呂 潔，梁 燕，趙菁菁，張 靜，吳 浪，張 顏，李云洲

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

干擾LYC-B基因調(diào)控番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)及主要品質(zhì)性狀

呂 潔，梁 燕*，趙菁菁，張 靜，吳 浪，張 顏，李云洲

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

構(gòu)建含有番茄紅素β-環(huán)化酶（lycopene β-cyclase，LYC-B）基因LYC-B中801 bp和301 bp兩段保守序列的RNA干擾植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌果實(shí)注射法遺傳轉(zhuǎn)化紫色番茄果實(shí)，通過卡那霉素抗性篩選、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及LYC-B基因表達(dá)量鑒定獲得轉(zhuǎn)基因植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株成熟果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)及主要品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，干擾LYC-B基因后番茄果實(shí)中檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)主要為醇類、醛類、酮類、酯類和其他類。與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株中總揮發(fā)性物質(zhì)種類增加了6 種：醛類3 種、酮類2 種、酯類1 種；醇類個(gè)數(shù)不變；其他類減少1 種。醛類物質(zhì)相對(duì)含量不變，醇類物質(zhì)相對(duì)含量減少，酮類、酯類和其他類相對(duì)含量增加。特征揮發(fā)性物質(zhì)反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯和2-異丁基噻唑等的相對(duì)含量增加。番茄紅素的含量增加了16.78%，可溶性固形物、抗壞血酸和總酸等含量增加，β-胡蘿卜素和總糖含量變化顯著。干擾LYC-B基因不僅影響了番茄果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)，還增加了番茄紅素、可溶性固形物、抗壞血酸、總酸等的含量。

番茄紅素β-環(huán)化酶；揮發(fā)性物質(zhì)；營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)；RNA干擾；農(nóng)桿菌果實(shí)注射

櫻桃番茄（Lycopersicon esculentum Mill. var. cerasiforme Alef）是茄科番茄屬的一個(gè)變種，果實(shí)外形嬌艷、可口美味、富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)且風(fēng)味多樣，深受消費(fèi)者的青睞[1]。番茄果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量決定著番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)[2]，番茄紅素的含量影響著番茄的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。類胡蘿卜素代謝一方面為一些重要揮發(fā)性物質(zhì)合成提供前體物質(zhì)，另一方面番茄紅素是類胡蘿卜素代謝的直接產(chǎn)物，番茄紅素β-環(huán)化酶（lycopene β-cyclase，LYC-B）基因LYC-B是類胡蘿卜素代謝中的關(guān)鍵酶基因[3]。徐加新[4]、吳江敏[5]等先后用反義LYC-B基因?qū)Υ蠊r食番茄進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)基因后代中獲得了番茄紅素含量和可溶性固形物含量均顯著增加的材料，同時(shí)發(fā)現(xiàn)可溶性固形物在不同世代及單株之間表現(xiàn)不穩(wěn)定，有些株系固形物含量比對(duì)照有所降低。這些結(jié)果表明干擾LYC-B基因可以影響果實(shí)番茄紅素和可溶性固形物的含量，而LYC-B基因?qū)τ趽]發(fā)性物質(zhì)及其他品質(zhì)性狀的研究甚少。

紫色櫻桃番茄具有極強(qiáng)的抗氧化性等營(yíng)養(yǎng)保健功能，受到人們的青睞，但其獨(dú)特感官風(fēng)味卻不為多數(shù)人所接受[6]。為此，采用病毒誘導(dǎo)技術(shù)，研究LYC-B基因沉默對(duì)紫色果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)和主要色素的影響，取得了預(yù)期的結(jié)果[7]。為了得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，本實(shí)驗(yàn)擬使用含有LYC-B基因RNA干擾表達(dá)載體的工程農(nóng)桿菌，對(duì)紫色番茄果實(shí)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)基因果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)和主要色素以及可溶性固形物、抗壞血酸、總糖和總酸含量等主要品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定，分析LYC-B基因?qū)Ψ哑焚|(zhì)性狀的影響，為番茄轉(zhuǎn)基因育種和品質(zhì)性狀的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

紫色番茄材料為黑櫻桃（保存單位編號(hào)：CI5004），由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)資源課題組提供。2015年3月底定植于園藝學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)塑料大棚內(nèi)，當(dāng)植株第3花序第1、2朵花開放時(shí)掛牌標(biāo)記開花日期。

RNA干擾LYC-B基因表達(dá)載體由王巧麗等[8]構(gòu)建。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上登錄的番茄紅素β-環(huán)化酶（登錄號(hào)為X86452.1）基因序列設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物。P1F和P1R克隆61～861 bp的LYC-B1片段，P2F和P2R克隆480～781 bp的LYC-B2片段，LYC-B1反向和LYC-B2正向連接能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。該表達(dá)載體具有卡那霉素抗性基因，通過卡那霉素抗性對(duì)陽性植株進(jìn)行篩選。

農(nóng)桿菌GV3101、pBI121質(zhì)粒，由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)資源課題組提供；內(nèi)切酶、連接酶 立陶宛Fermentas公司；pMD?18-T Vector、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒 大連寶生物工程公司；番茄紅素標(biāo)品（色譜純） 北京中科儀友化工公司；MS培養(yǎng)基等其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；電泳儀北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Xcalibur1.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；HP-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、恒溫磁力攪拌器 美國(guó)Troemner公司；100 μm PDMS固相微萃取頭、SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄 美國(guó)Supelco公司；勻漿機(jī) 美的集團(tuán)；UV-3802型紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；PAL-1數(shù)顯糖度計(jì) 上海上天精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果實(shí)注射法RNA干擾LYC-B基因的遺傳轉(zhuǎn)化

參照Yasmeen等[9]方法對(duì)果實(shí)進(jìn)行注射處理。塑料大棚內(nèi)選取成熟度和大小均勻一致的堅(jiān)熟期[10]番茄果實(shí)，用1 mL注射器吸取含有LYC-B基因干擾載體的工程農(nóng)桿菌菌液，從果頂處垂直插入果實(shí)中軸緩緩注射菌液，當(dāng)菌液從萼片處溢出時(shí)停止注射。注射后的果實(shí)掛牌標(biāo)記，同時(shí)標(biāo)記未注射菌液的堅(jiān)熟期果實(shí)野生型（wild type，WT）為對(duì)照。植株在大棚中正常栽培管理，待果實(shí)進(jìn)入完熟期時(shí)摘取果實(shí)收種后進(jìn)行后續(xù)篩選實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.1 卡那霉素篩選鑒定

分別選取注射菌液種子和對(duì)照處理的番茄種子，消毒滅菌后播種在含有100 mg/L卡那霉素的1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，每瓶放25 粒種子。放置在人工氣候箱內(nèi)28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，移至組培間，光周期為16 h光照和8 h黑暗交替，25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)45 d后，將存活幼苗進(jìn)行煉苗，移至滅菌基質(zhì)中[11]。

1.3.1.2 PCR鑒定

待幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，CTAB法提取葉片基因組DNA，用含有LYC-B目的基因和載體序列的引物P4（目的片段大小為476 bp）進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。RNA干擾LYC-B基因表達(dá)載體質(zhì)粒為陽性對(duì)照，WT植株DNA作為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用質(zhì)量濃度1 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳紫外下成像檢測(cè)。

1.3.1.3 實(shí)時(shí)定量PCR鑒定

將PCR的陽性植株和WT植株移栽到西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)塑料大棚內(nèi)，管理?xiàng)l件相同。果實(shí)成熟時(shí)用TRIZOL法提取果實(shí)的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以稀釋后質(zhì)量濃度為50～60 ng/μL的cDNA為模板，利用實(shí)時(shí)定量-PCR進(jìn)行LYC-B基因表達(dá)量分析。實(shí)時(shí)定量-PCR反應(yīng)體系為20 μL：2 μL cDNA模板，10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ，0.8 μL Forward Primer（10 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（10 μmol/L），ddH2O補(bǔ)充至20 μL體系。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min，并用3 步法擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)（95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s）；之后是融解曲線的運(yùn)行，從55 ℃開始，每30 s增加0.5 ℃直至95 ℃，目的是檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異專一性。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)技術(shù)重復(fù)，按照2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[12]。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.2 品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

鑒定出的轉(zhuǎn)基因成熟果實(shí)用勻漿機(jī)打成勻漿，液氮冷凍后保存在-80 ℃，用于后續(xù)品質(zhì)測(cè)定。

1.3.2.1 揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase micro-extraction gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用技術(shù)測(cè)定番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)。參照Viljanen[13]、常培培[14]等的方法。

樣品制備：稱取果肉勻漿約14 g，加入3 g NaCl，于40 mL頂空瓶中。將頂空瓶置于50 ℃恒溫磁力攪拌器上，平衡10 min，頂空吸附40 min，進(jìn)樣口處解吸3 min，進(jìn)行GC-MS分析。每個(gè)處理重復(fù)3 次取平均值。

高效液相色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX彈性石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口250 ℃；升溫程序?yàn)?0 ℃保持2.5 min，10 ℃/min升至110 ℃，然后以3.0 ℃/min升溫至180 ℃，15.0 ℃/min升溫至230 ℃維持3 min；載氣（He）流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron ionization，EI）離子源；電子能量70 eV；離子源溫度250 ℃；SM離子掃描，質(zhì)量掃描范圍為m/z 35～500。

定性定量分析：果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果運(yùn)用計(jì)算機(jī)檢索并與圖譜庫（NIST 2011）標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照，并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行匹配分析[15-17]，統(tǒng)計(jì)檢測(cè)出的化合物，按照化合物官能團(tuán)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行歸類分析。運(yùn)用峰面積歸一法，即各成分峰面積與總峰面積比進(jìn)行定量分析[18]。

1.3.2.2 其他品質(zhì)性狀測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19]對(duì)其他品質(zhì)性狀進(jìn)行測(cè)定。高效液相色譜法測(cè)定番茄紅素及β-胡蘿卜素的含量[20]。PAL-1數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)量可溶性固形物含量；鉬藍(lán)比色法測(cè)定抗壞血酸含量；硫酸蒽酮比色法測(cè)定總糖含量；酸度計(jì)測(cè)定總酸含量。以上指標(biāo)測(cè)定3 次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；用Origin 9.0軟件進(jìn)行作圖；用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)桿菌果實(shí)注射法RNA干擾LYC-B基因的遺傳轉(zhuǎn)化

2.1.1 卡那霉素篩選鑒定

非轉(zhuǎn)化植株由于葉綠素合成受阻發(fā)生黃化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)化植株由于NPTⅡ基因的表達(dá)，具有卡那霉素抗性可以存活下來。收獲種子在卡那霉素培養(yǎng)基上共播種261 粒種子，在45 d時(shí)存活數(shù)為156 株，存活率達(dá)59.77%。煉苗5 d后，存活的幼苗鍛煉后移栽到滅菌基質(zhì)中，共移出156 株。待1 周后，觀察有52 株成活，成活率為33.33%。

2.1.2 PCR鑒定

待移栽幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)，提取DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證。由圖1A可知，在檢測(cè)的52 株植株中，檢測(cè)出1 株陽性植株，編號(hào)為T1-18。根據(jù)上文可知卡那霉素篩選時(shí)共播種261 粒種子，由此可推測(cè)出果實(shí)注射法得到陽性植株的比率約為4‰。

2.1.3 實(shí)時(shí)定量PCR鑒定

采取成熟時(shí)陽性和WT植株番茄果實(shí)（圖1B），實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)LYC-B基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如圖1C所示，設(shè)定對(duì)照WT植株LYC-B基因的相對(duì)表達(dá)量為100%，T1-18 LYC-B基因的相對(duì)表達(dá)量約降低了50%。由此可知，陽性植株T1-18中LYC-B基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照。表明了通過果實(shí)注射農(nóng)桿菌法對(duì)紫色番茄果實(shí)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

圖1 農(nóng)桿菌果實(shí)注射法RNA干擾LYC-B基因的遺傳轉(zhuǎn)化Fig. 1 Antisense RNA interference of the lycopene β-cyclase (LYC-B) gene by Agrobacterium injection method in tomato fruits

2.2 RNA干擾LYC-B基因?qū)Ψ压麑?shí)揮發(fā)性物質(zhì)的影響

表2 RNA干擾LYC-B 基因番茄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量Table 2 The relative contents of volatile compounds in transgenic tomato fruits

續(xù)表2

如表2所示，T1-18和WT果實(shí)共檢測(cè)出正反匹配度大于800的物質(zhì)有47 種，總揮發(fā)性物質(zhì)均占色譜流出組分總含量的90%以上。

2.2.1 RNA干擾LYC-B基因?qū)Ψ压麑?shí)揮發(fā)性物質(zhì)種類的影響

T1-18果實(shí)中共檢測(cè)出了40 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醇類8 種、醛類12 種、酮類5 種、酯類7 種和其他類8 種。WT中檢測(cè)到了35 種揮發(fā)性物質(zhì)，為醇類8 種、醛類9 種、酮類3 種、酯類6 種和其他類9 種。從表2結(jié)果可以看出，T1-18轉(zhuǎn)基因果實(shí)中檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)總種類高于WT，醛類物質(zhì)比WT多檢測(cè)出了丁二醛、2-壬烯醛、反-2-癸烯醛和2,4-癸二烯醛這4 種醛類物質(zhì)，2-甲基丁醛只在WT中檢測(cè)出；酮類多檢測(cè)出對(duì)羥基苯乙酮和β-紫羅酮兩種物質(zhì)；酯類多檢測(cè)出1 種，醇類個(gè)數(shù)相同；其他類少檢測(cè)出1 種。結(jié)果表明，沉默LYC-B基因后，總體上增加了果實(shí)中揮發(fā)性物質(zhì)的種類，使果實(shí)風(fēng)味多樣化。

2.2.2 RNA干擾LYC-B基因?qū)Ψ压麑?shí)揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量的影響

圖2 RNA干擾基因?qū)Ψ压麑?shí)各類揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量的影響Fig. 2 The relative contents of volatile compounds belonging to different chemical classes in transgenic tomato fruitsLYC-B

由圖2可知，T1-18與WT中醇類和醛類為主要的揮發(fā)性物質(zhì)，酮類、酯類和其他類的相對(duì)含量較低。T1-18與WT相比，除醇類相對(duì)含量降低了35.79%、醛類相對(duì)含量沒有顯著變化外，酮類相對(duì)含量增加了24.16%，酯類相對(duì)含量增加了39.33%，其他類相對(duì)含量增加了30.93%。結(jié)果表明，RNA干擾LYC-B基因顯著地降低了醇類物質(zhì)含量，增加了酮類、酯類和其他類物質(zhì)的相對(duì)含量，對(duì)果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的成分有一定影響。

2.2.3 RNA干擾LYC-B基因?qū)Ψ压麑?shí)主要特征香氣的影響

表3 RNA干擾LYC-B 基因番茄果實(shí)主要特征香氣成分及含量分析Table 3 Characteristic aroma compounds and contents in transgenic tomato fruits

番茄果實(shí)中有16 種物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大，是番茄獨(dú)有的功能性關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，被稱為“特征效應(yīng)化合物”，這些物質(zhì)為番茄果實(shí)提供獨(dú)特的香氣[21]。在T1-18轉(zhuǎn)基因和WT果實(shí)中，共檢測(cè)出了9 種特征效應(yīng)化合物（表3）。T1-18轉(zhuǎn)基因果實(shí)中，除了順-3-己烯醇和己醛的含量低于WT對(duì)照，1-戊烯-3-酮含量與WT差別不大外，反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯和2-異丁基噻唑類物質(zhì)的含量分別增加了20.99%、4.22 倍、19.03%、42.02%和81.8%，還檢測(cè)到了WT對(duì)照中沒有出現(xiàn)的β-紫羅酮，這些特征效應(yīng)化合物為果實(shí)提供了豐富的青香、花香和果香等香氣[22-24]。結(jié)果表明，T1-18轉(zhuǎn)基因果實(shí)中大部分特征效應(yīng)化合物含量的增加，豐富了果實(shí)的香味，提高了果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。

2.3 RNA干擾LYC-B基因?qū)Ψ压麑?shí)主要品質(zhì)性狀的影響

表4 RNA干擾LYC-B 基因?qū)Ψ压麑?shí)主要品質(zhì)性狀的影響Table 4 Quality traits in transgenic tomato fruits

番茄紅素、β-胡蘿卜素、可溶性固形物、抗壞血酸、總糖和總酸等主要品質(zhì)性狀變化情況如表4所示。LYC-B基因RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株T1-18中，番茄紅素的含量為6.62 mg/100 g，比WT對(duì)照增加了16.78%；β-胡蘿卜素含量與WT間差異不顯著；可溶性固形物含量為5.90%，比WT對(duì)照增加了15.69%；抗壞血酸含量為24.63 mg/100 g，與WT對(duì)照相比增加了15.8%。總糖含量為5.06%，與WT對(duì)照差異不顯著；總酸含量為0.66%，與WT對(duì)照相比增加了10.0%。結(jié)果表明，LYC-B基因表達(dá)受阻后，可以增加果實(shí)番茄紅素、可溶性固形物、抗壞血酸和總酸的含量，番茄果實(shí)類胡蘿卜素代謝間接地影響果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

3 討 論

農(nóng)桿菌果實(shí)注射遺傳轉(zhuǎn)化法是一種新的基因轉(zhuǎn)化方法，與傳統(tǒng)的葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化相比耗時(shí)少，操作簡(jiǎn)便[11]。Yasmeen等[9]用此方法注射番茄果實(shí)，發(fā)現(xiàn)堅(jiān)熟期的轉(zhuǎn)化效率比綠熟期高。本研究在堅(jiān)熟期進(jìn)行注射，收獲種子卡那霉素篩選鑒定，在45 d時(shí)幼苗存活率為59.77%，煉苗后移栽幼苗到基質(zhì)中，PCR鑒定陽性植株，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定陽性植株T1-18 LYC-B基因的相對(duì)表達(dá)量為WT對(duì)照的50%（圖1C），表明成功得到了1 株轉(zhuǎn)基因植株。幼苗移栽至基質(zhì)中的成活率只有33.33%，這就造成了轉(zhuǎn)化的陽性率大大降低，因此為移栽幼苗創(chuàng)造適宜的溫度、濕度和光照條件是提高果實(shí)注射法陽性率的關(guān)鍵所在。

番茄果實(shí)因其營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特深受消費(fèi)者喜愛。本研究檢測(cè)到的47 種揮發(fā)性物質(zhì)中，突變型植株和WT植株共有物質(zhì)有28 種，揮發(fā)性物質(zhì)種類影響了番茄果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。揮發(fā)性物質(zhì)主要分為醇類、醛類、酮類、酯類和其他類等物質(zhì)，相對(duì)含量最多的物質(zhì)是醇類和醛類。T1-18轉(zhuǎn)基因果實(shí)中，醇類物質(zhì)相對(duì)含量顯著下降，酮類、酯類和其他類物質(zhì)的相對(duì)含量增加。在衡量某種揮發(fā)性組分的作用時(shí)，除了考慮該物質(zhì)的實(shí)際含量濃度外，還要考慮該物質(zhì)的閾值濃度，閾值濃度為一種成分可以被嗅覺感知到的最低濃度。對(duì)數(shù)閾值單位為待測(cè)物中某種成分的濃度和其閾值的比值，用來表示芳香物質(zhì)的實(shí)際作用效果，為正值時(shí)，表示對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大，相反為負(fù)值時(shí)，貢獻(xiàn)較小[21]。在番茄常見的400 種揮發(fā)性物質(zhì)中，有16 種物質(zhì)的對(duì)數(shù)閾值單位大于0，Baldwin等[10]認(rèn)定它們?yōu)樘卣餍?yīng)化合物。在檢測(cè)到的9 種特征效應(yīng)化合物中，T1-18轉(zhuǎn)基因果實(shí)中反-2-己烯醛、反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯和2-異丁基噻唑等物質(zhì)的相對(duì)含量增加。反-2-庚烯醛的相對(duì)含量增加最大，它與番茄甜味物質(zhì)有關(guān)，呈現(xiàn)脂肪氣味、青草香；6-甲基-5-庚烯-2-酮為類胡蘿卜素代謝途徑中番茄紅素的降解產(chǎn)物[25]，當(dāng)轉(zhuǎn)基因果實(shí)中番茄紅素的含量升高時(shí)，它的釋放量也增加。2-異丁基噻唑是較為重要的體現(xiàn)番茄特征氣味的化合物[22]，具有番茄香味、葡萄酒味。β-紫羅蘭酮為萜類物質(zhì)，是T1-18中檢測(cè)到的特有物質(zhì)，也是番茄紅素降解的產(chǎn)物，具有特殊香氣[26-27]。其他一些揮發(fā)性物質(zhì)為番茄風(fēng)味輔助香氣物質(zhì)[25]，這些物質(zhì)相互作用，構(gòu)成番茄特有的風(fēng)味。在T1-18轉(zhuǎn)基因植株中揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量發(fā)生了變化，影響了番茄果實(shí)的風(fēng)味特性。

在番茄果實(shí)類胡蘿卜素代謝中LYC-B作用于番茄紅素，阻止其向下游轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素，促進(jìn)果實(shí)番茄紅素的積累[27]。本研究中RNA干擾LYC-B基因后T1-18轉(zhuǎn)基因植株中番茄紅素含量比WT對(duì)照增加了16.78%。這與徐加新等[4]通過葉盤法遺傳轉(zhuǎn)化反義LYC-B基因表達(dá)基因果實(shí)番茄紅素含量升高結(jié)果相同。吳江敏等[5]對(duì)反義LYC-B轉(zhuǎn)基因果實(shí)品質(zhì)性狀測(cè)定，發(fā)現(xiàn)除了番茄紅素含量升高外，大多數(shù)后代可溶性固形物含量均升高了。本研究對(duì)果實(shí)其他品質(zhì)性狀測(cè)定發(fā)現(xiàn)，LYC-B基因表達(dá)受阻后T1-18轉(zhuǎn)基因果實(shí)中，可溶性固形物、抗壞血酸和總酸的含量增加，表明果實(shí)的各個(gè)品質(zhì)指標(biāo)在一定程度上是有關(guān)聯(lián)的，但是各個(gè)性狀間通過怎樣的關(guān)系聯(lián)結(jié)，具體原因還需要深入研究。

4 結(jié) 論

利用農(nóng)桿菌果實(shí)注射法，對(duì)紫色番茄果實(shí)進(jìn)行LYC-B基因RNA干擾的遺傳轉(zhuǎn)化，通過收獲種子的卡那霉素抗性篩選、PCR鑒定及實(shí)時(shí)定量檢測(cè)LYC-B基因相對(duì)表達(dá)量，鑒定出了1株轉(zhuǎn)基因植株。通過果實(shí)注射法得到轉(zhuǎn)基因植株，為番茄遺傳轉(zhuǎn)化提供了一種有效快速的方法。轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)及主要品質(zhì)性狀測(cè)定結(jié)果表明，LYC-B基因表達(dá)量降低后，紫色番茄果實(shí)中反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水楊酸甲酯和2-異丁基噻唑等揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量增加，番茄紅素、可溶性固形物、抗壞血酸和總酸等含量增加，β-胡蘿卜素和總糖含量變化不大。綜上所述，LYC-B基因表達(dá)調(diào)控不僅影響番茄果實(shí)類胡蘿卜素代謝，也影響果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)和其他品質(zhì)指標(biāo)的構(gòu)成。番茄各個(gè)品質(zhì)性狀間是密切聯(lián)系的。

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Down-Regulated Expression of LYC-B Gene by RNA Interference Regulates the Volatiles and Main Quality Traits of Tomato Fruits

Lü Jie, LIANG Yan*, ZHAO Jingjing, ZHANG Jing, WU Lang, ZHANG Yan, LI Yunzhou (College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

This work aimed to regulate the volatile components and major quality traits of tomato fruits by down-regulation of the expression of lycopene β-cyclase (LYC-B) gene using antisense RNA interference technique. Purple tomato fruits were transformed by injection of the plant expression vector containing two conserved sequences (801 and 301 bp, respectively) of LYC-B gene. The transgenic plants were obtained kanamycin resistance screening, polymerase chain reaction and quantification of LYC-B gene expression. The volatile substances and major quality traits of ripe tomato fruits were compared between the transgenic and wild-type (WT) plants. The results showed that alcohols, aldehydes, ketones, esters and other volatiles were detected in transgenic tomato fruits. Compared with the wild-type control, six new volatile compounds were identified from the transgenic fruits, consisting of three aldehydes, two ketones, and one ester, and one compound belonging to another chemical class was detected in the control rather than the transgenic fruits. In addition, the same relative content of aldehydes was observed between both fruits, but the transgenic fruits showed decreased relative content of alcohols and increased relative contents of ketones, esters and other compounds. The characteristic volatile compounds were also increased, such as (E) 2-heptenal, 6-methyl 5-hepten-2-one, methyl salicylate and 2-isobutylthiazole, and lycopene increase by 16.78% compared with the wild-type fruits. In addition, the contents of soluble solids, ascorbic acid and total acid were also increased. On the other hand, the contents of β-carotene and total sugar were identical to those of the WT fruits. Therefore, down-regulated expression of LYC-B gene by RNA interference can affect volatile substances and enhance the contents of lycopene, soluble solids, ascorbic acid and total acid, thereby improving the nutritional quality of tomato fruits.

lycopene β-cyclase; volatile compounds; nutritional quality; RNA interference; Agrobacterium injection

10.7506/spkx1002-6630-201621033

S641.2

A

1002-6630（2016）21-0195-07

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Lü Jie, LIANG Yan, ZHAO Jingjing, et al. Down-regulated expression of LYC-B gene by RNA interference regulates the volatiles and main quality traits of tomato fruits[J]. Food Science, 2016, 37(21): 195-201. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621033. http://www.spkx.net.cn

2016-01-31

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（2011KTCL02-03）；西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)科技推廣基金項(xiàng)目（TGZX2012-02）；時(shí)勝科研基金項(xiàng)目

呂潔（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉压麑?shí)品質(zhì)性狀。E-mail：lvjielj@163.com

*通信作者：梁燕（1963—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榉堰z傳育種與蔬菜種質(zhì)資源。E-mail：liangyan@nwsuaf.edu.cn