趙玉明，馬玲，謝海軍*

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

模擬胃腸液環(huán)境下Mozzarella干酪提取液抗氧化活性

趙玉明1，馬玲2，謝海軍1*

（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801）

為評價干酪成熟過程中形成的活性肽及存活的發(fā)酵劑菌種對人體的抗氧化作用，對不同菌種組合Mozzarella干酪的蒸餾水、pH4.6醋酸緩沖液和12%三氯乙酸（TCA）提取液在模擬胃腸液環(huán)境下對DPPH自由基的清除率以及還原力進(jìn)行測定。結(jié)果表明，所有不同菌種組合Mozzarella干酪的不同溶劑提取液在模擬胃腸液的環(huán)境下具有一定的抗氧化活性，并且模擬腸液的抗氧化活性大大低于模擬胃液環(huán)境，活性下降最高達(dá)88.35%。添加干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LPC-37的3號Mozzarella干酪提取液在模擬胃腸液環(huán)境下的抗氧化活性高于其他Mozzarella干酪，其水、pH4.6醋酸緩沖液、12%TCA提取液在模擬腸液環(huán)境下對DPPH清除率分別為73.96%、30.28%、70.27%，還原力分別為0.37、0.18、0.18。

Mozzarella干酪；發(fā)酵劑；模擬胃腸液；抗氧化活性

干酪成熟期間在殘留凝乳酶、牛乳中固有的纖維蛋白溶酶、發(fā)酵劑及非發(fā)酵劑所產(chǎn)生的蛋白酶、肽酶的作用下形成了一系列的功能性活性物質(zhì)，其中的抗氧化肽在體外有很強的抗氧化活性，相關(guān)肽的分離及功能活性已有報道[1]，如PRITCHARD S R等[2]報道市售切達(dá)奶酪中分子質(zhì)量＞10 ku的肽對DPPH清除率較高，MEIRA S M M等[3]對巴西南部和阿根廷的奶酪水溶性提取液中的生物活性肽的抗氧化活性進(jìn)行了研究，而國內(nèi)主要是對蛋白酶解后的成分進(jìn)行分離及功能驗證[4-6]，對干酪中的活性成分的研究報道很少。ABAD A-GARC A L等[7]發(fā)現(xiàn)在鄉(xiāng)村干酪中添加益生菌（干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌）形成了更多的抗氧化活性肽。有關(guān)功能成分在模擬胃腸液中的活性可以間接反映其在體內(nèi)的活性，相關(guān)的報道較多[8-10]，但有關(guān)干酪成熟過程中提取液在模擬胃腸液環(huán)境下的抗氧化活性少見報道，本研究主要就不同菌種制作的Mozzarella干酪提取液在模擬胃腸液下的抗氧化活性進(jìn)行測定，為評價干酪成熟過程中形成的抗氧化肽及存活的菌種對人體的抗氧化作用提供理論參考，為益生菌在干酪中的應(yīng)用提供理論支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮牛乳：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)牧站。唾液鏈球菌嗜熱亞種（Streptococcus salivariussubsp.Thermophilus）CH9和保加利亞乳桿菌德氏亞種（Lactobacillus delbrueckilsubsp.Bul-garicus）LB：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院畜產(chǎn)品加工實驗室；干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）LPC-37、雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）BI-07、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）LA14、凝乳酶Stamix 1150（11 350 IU）：丹尼斯克中國有限公司。

氯化鐵、鐵氰化鉀、醋酸、醋酸鈉、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；胰蛋白酶（250U/L）、胃蛋白酶（3 000 U/L）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

酸化MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.6，121℃滅菌15 min。

M17基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蛋白胨1（酪蛋白的胰蛋白酶消化物）2.5 g，蛋白胨2（肉的胃蛋白酶消化物）2.5 g，蛋白胨3（大豆的木瓜酶消化物）5 g，酵母提取物2.5 g，牛肉膏5 g，β-磷酸甘油二鈉10 g，硫酸鎂0.25 g，抗壞血酸0.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水950 mL，pH 7.1～7.2，121℃滅菌15 min。

乳糖溶液：乳糖10 g，蒸餾水100 mL，121℃滅菌15 min。

M17合成培養(yǎng)基：M17基礎(chǔ)培養(yǎng)基95 mL，乳糖溶液5 mL。

1.2儀器與設(shè)備

BS 224 S電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；DL-CJ-2F醫(yī)療型潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；TDL-4臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；R201D-11旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；精密酸度計pH211：上海雷茲儀器有限公司；721可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種的活化

在液體MRS培養(yǎng)基將凍干菌粉進(jìn)行活化（42℃，10～12 h），然后在滅菌脫脂乳中依次活化，直到菌種42℃，4 h凝乳良好，適合做發(fā)酵劑，再進(jìn)一步擴大為生產(chǎn)發(fā)酵劑。

1.3.2Mozzarella干酪及提取液制備

Mozzarella干酪制作采用無鹽漬新工藝[11]。1%（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1）混合發(fā)酵劑，成熟四個月，記為1號干酪；1%（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1）混合發(fā)酵劑，成熟一年，記為2號干酪；0.5%干酪乳桿菌LPC-37+ 0.5%（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1）混合發(fā)酵劑，成熟一年，記為3號干酪；0.5%嗜酸乳桿菌LA14+0.5%（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1）混合發(fā)酵劑，成熟一年，記為4號干酪；0.5%雙歧桿菌BI-07+0.5%（保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌=1∶1）混合發(fā)酵劑，成熟一年，記為5號干酪。

準(zhǔn)確稱取成熟后的5種干酪各30 g三份，將干酪切碎并充分研磨，分別加入蒸餾水、pH 4.6醋酸緩沖溶液、12% TCA各100 mL，攪勻靜置1 h后，用雙層濾紙過濾，取下層清液，所得清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮呈黏稠狀，用30 mL蒸餾水溶解稀釋，并于離心機中1 000 r/min離心10 min，取上層清液，即為干酪提取液，置于4℃冰箱中待用。

1.3.3模擬胃腸液的制備[12-14]

模擬胃液：稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL、胃蛋白酶10 g，搖勻后加水至1 000 mL。

模擬腸液：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.8，另取胰蛋白酶10 g加適量水使之溶解，將兩液混合并加水至1 000 mL。

1.3.4干酪提取液在模擬胃腸液中反應(yīng)

分別取1 mL稀釋后的干酪提取液于試管中（標(biāo)注），置于37℃恒溫水浴箱中，一段時間后分別向各試管中加入4 mL胃液（37℃），并于37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)30 min，然后至于冰水中終止反應(yīng)。

用同樣的方法將各干酪提取液于模擬腸液中進(jìn)行反應(yīng)。

1.3.5干酪提取液對DPPH自由基清除能力的測定[15-17]

在試管中分別加入0.5 mL反應(yīng)后的樣液和1 mL DPPH溶液充分振搖后放于暗處在室溫下反應(yīng)30 min，然后于波長517 nm處測定吸光度值。并測0.5 mL樣液加1.5 mL甲醇的吸光度值作對照，用1 mL DPPH溶液加等體積的甲醇作空白，測定時用無水甲醇調(diào)零。按照下列公式計算樣品對DPPH自由基的清除能力。

式中：A為樣液與DPPH試劑混合液的吸光度值；Ab為樣液與空白溶劑混合液的吸光度值；A0為DPPH試劑與空白溶劑混合液的吸光度值。

1.3.6干酪提取液還原力的測定[18-20]

取于模擬胃（腸）中反應(yīng)后的樣液各1 mL，分別加入0.2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH= 6.6，0.2 mol/L）和0.5 mL 1%K3Fe（CN）6于試管中，混勻，在50℃水浴中反應(yīng)20 min，用流水速冷，而后加入1 mL的10%三氯乙酸混勻，3000r/min離心10min，取上清夜1.5mL，加0.2 mL新配的0.1%FeCl3和3 mL蒸餾水搖勻后，以蒸餾水調(diào)零，在波長700 nm處檢驗溶液的吸光度值。

1.3.7多肽含量及乳酸菌數(shù)的測定

多肽含量的測定參考文獻(xiàn)[21-22]，采用雙縮脲法；乳酸菌數(shù)的測定參考文獻(xiàn)[23-24]，采用MRS稀釋平板法。

2　結(jié)果與分析

2.1不同提取液在模擬胃腸液環(huán)境中對DPPH自由基清除率

由圖1可知，5種不同發(fā)酵劑制作Mozzarella干酪的水溶性提取液在模擬胃液環(huán)境下具有較強的清除DPPH自由基的能力，但在模擬腸液的環(huán)境下其清除能力都大大降低，可能水溶性提取液中的抗氧化成分在模擬腸液環(huán)境下被降解為無抗氧化活性成分，具體機理有待進(jìn)一步研究。添加0.5%干酪乳桿菌LPC-37制備的3號Mozzarella干酪水溶性提取液在模擬腸液的環(huán)境下仍有較高的清除能力，與其他干酪有顯著性差異（P＜0.05）這可能與特定的發(fā)酵劑對干酪基質(zhì)蛋白質(zhì)的降解有關(guān)，也可能與菌種的耐受不良環(huán)境能力有關(guān)，因為菌種本身也有一定的抗氧化活性。GUPTAN A等[19，25]報道發(fā)酵食品及干酪中分離到的發(fā)酵劑和非發(fā)酵劑菌種具有一定的抗氧化活性，但植物乳桿菌（L.plantarum）C88在胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后其抗氧化活性較對照顯著降低，而胰蛋白酶處理后其活性更低。

圖1　不同Mozzarella干酪水溶性提取液在模擬胃腸液環(huán)境下對DPPH自由基清除率Fig.1　DPPH free radical scavenging rate of soluble extracts from different Mozzarella cheeses by distilled water in the simulated gastrointestinal fluid

圖2　不同Mozzarella干酪12%TCA提取液在模擬胃腸液環(huán)境下對DPPH自由基清除率Fig.2　DPPH free radical scavenging rate of soluble extracts from different Mozzarella cheeses by 12%TCA in the simulated gastrointestinal fluid

由圖2可知，5種干酪的12%TCA提取液在模擬胃腸液的環(huán)境下都具有較高的清除DPPH自由基的能力，模擬腸液環(huán)境后較模擬胃液環(huán)境對DPPH自由基的清除率有所降低。在模擬胃液的環(huán)境下其清除率都低于水溶性提取液，在模擬腸液環(huán)境下清除率反而高于水溶性提取液。由于12%TCA提取液中一般包含小肽及氨基酸類，反映干酪基質(zhì)中蛋白降解的深度，而這些小肽類（特別是N端含有疏水性氨基酸）和氨基酸（尤其是疏水性的氨基酸）有很強的抗氧化活性[3，26]。此外，一些氨基酸如組氨酸（由于其咪唑環(huán)分解后可作為氫受體，捕捉自由基）、酪氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸本身都具有較強的自由基清除能力[3，26]。在模擬腸液中12%TCA提取液抗氧化活性較高可能與其中溶解的部分具有抗氧化活性的氨基酸有關(guān)，因而12%TCA提取液在模擬胃腸液反應(yīng)后對DPPH自由基的清除率仍然較高。3號干酪12%TCA提取液對DPPH自由基的清除率仍高于其他干酪，但差異不顯著（P＞0.05），這與3號干酪所添加的干酪乳桿菌有關(guān)，干酪乳桿菌不僅降解干酪中的蛋白形成了抗氧化成分，同時干酪乳桿菌能夠耐受胃腸道不良環(huán)境而存活并發(fā)揮抗氧化作用。

圖3　不同Mozzarella干酪pH 4.6醋酸緩沖液提取液在模擬胃腸液環(huán)境下對DPPH自由基清除率Fig.3　DPPH free radical scavenging rate of soluble extracts from different Mozzarella cheeses by pH 4.6 acetic acid buffer solution in the simulated gastrointestinal fluid

由圖3可知，pH 4.6醋酸緩沖液提取液在模擬胃腸液環(huán)境下對DPPH自由基的清除率低于水溶性提取液和12% TCA提取液，模擬腸液環(huán)境下對DPPH自由基清除率低于模擬胃液環(huán)境下，3號干酪在模擬胃腸液環(huán)境下對DPPH自由基的清除率顯著高于其他干酪（P＜0.05）。pH 4.6醋酸緩沖液提取液能將未降解的酪蛋白沉淀，多肽、氨基酸溶解其中，一般用以反映干酪基質(zhì)中蛋白降解的廣度，所包含的肽段大于12%TCA提取液，因而其抗氧化活性低于12%TCA提取液。

2.2不同提取液在模擬胃腸液環(huán)境中的還原力

還原力在一程度上表明了此物質(zhì)的抗氧化活性大小，但由于評價抗氧化方法的不同，還原力和清除自由基之間有時難以對應(yīng)。由圖4可知，不同菌種組合Mozzarella干酪的水溶性提取液在模擬腸液中的還原力較模擬胃液中低，這與清除DPPH自由基的結(jié)果一致。3號干酪水溶性提取液在模擬胃腸液中的還原力高于其他干酪。GARC ARUIZ A等[27]報道在模擬胃液環(huán)境下，一般乳酸菌菌數(shù)下降3個數(shù)量級，而干酪乳桿菌（L.casei）CIAL-51和干酪乳桿菌（L.casei）CIAL-52只下降1個數(shù)量級，在模擬腸液環(huán)境下也有很高的存活率，充分說明干酪乳桿菌具有耐受不良環(huán)境的能力。

圖4　不同Mozzarella干酪水溶性提取液在模擬胃腸液環(huán)境中的還原力Fig.4　Reducing power of soluble extracts from different Mozzarella cheeses by distilled water in the simulated gastrointestinal fluid

圖5　不同Mozzarella干酪12%TCA提取液在模擬胃腸液環(huán)境中的還原力Fig.5　Reducing power of soluble extracts from different Mozzarella cheeses by 12%TCA in the simulated gastrointestinal fluid

由圖5可知，不同菌種組合Mozzarella干酪的12%TCA提取液在模擬胃腸液中的還原力較水溶性提取液低，在模擬腸液環(huán)境下還原力低于模擬胃液環(huán)境，可能與抗氧化肽、菌群在腸液不良環(huán)境下的降解有關(guān)，3號干酪12%TCA提取液在模擬胃腸液中的還原力最高，但差異不顯著（P＞0.05），可能與12%TCA提取液中較高的多肽含量及其在模擬胃腸液環(huán)境中的穩(wěn)定性有關(guān)。

圖6　不同干酪pH 4.6醋酸緩沖液提取液在模擬胃腸液環(huán)境中的還原力Fig.6　Reducing power of soluble extracts from different Mozzarella cheeses by pH 4.6 acetic acid buffer solution in the simulated gastrointestinal fluid

由圖6可知，不同菌種組合Mozzarella干酪的pH 4.6醋酸緩沖液提取液在模擬腸液中的還原力較模擬胃液中有所降低，而2號3號Mozzarella干酪的pH 4.6醋酸緩沖液提取液在模擬胃腸液中還原力高于其他干酪，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.33號Mozzarella干酪提取液模擬胃腸液環(huán)境下的多肽含量及乳酸菌數(shù)量的測定

由于3號干酪提取液在模擬胃腸液環(huán)境下的抗氧化活性較高，而抗氧化活性與提取液中的多肽、乳酸菌數(shù)有直接的關(guān)系，因而對其提取液中的多肽及乳酸菌數(shù)量在模擬胃腸液下的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果見表1。

表1　3號Mozzarella干酪提取液模擬胃腸液環(huán)境下的多肽含量及乳酸菌數(shù)量Table 1　Polypeptide content and lactic acid bacteria colony count of soluble extracts from No.3 Mozzarella cheeses in the simulated gastrointestinal fluid

由表1可知，3號Mozzarella干酪的不同溶劑提取液在模擬胃腸液中的多肽含量不同，12%TCA提取液中的含量最高，pH4.6醋酸緩沖液提取液最低，而乳酸菌數(shù)量以水溶性提取液中的最高，12%TCA提取液最低。在模擬腸液環(huán)境下多肽含量和乳酸菌數(shù)都有一定程度的降低，因而模擬腸液的抗氧化活性較模擬胃液的低，結(jié)合前面的抗氧化結(jié)果分析，充分說明抗氧化活性的發(fā)揮不僅與其中的多肽含量有關(guān)而且與提取液中的乳酸菌數(shù)量、種類也有關(guān)。SAH B N P等[28]發(fā)現(xiàn)，添加有干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 39酸奶發(fā)酵粗提液的抗氧化活性大大提高。

不同菌種組合Mozzarella干酪不同提取液的抗氧化活性不同，可能由于不同乳酸菌在代謝過程中形成的一系列胞內(nèi)外蛋白酶、肽酶活性不同，進(jìn)而其對干酪中蛋白質(zhì)的水解程度不同，也可能與不同的菌種產(chǎn)生酶的量以及酶的釋放方式與作用方式不同有關(guān)，也可能與提取液中成分及菌數(shù)有關(guān)。尤其在模擬胃腸液不良環(huán)境下，各提取液中的肽類、氨基酸、菌數(shù)有很大差異。

3　結(jié)論

不同菌種組合Mozzarella干酪的不同溶劑提取液在模擬胃腸液的環(huán)境下具有一定的抗氧化活性，模擬腸液的抗氧化活性低于模擬胃液環(huán)境，水溶性提取液較其他兩種提取液在模擬胃液的環(huán)境下具有較高的抗氧化活性，3號Mozzarella干酪提取液在模擬胃腸液環(huán)境下的抗氧化活性高于其他Mozzarella干酪，在Mozzarella干酪中添加干酪乳桿菌可以提高其對人體的抗氧化作用。

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Antioxidant activity of soluble extracts from Mozzarella cheese in simulated gastrointestinal fluid

ZHAO Yuming1,MA Ling2,XIE Haijun1*
(1.Biology Institute of Shanxi,Taiyuan 030006,China; 2.College of Food Science and Technology,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)

In order to evaluate the antioxidant activity of bioactive peptide and viable starter cultures from cheese during ripening process on human body,the DPPH free radical scavenging rate and reduce power of soluble extracts from the Mozzarella cheese with various strains by distilled water, pH 4.6 acetic acid buffer solution and 12%trichloroacetic acid(TCA)in the simulated gastrointestinal fluid were determined.The results showed that the soluble extracts from the Mozzarella cheese with various strains by the different solvents had a certain antioxidant activity in the simulated gastrointestinal fluid,and the antioxidant activity in the simulated intestinal fluid was much lower than that in simulated gastric fluid.The antioxidant activity was up to 88.35%.The antioxidant activity of soluble extracts from No.3 Mozzarella cheese addingLactobacillus casei)LPC-37 in the simulated gastrointestinal fluid was higher than that of other Mozzarella cheese.The DPPH free radical clearance rate of soluble extracts by distilled water, pH 4.6 acetic acid buffer solution and 12%TCA in the simulated gastrointestinal fluid were 73.96%,30.28%and 70.27%,respectively,and the reduce power were 0.37,0.18 and 0.18,respectively.

Mozzarella cheese;starter culture;simulated gastrointestinal fluid;antioxidant activity

TS252.1

0254-5071（2016）10-0107-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.024

2016-08-23

山西省科技攻關(guān)項目（20090321107）

趙玉明（1965-），男，副研究員，本科，研究方向為生物技術(shù)、食品加工。

謝海軍（1962-），男，副研究員，碩士，研究方向為食品加工。