宋宇航，倪麗娟，張白曦，陳衛(wèi)，張灝

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214000)

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含油酸培養(yǎng)基培養(yǎng)對(duì)重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化合成反10，順12-共軛亞油酸的影響

宋宇航，倪麗娟，張白曦，陳衛(wèi)，張灝*

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214000)

亞油酸異構(gòu)酶(PAI)在解脂耶氏酵母細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，以添加外源c9,c12-亞油酸(c9,c12-LA)為底物，全細(xì)胞催化合成反10，順12-共軛亞油酸(trans10,cis12-conjugated linoleic acid,t10,c12-CLA)。解脂耶氏酵母在分別含0.0(對(duì)照組)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，收集菌體轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩液中進(jìn)行全細(xì)胞催化，比較各組菌體的t10,c12-CLA產(chǎn)率，含5.0 g/L油酸組產(chǎn)物產(chǎn)率最高，達(dá)到1.34 g/g，是不含油酸組的1.4倍左右。通過(guò)PAI酶活分析及Western blot檢測(cè)PAI表達(dá)量，結(jié)果表明，培養(yǎng)基中油酸含量越高，重組解脂耶氏酵母的PAI表達(dá)量越低；對(duì)比不含油酸組和含5.0 g/L油酸組全細(xì)胞催化不同時(shí)間的t10,c12-CLA產(chǎn)量，含5.0 g/L油酸組t10,c12-CLA產(chǎn)量最高點(diǎn)的時(shí)間比不含油酸組提前約20 h；透射電子顯微鏡觀察2組的菌體狀態(tài)，含5.0 g/L油酸組細(xì)胞壁和細(xì)胞膜間隙擴(kuò)大，該變化可能增加了全細(xì)胞催化過(guò)程中底物和產(chǎn)物進(jìn)出細(xì)胞的速率，從而提高t10,c12-CLA的轉(zhuǎn)化效率。

重組解脂耶氏酵母；油酸；反10，順12-共軛亞油酸；轉(zhuǎn)化效率

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的統(tǒng)稱，在7與9位、8與10位、9與11位、10與12位、11與13位或12與14位碳原子處含有順式或反式共軛雙鍵[1]。其中反10，順12-共軛亞油酸(t10,c12-CLA)是最重要的活性單體之一，主要有抗癌生理活性及減少人類脂肪細(xì)胞中甘油三酯積累的功效[2-5]。

來(lái)源于痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)的亞油酸異構(gòu)酶(PAI)可作用于亞油酸(c9,c12-LA)分子的C9雙鍵，生成高度專一的t10,c12-CLA單體[6]。本實(shí)驗(yàn)室將PAI在解脂耶氏酵母細(xì)胞內(nèi)成功重組表達(dá)，并證明該重組菌株是適合t10,c12-CLA合成的微生物系統(tǒng)[7]。全細(xì)胞催化擁有許多優(yōu)勢(shì)：能為酶反應(yīng)提供穩(wěn)定環(huán)境、高效、可多批次轉(zhuǎn)化、產(chǎn)物易分離、易控制等[8]。利用完整的重組解脂耶氏酵母細(xì)胞作為催化劑，外源添加底物c9,c12-LA，全細(xì)胞催化合成t10,c12-CLA(圖1)。但是，重組解脂耶氏酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的阻礙是影響底物c9,c12-LA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與酶PAI接觸，產(chǎn)物t10,c12-CLA高效輸出的主要因素。增加細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，可促進(jìn)底物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與酶接觸并迅速開(kāi)始催化反應(yīng)，從而提高產(chǎn)物的合成效率，縮短整個(gè)全細(xì)胞催化反應(yīng)的時(shí)間。

圖1 重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化反應(yīng)的過(guò)程Fig.1 Process of whole-cell catalysis using recombinant Y. lipolitca

目前，關(guān)于c9,c12-LA、t10,c12-CLA以及其他脂肪酸在解脂耶氏酵母的運(yùn)輸機(jī)制還存在爭(zhēng)議，可能是簡(jiǎn)單擴(kuò)散、促進(jìn)擴(kuò)散或二者同時(shí)存在[9-10]。解脂耶氏酵母能夠以疏水性物質(zhì)為唯一碳源生長(zhǎng)繁殖，并偏好利用油酸[11]。當(dāng)其在含油酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，細(xì)胞的表面會(huì)發(fā)生改變，形成突起；壁膜間隙擴(kuò)大，利于脂肪酸進(jìn)出菌體；而且形態(tài)和生理都發(fā)生改變，更加適合在含疏水性物質(zhì)的環(huán)境中生存[12]。本文研究了重組解脂耶氏酵母在含不同濃度油酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)，PAI表達(dá)量及對(duì)應(yīng)的全細(xì)胞催化生成t10,c12-CLA的產(chǎn)率。旨在尋找一種新的重組解脂耶氏酵母培養(yǎng)基，增加細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性，提高脂肪酸底物和產(chǎn)物進(jìn)出菌體的速率，進(jìn)一步提高重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化生成t10,c12-CLA的轉(zhuǎn)化效率。

1 材料與方法

1.1 菌種

重組耶氏解脂酵母(YarrowialipolyticaCCFM-JU277-9)菌株，構(gòu)建于本實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)保藏于中國(guó)微生物菌株保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為CCFM-JU277-9。

1.2 材料與試劑

葡萄糖：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母粉：Oxoid公司；胰蛋白胨：Oxoid公司；游離亞油酸：安慶中創(chuàng)生物工程有限公司；鹽酸-甲醇溶液：如東寶灣利昌化工有限公司；十七烷酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司；t10,c12-共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司；游離亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品：sigma公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；無(wú)硫酸銨&無(wú)氨基酸酵母氮源：上海生工生物工程公司；鼠抗兔抗體：Southern Biotechnologies Associates公司；吐溫-80、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、甲醇、正己烷、甲苯、NaCl、過(guò)硫酸銨、十二烷基磺酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)市售分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀,島津公司(配FID檢測(cè)器)；UV2450型分光光度計(jì),島津公司；透射電子顯微鏡H-7650,日立公司；高精度三層搖床,上海知楚儀器有限公司；超聲波破碎儀,美國(guó)索尼克斯公司；分析天平,METTLER TOLEDO 公司；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RJ-TGL-16C臺(tái)式高速離心機(jī),上海百盛儀器設(shè)備有限公司；落地式高速冷凍離心機(jī),Thermo Scientific公司；快速核酸提取儀FastPrep-24,MP Biomedicals；恒溫培養(yǎng)箱,上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；漩渦振蕩器,IKA公司；熱風(fēng)干燥箱,BINDER公司；真空冷凍干燥機(jī),LABCONCO公司；MLS-3750型高壓蒸汽滅菌鍋,三洋公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種活化及培養(yǎng)

菌種來(lái)源于含30%甘油保菌管(-80 ℃保存)，接種YNBD平板培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，無(wú)氨基酵母氮源)1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，瓊脂粉20 g/L，調(diào)pH至5.5)，培養(yǎng)皿中28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5 d；再挑取單菌落接種5 mL的YNBD液體種子培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，無(wú)氨基酵母氮源)1.7 g/L，(NH4)2SO45 g/L，調(diào)pH至5.5)，10 mL試管28 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)48 h；2%接種量接種20 mL的YPD培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，蛋白胨 20 g/L調(diào)pH至6.5)或含不同濃度油酸培養(yǎng)基(油酸濃度0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L，代替對(duì)應(yīng)濃度的葡萄糖，使培養(yǎng)基中的碳源和氮源的比例基本一致，酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L調(diào)pH至6.5，油酸母液200 g/L，加入吐溫-80至濃度為6.25 g/L，超聲乳化)，100 mL錐形瓶28 ℃，200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。

1.4.2 全細(xì)胞催化劑制備

重組解脂耶氏酵母搖瓶培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)液，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，并用滅菌生理鹽水洗滌2次，收集酵母菌泥，作為全細(xì)胞催化劑。

1.4.3 底物亞油酸乳化母液制備

配置200 g/L亞油酸母液，加入吐溫-80至濃度為6.25 g/L，使用超聲細(xì)胞破碎儀，功率200 W冰浴超聲5 min。

1.4.4 全細(xì)胞催化方法

轉(zhuǎn)化體系共20 mL，轉(zhuǎn)化介質(zhì)為50 mmol/L的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鉀緩沖液(pH 6.8)，加入酵母菌泥至100 g/L，底物亞油酸乳化液至25 g/L。置于搖床中，28 ℃，200 r/min催化反應(yīng)。

1.4.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取不同時(shí)間的生長(zhǎng)培養(yǎng)液，4℃ 8 000 r/min離心10 min，生理鹽水洗滌菌體2次，收集菌體，真空冷凍干燥，稱量菌體干重，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體干重為縱坐標(biāo)，畫出生長(zhǎng)曲線[13]。

1.4.6 生物量測(cè)定

全細(xì)胞轉(zhuǎn)化液25 ℃ 8 000 r/min離心10 min，收集菌體，并將上清收集于干凈的離心管中，用0.85%的NaCl溶液洗滌菌體2次；洗滌后的菌體真空冷凍干燥，稱量菌體干重，減去胞內(nèi)脂質(zhì)總量，即為無(wú)脂質(zhì)生物量。洗滌菌體后的上清液與轉(zhuǎn)化液上清合并，進(jìn)行細(xì)胞外脂肪酸的測(cè)定與分析。

1.4.7 細(xì)胞外脂肪酸提取及分析

取100 μL轉(zhuǎn)化液上清于5 mL干凈玻璃瓶中，加入50 μL十七烷酸脂肪酸內(nèi)標(biāo)和1 mL 10%鹽酸-甲醇，50 ℃水浴保溫2 h，冷卻至室溫，再加入1 mL正己烷和1 mL飽和氯化鈉溶液，劇烈振蕩30 s，3 000 r/min離心3 min，取上層溶液，原體系中加入1 mL正己烷再次萃取，合并2次萃取的溶液，氮?dú)獯蹈?，加? mL正己烷，振蕩混勻，轉(zhuǎn)入氣相瓶，高效氣相色譜定性、定量分析。

1.4.8 細(xì)胞內(nèi)脂肪酸提取及分析

稱取20～25 mg真空冷凍干燥的菌體于5 mL玻璃瓶中，加入50 μL的十七烷酸脂肪酸內(nèi)標(biāo)(5 mg/ml)、1 mL 10%鹽酸-甲醇和500 μL正己烷，50 ℃水浴保溫3 h(每30 min振蕩1 min)，冷卻至室溫，加入500 μL正己烷和1 mL飽和NaCl振蕩混勻，3 000 r/min離心3 min，取上層溶液，再向原體系中加入1 mL正己烷再次萃取，合并2次萃取的溶液，氮?dú)獯蹈?，加? mL正己烷，振蕩混勻，轉(zhuǎn)入氣相瓶，高效氣相色譜定性、定量分析。

1.4.9 高效氣相色譜分析條件

色譜柱為DB-WAX(30 m×0.32 mm，φ0.25 μm；Agilent，美國(guó))，氫火焰離子(FID)檢測(cè)器檢測(cè)；氮?dú)鉃檩d氣，流量為2 mL/min，采用分流方式進(jìn)樣1 μL，分流比為15∶1，進(jìn)樣口溫度為240 ℃；升溫程序如下：120 ℃保持3 min，以5 ℃/min升溫速度至190 ℃，再以1 ℃/min升溫速度至溫度達(dá)到210 ℃，保持3 min。

脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜分析，并通過(guò)保留時(shí)間對(duì)樣品脂肪酸定性；十七烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物，通過(guò)面積歸一法計(jì)算共軛亞油酸的含量，進(jìn)行定量分析。

t10，c12-CLA產(chǎn)量(g/L)=細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的t10，c12-CLA含量(g)/轉(zhuǎn)化體系體積(L)

t10，c12-CLA產(chǎn)率(g/g)=t10，c12-CLA產(chǎn)量(g/L)/菌體無(wú)脂質(zhì)生物量(g/L)

1.4.10 透射電子顯微鏡(TEM)觀察

收集菌體，在3%戊二醛溶液中(0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH=7.2)前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗后，用鋨酸后固定，接著用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗，再用乙醇梯度脫水，利用812樹(shù)脂浸透包埋，超薄切片，檸檬酸鉛染色，最后置于透射電子顯微鏡下觀察拍照。

1.4.11 亞油酸異構(gòu)酶( PAI)粗酶液制備

按1.4.2的方法收集菌體，100 mmol/L Tri/HCl 緩沖液(pH 7.5)重懸至100 mg/mL，通過(guò)測(cè)定OD600調(diào)節(jié)菌懸液至同一濃度，加入等體積的直徑為0.5 mm的酸洗玻璃珠，快速核酸提取儀FastPrep-24振蕩破損5 min；收集破碎液4 ℃，15 000 g離心30 min；取上清，上清在4 ℃，45 000 g條件下離心90 min，收集上清即得粗酶液。

1.4.12 亞油酸異構(gòu)酶(PAI)酶活測(cè)定

酶反應(yīng)在1.5 mL的石英比色皿中，加入50 μL粗酶液，950 μL 100 mmol/L Tri/HCl 緩沖液(pH 7.5)，3 μL底物亞油酸(20 mg/mL，溶于乙醇)，25 ℃條件下，紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)實(shí)時(shí)記錄1 min內(nèi)，波長(zhǎng)234 nm的吸光值變化，并依據(jù)t10，c12-CLA在波長(zhǎng)234 nm的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PAI的酶活。

1.4.13 亞油酸異構(gòu)酶(PAI)表達(dá)的Western Blot分析方法

Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定粗酶液的蛋白濃度，取80 μL粗酶液加入20 μL 5×loading buffer，沸水處理10 min，冷卻后樣品20 μL上樣，通過(guò)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，先后用一抗(1∶10 000稀釋)和二抗(1∶5 000)孵育結(jié)合，通過(guò)HRP-ECL化學(xué)發(fā)光法及X-光曝光定影顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組解脂耶氏酵母在含不同濃度油酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

由圖2可知，重組解脂耶氏酵母分別在含0.0(不含油酸，對(duì)照組)、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，保持6組培養(yǎng)基碳源和氮源比例基本一致，各實(shí)驗(yàn)組大約都在培養(yǎng)36 h時(shí)開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期，無(wú)脂質(zhì)生物量依次為11.47、11.46、11.73、11.69、11.68和10.6 g/L，重組解脂耶氏酵母在葡萄糖為唯一碳源(不含油酸組)、葡萄糖和油酸共碳源(分別含0.1、0.5、1.0、5.0 g/L油酸組)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，無(wú)脂質(zhì)生物量高于油酸為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體(含10.0 g/L油酸組)；這可能是解脂耶氏酵母更偏好利用葡萄糖生長(zhǎng)繁殖[13]。重組解脂耶氏酵母在穩(wěn)定期初期時(shí)，生物量和PAI的表達(dá)量會(huì)達(dá)到最高[14]，所以收集穩(wěn)定期初期的菌體，作為后期實(shí)驗(yàn)的全細(xì)胞催化劑，再轉(zhuǎn)移至磷酸鹽緩沖液中，加入底物c9,c12-LA，全細(xì)胞催化合成t10,c12-CLA。

2.2 重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化合成t10，c12-CLA

收集分別在不含油酸，含0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L油酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h的重組解脂耶氏酵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至20 mL磷酸鹽緩沖液中，再添加底物c9,c12-LA，40 ℃全細(xì)胞催化反應(yīng)24 h，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的總t10,c12-CLA含量，并計(jì)算產(chǎn)物產(chǎn)率。

A-不含油酸；B-含0.1 g/L油酸；C-含0.5 g/L油酸；D-含1.0 g/L油酸；E-含5.0 g/L油酸；F-含10.0 g/L油酸圖2 重組解脂耶氏酵母在含不同濃度油酸培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growing curve of recombinant Y. lipolitca in medium in medium containing different concentration oleic acid

圖3 不同濃度油酸培養(yǎng)重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化合成t10，c12-CLA的產(chǎn)率Fig.3 Yield of t10，c12-CLA by whole-cell catalysis using recombinant Y. lipolitca cultivated in medium containing different concentration oleic acid(注：重復(fù)3次，不同字母代表組間差異顯著，P<0.05)

由圖3可知，含5.0 g/L油酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的重組解脂耶氏酵母菌體，用于全細(xì)胞催化的t10,c12-CLA產(chǎn)率最高，達(dá)到1.34 g/g；其余組產(chǎn)率由高到低分別為含1.0 g/L油酸組1.27 g/g、含10.0 g/L油酸組1.05 g/g、不含油酸組0.96 g/g、含0.5 g/L油酸組0.95 g/g、含0.1 g/L油酸組0.70 g/g?？赏茰y(cè)，存在2個(gè)造成t10，c12-CLA產(chǎn)率差異的主要原因：一是各組的亞油酸異構(gòu)酶(PAI)在菌體中的表達(dá)量存在差異；二是含不同濃度油酸培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體生理狀態(tài)發(fā)生變化，更適合在疏水性物質(zhì)中生存，菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜脂肪酸成分和狀態(tài)也發(fā)生改變，從而改變了細(xì)胞通透性，更利于c9,c12-LA和t10,c12-CLA進(jìn)出解脂耶氏酵母菌體。

2.3 重組解脂耶氏酵母在含不同濃度油酸培養(yǎng)基中的PAI表達(dá)情況

取不同濃度油酸培養(yǎng)基中的重組解脂耶氏酵母菌體，在菌體量一致的條件下，破碎細(xì)胞并收集PAI粗酶液，測(cè)定酶活。由圖4可知，不含油酸的培養(yǎng)基中以葡萄糖為唯一碳源(不含油酸組)，測(cè)得PAI的酶活最高；只有油酸為碳源時(shí)(含10.0 g/L油酸組)，PAI的酶活最低；培養(yǎng)基中油酸含量越高，PAI酶活越低。

進(jìn)一步通過(guò)圖5的Western blot圖分析PAI的表達(dá)量，使用Quantity One軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值，只含油酸為碳源培養(yǎng)重組解脂耶氏酵母菌體時(shí)(含10.0 g/L油酸組)，PAI表達(dá)量最低；以葡萄糖為唯一碳源培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)(不含油酸組)，PAI表達(dá)量最高；其余油酸和葡萄糖共碳源組的PAI表達(dá)量基本一致(分別含0.1、0.5、1.0、5.0 g/L油酸組)。該結(jié)果與酶活測(cè)定結(jié)果的趨勢(shì)基本一致，相比于油酸為碳源，葡萄糖為碳源時(shí)更利于重組解脂耶氏酵母中的PAI合成。

如果只考慮PAI表達(dá)情況這一因素，含5 g/L油酸組全細(xì)胞催化合成t10,c12-CLA的產(chǎn)率應(yīng)該低于不含油酸組，然而，結(jié)合圖3中對(duì)應(yīng)的t10,c12-CLA的產(chǎn)率，含5 g/L油酸組的產(chǎn)率明顯高于不含油酸組，說(shuō)明PAI表達(dá)不是影響全細(xì)胞催化合成t10,c12-CLA的唯一因素；可能還存在另一個(gè)主要影響因素，即本文2.2最后提到，造成t10,c12-CLA的產(chǎn)率差異的第二個(gè)原因：細(xì)胞通透性發(fā)生改變。

圖4 含不同濃度油酸培養(yǎng)重組解脂耶氏酵母表達(dá)PAI的酶活對(duì)比Fig.4 Relative activity of PAI from recombinant Y. lipolitca cultivated in medium containing different concentration oleic acid

1-不含油酸；2-含0.1 g/L油酸；3-含10.0 g/L油酸；4-含0.5 g/L油酸；5-含1.0 g/L油酸；6-含5.0 g/L油酸圖5 蛋白質(zhì)免疫印跡法分析含不同濃度油酸培養(yǎng)重組解脂耶氏酵母PAI的表達(dá)Fig.5 Expression of PAI from recombinant Y. lipolitca cultivated in medium containing different concentration oleic acid by western blot method

2.4 重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化合成t10，c12-CLA產(chǎn)量隨時(shí)間的變化

利用不含油酸的培養(yǎng)基和含5 g/L油酸的培養(yǎng)基獲得的菌體作為全細(xì)胞催化劑，合成t10,c12-CLA。圖6表示全細(xì)胞催化過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的t10,c12-CLA含量隨催化時(shí)間的變化，不含油酸組在42小時(shí)左右達(dá)到最高，而含5 g/L油酸組在22 h達(dá)到最高；圖7中對(duì)應(yīng)細(xì)胞外的t10,c12-CLA含量隨時(shí)間的變化，也存在相同的趨勢(shì)；綜合圖8，比較兩實(shí)驗(yàn)組在全細(xì)胞催化不同時(shí)間點(diǎn)的t10,c12-CLA產(chǎn)量(細(xì)胞內(nèi)外t10,c12-CLA總含量)，含5 g/L油酸組在22 h左右產(chǎn)量達(dá)到最高，約10.1 g/L，不含油酸組在42 h左右產(chǎn)量達(dá)到最高，約9.5 g/L，前者產(chǎn)量略高于后者，催化時(shí)間縮短約20 h，可以推測(cè)，含較高濃度的油酸培養(yǎng)基培養(yǎng)重組解脂耶氏酵母，可以提高細(xì)胞通透性，在全細(xì)胞催化過(guò)程中，提高脂肪酸底物和產(chǎn)物進(jìn)出菌體的速率。5 g/L是培養(yǎng)基中油酸含量的最優(yōu)濃度，油酸濃度含量過(guò)高(含10 g/L油酸組)，導(dǎo)致解脂耶氏酵母PAI表達(dá)量遠(yuǎn)低于不含油酸組(圖4和圖5)，即使該條件下培養(yǎng)的細(xì)胞通透性可能更好，但t10,c12-CLA產(chǎn)率與不含油酸組無(wú)顯著性差異(圖3)；油酸濃度含量過(guò)低(含0.1 g/L油酸組)，細(xì)胞通透性可能未發(fā)生理想的變化，PAI表達(dá)量低于不含油酸組(圖4和圖5)，致使t10,c12-CLA產(chǎn)率低于不含油酸組(圖3)。

圖6 重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化細(xì)胞內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的t10，c12-CLA含量Fig.6 Production of intracellular t10，c12-CLA at different time during whole-cell catalysis using recombinant Y. lipolitca

圖7 重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化細(xì)胞外不同時(shí)間點(diǎn)的t10，c12-CLA含量Fig.7 Production of extracellular t10，c12-CLA at different time during whole-cell catalysis using recombinant Y. lipolitca

目前，關(guān)于全細(xì)胞催化合成單一的t10,c12-CLA文獻(xiàn)報(bào)道較少，HE將亞油酸異構(gòu)酶(PAI)在釀酒酵母中成功異源表達(dá)，使PAI定位在細(xì)胞表面，外源添加c9,c12-LA為底物，全細(xì)胞催化20 h，優(yōu)化反應(yīng)條件后，僅僅獲得25.4 mg/L的t10,c12-CLA產(chǎn)量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)未優(yōu)化反應(yīng)條件下10.1 g/L的t10,c12-CLA產(chǎn)量[15]。

圖8 重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化不同時(shí)間點(diǎn)的t10，c12-CLA產(chǎn)量Fig.8 Production of total t10，c12-CLA at different time during whole-cell catalysis using recombinant Y. lipolitca

2.5 透射電子顯微鏡(TEM)觀察重組解脂耶氏酵母細(xì)胞

由圖9的TEM圖可以觀察到，含5 g/L油酸(疏水性物質(zhì))培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的間隙明顯擴(kuò)大，而不含油酸培養(yǎng)基(葡萄糖為碳源)培養(yǎng)細(xì)胞壁膜間隙無(wú)明顯變化，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該結(jié)構(gòu)的變化與脂肪酸進(jìn)入和輸出解脂耶氏酵母相關(guān)[10]。

CW-細(xì)胞壁；PS-周質(zhì)空間圖9 含5.0 g/L油酸組(左)和不含油酸組(右)培養(yǎng)細(xì)胞TEM圖Fig.9 TEM of cells from different medium: containing 5.0 g/L oleic acid(left) and no oleic acid(right)CW-cell wall, PS-periplasmic space

解脂耶氏酵母在脂肪酸(油酸)和烷烴類(癸烷、十六烷烴)等疏水性物質(zhì)為碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表面會(huì)形成高約50 nm，寬約150 nm的突起結(jié)構(gòu)；細(xì)胞的形態(tài)和生理狀態(tài)也會(huì)發(fā)生明顯變化，油酸為碳源中生長(zhǎng)的解脂耶氏酵母，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體、脂質(zhì)體和線粒體中關(guān)于疏水性物質(zhì)降解的酶增多；周質(zhì)空間由80 nm左右增加到150 nm左右，細(xì)胞壁由40 nm左右變薄為25 nm左右，這些變化提高了解脂耶氏酵母細(xì)胞在疏水性物質(zhì)中的耐受性，也提高了疏水性物質(zhì)在細(xì)胞中的運(yùn)輸效率[10,12]。根據(jù)本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及已有文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)一步證明上述推測(cè)，利用含5 g/L油酸培養(yǎng)基培養(yǎng)解脂耶氏酵母，用于全細(xì)胞催化合成t10,c12-CLA，能夠提高細(xì)胞通透性，進(jìn)而縮短底物c9,c12-LA轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高t10,c12-CLA產(chǎn)物產(chǎn)量。

3 結(jié)論

含5 g/L油酸的培養(yǎng)基是培養(yǎng)重組解脂耶氏酵母細(xì)胞用于全細(xì)胞催化合成t10,c12-CLA的最優(yōu)培養(yǎng)基，t10,c12-CLA產(chǎn)率為1.34 g/g，是不含油酸組(對(duì)照組)的1.4倍左右。通過(guò)對(duì)不同濃度油酸培養(yǎng)的重組解脂耶氏酵母中亞油酸異構(gòu)酶(PAI)的表達(dá)量比較，發(fā)現(xiàn)油酸濃度越高，PAI的表達(dá)量越低。含5 g/L油酸組全細(xì)胞催化t10,c12-CLA產(chǎn)量達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)間為約22 h，不含油酸組約為42 h，催化反應(yīng)可縮短約20 h，轉(zhuǎn)化效率明顯提高；透射電子顯微鏡觀察到含5 g/L油酸組的重組解脂耶氏酵母細(xì)胞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的間隙擴(kuò)大，可推測(cè)含油酸培養(yǎng)提高了細(xì)胞通透性，進(jìn)而提高了全細(xì)胞催化過(guò)程中c9,c12-LA和t10,c12-CLA進(jìn)出菌體的速率。綜上所述，后期的重組解脂耶氏酵母全細(xì)胞催化合成t10,c12-CLA研究中，可選擇含5 g/L油酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)重組解脂耶氏酵母細(xì)胞，制備全細(xì)胞催化劑，高效合成t10,c12-CLA。

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Influence of medium containing oleic acid on synthesis of the trans 10, cis 12-conjugated linoleic acid by whole-cell catalysis using recombinant Yarrowia lipolitca

SONG Yu-hang，NI Li-juan，ZHANG Bai-xi，CHEN Wei，ZHANG Hao*

(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Waxi 21422, China)

The linoleic acid isomerase (PAI) has been successfully expressed inYarrowialipolyticato producetrans10,cis12-conjugated linoleic acid(t10,c12-CLA) by whole-cell catalysis using exogenous free linoleic acid (LA) as substrate. Whole cells were cultivated in medium containing oleic acid of different concentration (0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0 g/L), and catalyzed in phosphate buffer. The highest yield oft10,c12-CLA was 1.34 g/g from culture containing 5.0 g/L oleic acid, which was 1.4 times of yield in experiment group without oleic acid. The PAI relative enzyme activity was analyzed and protein expression was checked by western blot. Results showed that the medium with more oleic acid leaded to lower expression of PAI. As for the production oft10,c12-CLA at different whole-cell catalysis time, the time of highestt10,c12-CLA production of experiment group with 5.0 g/L oleic acid was 20 h ahead of that of control group with 0.0 g/L oleic acid. We also investigated cell condition by transmission electron microscopy (TEM). Results showed that cells cultivated in the medium containing 5.0 g/L oleic acid displayed the wider space between cell wall and cell membrane, which might improve transporting/exporting speed of substrates and products between cells and environments, and finally increase conversion rate oft10,c12-CLA.

recombinantYarrowialipolitca; oleic acid;trans10,cis12-conjugated linoleic acid; conversion rate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610001

碩士研究生(張灝教授為通訊作者,E-mail：zhanghao@jiangnan.edu.cn)。

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(BK20150144)

2016-02-27，改回日期：2016-04-06