杜建紅寇新民王艷麗涂顯勤

（1成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，四川 成都610017；2成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院，610015）

HPLC測定止痛壯骨散中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量

杜建紅1寇新民2王艷麗1涂顯勤2

（1成都軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗(yàn)所，四川 成都610017；2成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院，610015）

目的：建立高效液相色譜法測定止痛壯骨散中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量。方法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠（250 mm×4.6 mm，5μm）為填充劑色譜柱，流動相：乙腈-水（30∶70），流速1.0 m L/m in，檢測波長212 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。結(jié)果：川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度在10.22～ 204.44μg/m L（n=7）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 3）；回收率在98.40%～ 101.16%之間，試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.07%（n=9）。結(jié)論：該方法操作簡便、準(zhǔn)確、專屬性好，可用于止痛壯骨散質(zhì)量控制的方法。

止痛壯骨散；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；高效液相色譜法

止痛壯骨散為成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑，由杜仲、續(xù)斷、桑寄生等9味中藥材組成，方中杜仲甘溫，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，“主腰脊痛，益精氣，堅(jiān)筋骨”，為治腎虛腰痛要藥；續(xù)斷增強(qiáng)杜仲補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨功效，對腰部勞損，能行血脈、續(xù)筋骨，故二者為本方君藥。腎虛，寒濕之邪易犯，桑寄生苦溫，配以“主治濕痹邪”之酸、可增強(qiáng)杜仲、續(xù)斷補(bǔ)腎壯陽，且善逐寒濕，為臣藥。本方具有活血化瘀，溫經(jīng)通絡(luò)，壯腰固腎等功效，臨床用于腰肌勞損，風(fēng)濕痹痛，陳舊性軟組織傷，久治不愈的各種筋骨痛。該藥2000年獲得制劑批準(zhǔn)文號，分別于 2005年、2010年按要求換發(fā)批準(zhǔn)文號，期間標(biāo)準(zhǔn)未作修訂。根據(jù)止痛壯骨散中的處方組成，綜合考慮，參照文獻(xiàn)[1-2]建立高效液相色譜法（HPLC）測定君藥續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量的方法，以更好地控制本品的質(zhì)量。

1　儀器與試藥

島津LC-20AB型液相色譜儀；電子分析天平（Sartorius CPA225D，感量0.1 mg）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品（批號：111685-201304；含量：94.30%；來源于中國食品藥品檢定研究院）；止痛壯骨散（每袋裝50 g，成都軍區(qū)八一骨科醫(yī)院，批號：20131129，20140224，20140416），乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為：乙腈-水（30∶70）；檢測波長：212 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 m L/min；進(jìn)樣量：10μL.

2.2供試品制備方法考察

2.2.1提取方式考察取供試品（批號：20131129）約1.5 g，4份，精密稱定，采用甲醇作為提取溶劑，分別采用超聲（功率240W，頻率40 kHz）、回流方法提取60分鐘，取出放冷后，再用流動相稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液，分別測定供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1中測定結(jié)果可知，超聲提取比回流提取所制備的供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量略高，且超聲提取方法簡便易行。因此，選擇超聲（功率240W，頻率40 kHz）提取作為止痛壯骨散中續(xù)斷含量測定供試品溶液的提取方法。

表1　提取方式考察結(jié)果

2.2.2提取溶劑考察取供試品（批號：20131129）約1.5 g，精密稱定，分別用50%甲醇、甲醇、流動相作為提取溶劑（平行制備兩份），超聲60分鐘，取出，放冷，過濾，取續(xù)濾液用流動相稀釋至刻度，搖勻作為供試品溶液，分別測定供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，試驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，50%甲醇和甲醇的超聲提取效果無明顯差異，用流動相提取的含量略低于前兩種溶劑的提取量且易堵塞濾頭。擬采用甲醇作為本品含量測定的供試品提取溶劑。

表2　提取溶劑考察結(jié)果

2.2.3提取溶劑用量考察取供試品（批號：20131129）約 1.5 g，6份，精密稱定，采用不同量的甲醇作為提取溶劑（平行制備兩份），超聲（功率240 W，頻率40 kHz）提取60分鐘，制備供試品溶液，分別測定供試品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，對于稱樣量相同的供試品，采用25 m L和50 m L的甲醇提取，結(jié)果差異較小，暫定采用25 m L的溶劑進(jìn)行超聲提取。

表3　提取溶劑用量考察結(jié)果

2.2.4提取時(shí)間考察取供試品（批號：20131129）約1.5 g，精密稱定，甲醇作為提取溶劑（平行制備兩份），分別超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）10，20，30，45分鐘，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得，分別測定供試品溶液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量。試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4　提取時(shí)間考察結(jié)果

結(jié)果顯示，超聲提取10，20，30，45分鐘，供試品溶液中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量無明顯的差異，表明在此提取時(shí)間段內(nèi)樣品中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ基本提取完全，綜合考慮，采用20 m in作為供試品溶液的提取時(shí)間。

2.3溶液的制備

①供試品溶液的制備取本品約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 m L，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）60分鐘，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 m L，置10 m L量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。②對照品溶液的制備取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋，制成每1m L含0.18mg的溶液，搖勻，即得。③陰性對照溶液按處方比例及工藝制備缺續(xù)斷的陰性對照樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.4專屬性考察

分別吸取供試品，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示陰性對照溶液色譜峰對測定無干擾，專屬性良好，見圖1。

圖1　止痛壯骨散的HPLC圖譜

2.5線性關(guān)系考察

精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，制備對照品儲備液，再用流動相稀釋成一系列的線性對照品溶液。按照擬定的測定條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度X（μg/m L）為橫坐標(biāo)，數(shù)據(jù)分別為10.22，20.44，51.11，102.22，122.67，153.33，204.44，川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積Y為縱坐標(biāo)，數(shù)據(jù)分別為19 415，39 488，100 277，227 266，259 789，326 449，452 892，進(jìn)行回歸，回歸方程為：

Y=2 221.4X-7 155.9，

試驗(yàn)結(jié)果顯示，川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度在10.22～204.44μg/m L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＝0.999 3）。

2.6精密度試驗(yàn)

取同一對照品溶液（每1 m L含0.18 mg的溶液），按照擬定的測定條件重復(fù)測定6次，記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積，考察進(jìn)樣精密度，試驗(yàn)結(jié)果RSD為0.08%，表明進(jìn)樣精密度良好。

2.7溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新配制的川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液及供試品溶液，分別在0，2，4，8，12小時(shí)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10μL，記錄川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積，試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照品溶液及供試品溶液均在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好（RSD小于2%）。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取本品（批號：20131129），稱取6份，按擬定方法制備供試品溶液，測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.94%，表明該方法重現(xiàn)性較好。

2.9回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，取已知含量的供試品 （批號：20131129，含量：0.8%）9份，每份約0.75 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品3，5，9 mg（每個(gè)水平3份），照擬定的方法制備供試品溶液并測定川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，計(jì)算川續(xù)斷皂苷Ⅵ的回收率，結(jié)果見表5。

表5　回收率試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果RSD為1.07%，回收率在98.40%～101.16%之間，表明擬定的含量測定方法回收率良好。

2.10樣品測定

采用經(jīng)過驗(yàn)證，專屬性、重復(fù)性良好，準(zhǔn)確度良好的含量測定方法，對于多批樣品中的川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量進(jìn)行測定，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6　多批樣品測定結(jié)果

3　討論

為加強(qiáng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化、科學(xué)化管理，提高醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量，保障公眾用藥安全，按《中國藥典》（2010年版）及有關(guān)補(bǔ)充要求，遵循“科學(xué)、規(guī)范、實(shí)用”的原則，對制劑標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行升級研究。因本制劑原制劑標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控項(xiàng)目與指標(biāo)與藥典差距較大，本文在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項(xiàng)目擬定過程中，對君藥杜仲、續(xù)斷和臣藥桑寄生等均進(jìn)行了前期預(yù)試驗(yàn)，對3種藥材的化學(xué)成分或活性成分進(jìn)行測試，杜仲活性成分綠原酸和桑寄生活性成分槲皮素的HPLC試驗(yàn)中色譜峰分離度效果不佳，而續(xù)斷化學(xué)成分川續(xù)斷皂苷Ⅵ的HPLC試驗(yàn)系統(tǒng)性參數(shù)較好，結(jié)合武密山等[3]報(bào)道續(xù)斷皂苷Ⅵ具有促進(jìn)大鼠體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞增殖和分化的作用，在基因水平上為篩選促進(jìn)骨形成的有效藥物提供了作用靶點(diǎn)，故選擇作為含量測定指標(biāo)。

本文的波長選擇方面，參照《中國藥典》（2010年版）一部續(xù)斷含量測定項(xiàng)目，擬定以川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量作為衡量指標(biāo)，在進(jìn)行紫外光譜掃描后，川續(xù)斷皂苷Ⅵ在212 nm波長處有最大吸收，故選擇測定的波長為212 nm。

本文的含量限度確定方面，根據(jù)《中國藥典》（2010年版）對于續(xù)斷藥材的質(zhì)量控制的規(guī)定，以及本品是由續(xù)斷等原藥材粉直接入藥，考慮轉(zhuǎn)移率為90%，因此本品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的最低含量為2.4 mg/g，結(jié)合實(shí)際測定結(jié)果（由于各批次樣品的藥材批次不同，因此多批樣品的含量結(jié)果有一定差異），暫擬定本品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量限度為：不得少于2.4 mg/g。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2010年版）一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄XVIIIA.

[2]吳春園，王俊，高錦飚.高效液相色譜法測定仙靈骨葆膠囊中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2014，8（17）：238-239.

[3]武密山，趙素芝，任立中，等.川續(xù)斷皂苷Ⅵ誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（2）：222-226.

Determ ination of AsperosaponinⅥ Content in Zhitong Zhuanggu San by HPLC

Du Jianhong，Kou Xinmin，Wang Yanli，Tu Xianqin（1 Institute for Drug and Instrument Control of Chengdu M ilitary Region，Sichuan Chengdu 610017，China；2 Bayi Orthopedics Hospital of Chengdu M ilitary Region，610015）

Objective：To develop a HPLC method for determination of asperosaponinⅥ content in zhitong zhuanggu san.M ethods：HPLC analysis was carried out on a C18column（250 mm×4.6 mm，5μm），using acetonitrile-water（30∶70）as mobile phase at a flow rate of 1.0 m L/min.The detection wavelength was 212 nm，while the column temperature was 30℃，and the injection volume was 10μL.Results：The linear range of asperosaponinⅥwas 10.22～204.44μg/mL（n=7，r＝0.999 3）.The average recovery was 98.40%～101.16%（n=9），w ith a RSD of 1.07%.Conclusion：The method is simple，accurate and specific，which may be used for the quality control of zhitong zhuanggu san.

Zhitong Zhuanggu San；AsperosaponinⅥ；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.005

軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)課題（14ZJZ15-2）

杜建紅，男，副主任藥師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：yjsdjh@163.com

（2016-07-05）