量測定中的應用

平秋婷

（廣東省生物工程研究所（廣州甘蔗糖業(yè)研究所），廣東 廣州 510000）

為探討分光光度法用于食品蛋白質二硫鍵含量測定的應用方法及價值，以豆?jié){為研究對象，分別對其進行處理后用分光光度法測試。結果表明，豆?jié){樣品體積與游離巰基的吸光度表現(xiàn)為較好的線性關系，y=0.168 2x，r2=0.996；樣品體積與總巰基含量的吸光度表現(xiàn)為正比，y=0.288 8x，r2=0.998；樣品中二硫鍵含量為8.886 μmol/g。由此表明，分光光度法在不同食品蛋白質二硫鍵含量測定中均具有較好的應用效果。

分光光度法；蛋白質；二硫鍵

蛋白質是一種非常重要的生物大分子，其能夠存在于一切生物體內中，是細胞最主要的一種成分，同時也是生命體的基礎構成物質，屬于天然的表面活性劑和營養(yǎng)物質[1]。但蛋白質的結構卻非常容易因二硫鍵而受到影響，并且蛋白質的結構還可能致使蛋白質的表面活性因此發(fā)生改變[2]。鑒于此，本研究用分光光度法對食品蛋白質的二硫鍵含量進行測定，旨在進一步了解蛋白質的性能和結構關系，尤其是蛋白質結構與活性性能之間的相關性。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

從市面上購入新鮮豆?jié){。所需試劑有尿素、十二烷基硫酸鈉、EDTA、無水亞硫酸鈉、濃鹽酸和三氨基甲烷等。所需儀器有pH計（METTLER TOLEDO，Seven Easy）、紫外可見光光度計（島津，UV-2550）。

1.2方法

1.2.1制備NTSB

取1 mol/L亞硫酸鈉溶液10 mL與100 mg Ellment試劑充分混合，在38 ℃條件下通入氧氣直至顏色從亮紅色轉變?yōu)榈S色，即表示完成NTSB試劑制備。

1.2.2豆?jié){中二硫鍵含量測定

①取豆?jié){置于試管中，將試管口堵上，對其進行熱處理。向試管內加入20 mL豆?jié){，將塞子擰緊，將其放置在95 ℃條件下進行水浴處理，持續(xù)90 min，對其連續(xù)進行3次重復處理。②各取2 mL（1號）與4 mL（2號）樣品，并向其中分別加入18 mL與16 mL丙酮，充分搖勻，放置10 min，再行15 min離心處理，再加入丙酮10 mL行懸浮沉淀處理，再進行15 min的離心處理，重復2次。③取20 mL緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3）加入到1號處理后豆?jié){中，另取20 mL緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）加入到2號處理后豆?jié){中。對其進行充分的振蕩處理，使其能夠完全溶解混合。④分別取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL的1號溶液置于試管中，再對各試管分別進行3次測試取平均值，取緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）相同劑量，加入到試管中，再取緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L， 0.2 mol/L Tris-HC1，0.1 mol/L Na2SO3）將其稀釋到3 mL，即可行吸光度測定。⑤分別取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL和1.50 mL的1號溶液置于試管中，再對各試管分別進行3次測試取平均值，取緩沖液（0.2 mol/L Tris-HC1，10 mmol/L 5，5'-二硫代-2-硝基苯甲酸）0.1 mL加入中，對其進行30 min的振蕩處理，再次向其中加入緩沖液（尿毒8 mol/L，1%SDS，EDTA 3 mmol/L，0.2 mol/L Tris-HC1）將其稀釋到3 mL，即可行吸光度測定。

1.2.3巰基和二硫鍵含量計算公式

當pH值達到8時，NTB的摩爾消光系數(shù)為13 600 mol/L·cm。

其中，A412nm指吸光度；D用于表示稀釋倍數(shù)×20；C表示豆?jié){固形物的含量；V表示牛奶或豆?jié){的體積[3]。

2　結果與分析

通過對豆?jié){進行90 min熱處理，經(jīng)分光光度法測定結果顯示，所取得的樣品體積與游離巰基的吸光度表現(xiàn)為較好的線性關系，并且線性回歸之后即可獲得線性方程式：y=0.168 2x，r2=0.996（見圖1）。

圖1　豆?jié){熱處理90min后游離巰基圖

取得的樣品體積與總巰基含量的吸光度表現(xiàn)為正比，并且線性回歸之后即可獲得線性方程式：y=0.288 8x，r2=0.998（見圖2）。通過豆?jié){樣品測試，其含有的二硫鍵含量為8.886 μmol/g。

圖2　豆?jié){熱處理90min后總巰基圖

3　結論

通過對豆?jié){樣品中蛋白質二硫鍵含量進行測定，結果證實，分光光度法所獲得的巰基含量與吸光度均表現(xiàn)為較好的線性關系，這表明分光光度法用于食品蛋白質二硫鍵含量測定的方法具有可操作性和實用性[4]，能夠用于了解蛋白質性能與結構的關系。

[1]王 芳，包怡紅，于 震.食品中蛋白質快速檢測技術的研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（11）：372-375.

[2]何保山，王 丹，左春艷，等.用分光光度法快速測定蛋白質含量的研究[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2011，31（4）：27-29，35.

[3]梁琴琴，李永生.流動注射分光光度法快速測定乳制品中的蛋白質含量[J].分析化學，2011，39（9）：1412-1417.

[4]房列濤，蘭 雪，沈秀軍，等.雙波長600nm/460nm分光光度法測定蛋白質含量研究[J].生物學雜志，2015，32（4）：94-97.

Application of Spectrophotometry in the Determination of Two Sulfur Bond in Food Protein

Ping Qiuting
（Guangdong Provincial Bioengineering Institute (Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute), Guangzhou 510000, China）

To explore the application method and value of Spectrophotometry for determination of two sulfur bond in food protein, soybean milk as the research object, the test was carried out by spectrophotometry after treatment. The result showed taht the volume of soybean milk sample and the absorbance of free thiol group showed a good linear relationship, y=0.168 2x, r2=0.996; The sample volume was proportional to the total content of the thiol group, y=0.288 8x, r2=0.998; The content of two sulfur in the sample was 8.886 μmol/g. It indicated that the spectrophotometric method has a good efect on the determination of the two sulfur bond in diferent food proteins.

Spectrophotometry; Protein; Two sulfur bond

TS207.3

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.18.031

平秋婷（1983-），女，廣州人，本科，中級；主要研究方向為食品檢測。