蔣志國，李斌*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

菠蘿蜜果皮多酚超聲輔助提取工藝及降血糖活性研究

蔣志國，李斌*

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南?？?70228）

采用響應(yīng)面法對(duì)菠蘿蜜果皮中的多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)乙醇溶液萃取得多酚粗提物，用XAD-7HP大孔樹脂對(duì)多酚粗提物進(jìn)一步分離純化，并采用鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，研究了菠蘿蜜果皮多酚的降血糖作用及其機(jī)制。結(jié)果表明，超聲波輔助提取最佳工藝為料液比1∶59（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)35%，超聲溫度55℃，超聲時(shí)間41 min和超聲功率360 W，在該條件下多酚得率為5.89 mg/g。經(jīng)XAD-7HP大孔樹脂純化后的多酚含量由13.41%提高到63.26%，純化倍數(shù)為4.71。降血糖活性初步研究結(jié)果表明，菠蘿蜜果皮多酚能顯著降低鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖濃度，有一定的降血糖活性。

菠蘿蜜果皮；多酚；超聲輔助提??；降血糖活性

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllusLam.）屬于?？颇静ぬ}屬，是世界著名的熱帶水果之一，國內(nèi)以海南種植最多、最為集中[1]。菠蘿蜜果肉爽脆、蜜甜、芳香濃郁，營養(yǎng)成分十分豐富，因此常被加工成果酒[2]、果干[3]、果汁[4]等產(chǎn)品。然而，研究者對(duì)占果實(shí)總質(zhì)量約42%的菠蘿蜜下腳料果皮中的生物活性物質(zhì)研究卻甚少。近年來研究發(fā)現(xiàn)多酚類化合物具有抗病毒和抗氧化[5]、抑制腫瘤細(xì)胞生長[6]、降血糖和降血脂[7]等功效，因而激發(fā)了人們研究和開發(fā)利用多酚類化合物的極大興趣。

植物多酚類物質(zhì)的提取通常采用溶劑浸泡、熱回流及堿提酸沉等方法，但多酚類物質(zhì)的提取效率均不理想[8]。超聲波能夠產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)，并具有強(qiáng)烈的空化效應(yīng)，能夠造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，從而加速了有效成分的溶出，在縮短提取時(shí)間的同時(shí)避免了高溫對(duì)功效成分的破壞[12]。近年來，將超聲波輔助提取法應(yīng)用于植物細(xì)胞壁的破碎，有效提高了生物活性物質(zhì)的提取率[9-10]。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的高效方法，可確定各因素及其交互作用在工藝過程中對(duì)響應(yīng)值的影響，準(zhǔn)確地反映因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[11]。

本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助提取菠蘿蜜果皮多酚（jackfruit peel polyphenols，JPP）的工藝，大孔吸附樹脂對(duì)多酚進(jìn)一步分離純化，并對(duì)其降血糖活性進(jìn)行了初步研究，旨為實(shí)現(xiàn)菠蘿蜜的綜合利用、提高產(chǎn)品的附加值提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

菠蘿蜜：?？谑腥f福新村農(nóng)貿(mào)市場；清潔級(jí)美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（體質(zhì)量20 g左右）：浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；2，2-二苯基-1-苦基肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（純度＞99%）、沒食子酸（純度＞99%）、鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、二甲雙胍（純度＞99%）：美國Sigma公司；過硫酸鉀、福林酚試劑（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；XAD-7HP大孔吸附樹脂：南開大學(xué)化工廠。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

KQ-400KDE型數(shù)控超聲波清洗器：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機(jī)：成都一科儀器設(shè)備有限公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；T6型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JPST-5血糖儀：北京怡成生物電子技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1原料的預(yù)處理

新鮮的菠蘿蜜果肉和果皮分離后，取菠蘿蜜果皮清洗干凈，并于60℃烘干、粉碎、過40目備用。

1.3.2菠蘿蜜果皮中多酚含量測定

參照FANG X S等[13]的方法，略有改動(dòng)。稱取0.5 g菠蘿蜜果皮粉末，超聲輔助萃取得多酚提取液，經(jīng)抽濾后用蒸餾水定容至100 mL，即為樣品溶液。取1.0 mL樣品溶液于10 mL比色管中，分別加入3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%的Na2CO3溶液和1 mL福林-酚試劑，并用蒸餾水定容至10 mL，室溫避光靜置40min后于波長760nm處測定吸光度值。以沒食子酸質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=14.229 0X+ 0.023 7，相關(guān)系數(shù)為R2=0.996 3。按照回歸方程計(jì)算樣品中的多酚含量（以沒食子酸含量計(jì)），多酚提取率及純度計(jì)算公式如下：

式中：Y為多酚提取率，mg/g；C為沒食子酸含量，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g；P為多酚純度，%；E為多酚粗提取物的質(zhì)量，mg。

1.3.3單因素試驗(yàn)

稱取0.5 g菠蘿蜜果皮粉末，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別在料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，超聲溫度為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，超聲時(shí)間為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min，超聲波功率為160 W、200 W、240 W、280 W、320 W、360 W、400 W條件下，以多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究上述各因素對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)菠蘿蜜果實(shí)多酚提取率影響顯著的因素，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，中心重復(fù)試驗(yàn)為5次，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface experiments

1.3.5大孔吸附樹脂富集分離菠蘿蜜果皮多酚類化合物

稱取超聲輔助萃取多酚粗物1.0 g，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、pH值為5的菠蘿蜜果皮多酚提取液，將預(yù)處理后的XAD-7HP大孔吸附樹脂裝填于2.5 cm×60 cm的層析柱中，以1.0 mL/min流速上樣，當(dāng)樹脂吸附達(dá)到飽和時(shí)，即流出液無多酚檢出，停止上樣，然后依次用蒸餾水、體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇、體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇及體積分?jǐn)?shù)為90%乙醇溶液分別洗脫，洗脫流速2.0mL/min。收集乙醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到初步純化的菠蘿蜜果皮多酚（JPP）。1.3.6糖尿病小鼠模型的建立

參照J(rèn)IANGZG等[14]的方法，略有改動(dòng)。將小鼠隨機(jī)分成2組，對(duì)照組：給予普通飲食喂養(yǎng)；II型糖尿病組：高脂高糖高蛋白飲食喂養(yǎng)3個(gè)月，按照150 mg/kg劑量腹腔一次性注射鏈脲佐菌素（STZ）（粉劑溶于0.1 mol/L pH 4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中），對(duì)照組按照上述方法腹腔注射檸檬酸緩沖液。72h后，尾靜脈取血測定血糖含量，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖持續(xù)陽性為造模成功。以血糖＞16.7 mmol/L者作為糖尿病小鼠，將小鼠隨機(jī)分成糖尿病模型組，二甲雙胍組（陽性對(duì)照）250 mg/（kg·d），以及菠蘿蜜果皮多酚（JPP）100 mg/（kg·d）、200 mg/（kg·d）和300 mg/（kg·d）劑量組，每組10只。

1.3.7血糖測定

分別于第7、14、21、28天給藥后禁食12 h，從小鼠尾靜脈取血，用血糖儀測定空腹血糖水平。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響

由圖1可知，料液比在1∶20～1∶60（g∶mL）時(shí)，隨著料液比的變大，增加了目標(biāo)物與溶劑接觸面的濃度差，更有利于多酚的溶出，多酚提取率呈持續(xù)增大的趨勢(shì)。當(dāng)料液比達(dá)到1∶60（g∶mL）時(shí)，再增加乙醇用量，多酚提取率增加不明顯。因此，從節(jié)約試劑的角度考慮，料液比選擇1∶60（g∶mL）為宜。

圖1　料液比對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on polyphenols yield of jackfruit peel

2.1.2乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響

溶劑提取主要是利用被提取物與提取溶劑的相似相溶原理，當(dāng)提取溶劑的極性與菠蘿蜜果皮中多酚類化合物的極性相似時(shí)，能夠最有效的將多酚類化合物提取出來[15]。由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%～30%時(shí)，多酚提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，多酚提取率最大；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞30%時(shí)，多酚提取率逐漸下降。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)30%為宜。

圖2　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響Fig.2　Effect of ethanol content fraction on polyphenols yield of jackfruit peel

2.1.3超聲溫度對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響

圖3　超聲溫度對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic temperature on polyphenols yield of jackfruit peel

由圖3可知，隨著超聲溫度的提高，導(dǎo)致傳質(zhì)的加強(qiáng)和目標(biāo)物溶解度的提高，多酚提取率呈持續(xù)增大的趨勢(shì)。當(dāng)超聲溫度為10～50℃時(shí)，多酚提取率隨溫度增高而增加；當(dāng)超聲溫度＞50℃之后，多酚提取率增加不明顯，而且溫度太高容易造成多酚氧化降解。因此，選擇超聲溫度50℃為宜。

2.1.4超聲時(shí)間對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響

由圖4可知，超聲時(shí)間為10～40 min時(shí)，多酚提取率隨著超聲時(shí)間的延長呈持續(xù)增大的趨勢(shì)，超聲時(shí)間＞40 min之后，多酚提取率趨于穩(wěn)定，說明超聲時(shí)間的延長并不能提高多酚提取率。因此，選擇超聲時(shí)間40 min為宜。

圖4　超聲時(shí)間對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic time on polyphenols yield of jackfruit peel

2.1.5超聲功率對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響

圖5　超聲功率對(duì)菠蘿蜜果皮多酚提取率的影響Fig.5　Effect of ultrasonic power on polyphenols yield of jackfruit peel

由圖5可知，隨著超聲功率的增加，多酚提取率不斷增加，這是由于功率越大，超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)越顯著，菠蘿蜜果皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞越徹底，有利于多酚類物質(zhì)的溶出。當(dāng)超聲功率為160～360 W，多酚提取率隨超聲功率增高而增加；當(dāng)超聲功率達(dá)到280 W時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大值；當(dāng)超聲波功率＞360 W之后，多酚提取率趨于穩(wěn)定，這是由于超聲功率達(dá)到一定值后，產(chǎn)生大量的熱，部分多酚發(fā)生氧化導(dǎo)致?lián)p失。因此，選擇超聲功率360 W為宜。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定超聲波功率360 W，選取影響顯著的4個(gè)因素（料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間），以多酚提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，共設(shè)計(jì)29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，中心重復(fù)試驗(yàn)為5次，用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2　Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2　Design and results of Box-Benhnken experiments

表3　回歸模型方差分析Table 3　Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚提取率（Y）的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y=5.84-0.011X1+0.14X2+0.15X3-0.001 667X4-0.045X1X2+ 0.038X1X3-0.075X1X4-0.10X2X3+0.040X2X4+0.01X3X4-0.14X12-0.094X22-0.10X32-0.15X42

由表3可知，超聲波輔助提取菠蘿蜜果皮多酚所建立的回歸模型極顯著，回歸P＜0.000 1，表明該模型是極顯著的；失擬項(xiàng)P=0.133 3＞0.05，表明試驗(yàn)誤差較小。并且由統(tǒng)計(jì)分析可知，決定系數(shù)R2=0.961 7，調(diào)整決定系數(shù)R2adj= 0.923 4，這說明該回歸模型擬合程度較好，應(yīng)用該回歸模型能夠?qū)Τ暡ㄝo助萃取菠蘿蜜果皮多酚的結(jié)果進(jìn)行較好的預(yù)測和分析。由F值知各因素對(duì)多酚產(chǎn)影響的大小順序?yàn)椋篨3（超聲溫度）＞X2（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞X1（料液比）＞X4（超聲時(shí)間）。其中，超聲溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)的一次項(xiàng)，料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、超聲時(shí)間的二次項(xiàng)，料液比和超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度的交互項(xiàng)及回歸分析對(duì)多酚提取率的影響都達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。

根據(jù)回歸方程可以繪制各因素對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖6。響應(yīng)面圖是回歸方程的形象描述，能夠直觀反映各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩因素間交互作用的類型。響應(yīng)面圖曲面坡度越陡峭、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互作用顯著，反之坡度平緩、等高線呈圓形則兩因素交互作用小[16]。由圖6可知，超聲時(shí)間和料液比、超聲溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用的響應(yīng)面坡度陡峭，等高線均呈現(xiàn)橢圓、扁平狀，表示上述因素之間的相互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

圖6　各因素兩兩交互作用對(duì)多酚提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6　Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on polyphenols yield

2.2.2驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)以上的試驗(yàn)結(jié)果分析以及模型擬合，利用Design-Expert 8.0軟件分析得出菠蘿蜜果皮多酚提取的最佳工藝為：料液比1∶59.2（g∶mL），乙醇體積分?jǐn)?shù)34.95%，超聲溫度54.88℃，超聲時(shí)間40.95 min，菠蘿蜜果皮多酚提取率的預(yù)期值約為5.92mg/g。為方便實(shí)際操作，將該工藝條件簡化為：料液比1∶59（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、超聲溫度55℃，超聲時(shí)間41min。根據(jù)最佳工藝條件，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，所得的菠蘿蜜果皮多酚提取率平均值為5.89 mg/g（含量13.41%），與預(yù)期值相接近，說明該響應(yīng)面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

2.3大孔吸附樹脂富集分離菠蘿蜜果皮多酚類化合物

多酚類化合物兼具苯環(huán)及羥基結(jié)構(gòu)單元，能通過疏水性和極性相互作用被具有優(yōu)良物理性質(zhì)的的極性或弱極性的大孔樹脂所親和吸附。研究表明，極性的非離子型大孔樹脂XAD-7HP兼具大比表面積及平均孔徑，具有對(duì)天然活性小分子化合物的高效吸附與分離能力，特別是多酚類化合物[17]。

由表4可知，對(duì)于XAD-7HP樹脂柱層析，干物質(zhì)回收率最高的組分為水洗脫組分，但其多酚含量最低，說明其中雜物質(zhì)較多。隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，洗脫組分中多酚含量先增加后減少，以體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗脫組分中多酚含量最高，達(dá)到63.26%。純化后的多酚含量由13.41%提高至63.26%，純化倍數(shù)為4.71。

表4　XAD-7HP大孔樹脂不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫組分分析結(jié)果Table 4　Analysis results of different ethanol content elution fractions by XAD-7HP macroporous resin

2.4菠蘿蜜果皮多酚對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

由表5可知，小鼠經(jīng)鏈脲佐菌素造模后血糖值明顯高于正常小鼠（P＜0.01）。模型對(duì)照組未經(jīng)治療情況下，血糖一直維持在較高水平。給藥后，菠蘿蜜果皮多酚高、中劑量組從第2周開始，能顯著降低糖尿病小鼠血糖水平，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），且300 mg/（kg·d）高劑量組小鼠的血糖水平跟陽性藥物二甲雙胍組小鼠的血糖水平在4周后比較接近，與模型對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），表明菠蘿蜜果皮多酚具有一定的降血糖效果，并且體現(xiàn)為劑量依賴關(guān)系，其降血糖機(jī)理需進(jìn)一步研究。

表5　菠蘿蜜果皮多酚對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響Table 5　Effect of jackfruit peel polyphenols on blood glucose of diabetic micemmol/L

3　結(jié)論

采用超聲波輔助萃取技術(shù)，通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菠蘿蜜果皮中多酚的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳工藝條件為料液比1∶59（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)35%、超聲溫度55℃，超聲時(shí)間41 min和超聲功率360 W。在該最佳條件下，多酚提取率為5.89 mg/g。

采用XAD-7HP大孔樹脂對(duì)超聲波輔助提取的菠蘿蜜果皮多酚粗提物進(jìn)行純化，純化后的多酚含量由13.41%提高至63.26%，純化倍數(shù)為4.71，表明大孔樹脂XAD-7HP對(duì)菠蘿蜜果皮中的多酚物質(zhì)具有較好的分離純化能力。

初步降血糖結(jié)果表明，菠蘿蜜果皮多酚能顯著降低糖尿病小鼠血糖，有一定的抗氧化及降血糖活性，但其降血糖機(jī)理尚需要深入研究。

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Ultrasonic-assisted extraction technology and hyperglycemic effect of polyphenols from jackfruit peel

JIANG Zhiguo,LI Bin*
(College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China)

The extraction conditions of polyphenols from jackfruit peel were optimized by response surface methodology.The polyphenols crude extracts were obtained by ethanol solution extraction,and were separated and purified by XAD-7HP macroporous resin.By diabetic mice models induced with streptozotocin,the hyperglycemic effect and its mechanism of polyphenols from jackfruit peel were were researched.The results showed that the optimal process conditions of ultrasonic assisted extraction were solid-liquid ratio 1∶59(g∶ml),ethanol content 35%,extraction temperature 55℃,time 41 min,and ultrasonic power 360 W.Under the conditions,the polyphenols yield was 5.89 mg/g.After XAD 7 HP macroporous resin purification,the polyphenols content increased from 13.41%to 63.26%,purification fold was 4.71.The preliminary results of hyperglycemic effect showed that jackfruit peel polyphenols could significantly reduce blood glucose concentration of diabetic mice models induced with streptozotocin, and had a certain hyperglycemic ability.

jackfruit peel;polyphenols;ultrasonic assisted extraction;hyperglycemic effect

TS209

0254-5071（2016）10-0078-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.017

2016-06-14

海南省自然科學(xué)基金（20153157）；海南省高等學(xué)校科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（Hnky2015ZD-3）

蔣志國（1977-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)。

李斌（1966-），男，實(shí)驗(yàn)師，本科，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)。