樸泓潔，李鉉軍

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133000）

長白山野生藍莓中還原型谷胱甘肽含量的測定

樸泓潔，李鉉軍*

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133000）

為了解長白山野生藍莓中還原型谷胱甘肽（GSH）的含量。本研究利用5，5-二疏基-2，2-二硝基苯甲酸（DTNB）衍生化法進行了定量分析。得出藍莓中GSH的含量為1.0977±0.0264毫升/克。每克藍莓粉末中GSH的含量達到0.8395毫升/克。

DTNB；藍莓；GSH

谷胱甘肽（L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，Glutathione）是一種同時具有γ-谷氨酰基和巰基的生物活性三肽化合物，作為生物體內(nèi)的非蛋白巰基化合物，谷胱甘肽主要有還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種形態(tài)，在機體中大量存在并起主要作用的是還原型谷胱甘肽。臨床上，谷胱甘肽可以迅速提高機體免疫力，在抗氧化、抗輻射、清除自由基、解毒、促進鐵質(zhì)吸收等方面具有良好的效果且無副作用；在食品加工領(lǐng)域，谷胱甘肽具有增強食品營養(yǎng)價值和強化食品風(fēng)味等功能?？茖W(xué)家們一直研究它在各種生物體內(nèi)的生理作用，其中GSH在人體各種組織細胞中的含量以及與各種疾病、組織損傷的關(guān)系至今仍然是研究的熱點[1-2]。藍莓，又稱篤斯、越橘，俗稱都柿，為杜鵑花科越橘屬野生落葉灌木，其果實為漿果，成熟后為藍紫色，球形或橢圓形，果皮有白霜。藍莓的果味鮮美、營養(yǎng)豐富，英國權(quán)威營養(yǎng)學(xué)家將藍莓列為15種健康食品之首，聯(lián)合國糧農(nóng)組織也將藍莓列為人類五大健康食品之一[3]。

本研究采用DTNB作為GSH的衍生化試劑進行超聲波細胞破壁，這種操作可以對藍莓粉末破壁的同時又可以給衍生化試劑充分的反應(yīng)時間進行衍生化反應(yīng)而生成穩(wěn)定的GSH衍生化產(chǎn)物[4]。其目的是利用衍生化試劑所進行的化反應(yīng)來避免巰基化合物從細胞內(nèi)流出時而被外界的其他化學(xué)環(huán)境破壞，從而生成穩(wěn)定的產(chǎn)物，利用其產(chǎn)物的顏色來進行分光光度分析而得到樣品中的GSH含量及定性信息[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

1.1.1 材料 藍莓購于延吉市千盛超市。

1.1.2 試劑與藥品 5，5-二疏基 -2，2-二硝基苯甲酸/DTNB、還原型谷胱甘肽、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、石油醚、海砂。

1.1.3 實驗儀器 JA-3100精密電子天平（深美儀器有限公司）；FA1004電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；CX-100高速多功能粉碎機（上海市晟喜制藥機械有限公司）；DHG-907385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-5000B冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PHS-3CpH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；

UV-1800紫外 /可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；SJ-2028R榨汁機（佛山市順德區(qū)金宜美電器有限公司）；80目網(wǎng)篩；索氏提取器。

1.2 實驗方法

1.2.1 預(yù)處理工藝流程 藍莓→清洗→挑選（無蟲害、無病變）→榨汁→烘干（50℃）→粉碎→過篩（80目）→脫脂→低溫保存待用。

1.2.2 預(yù)處理 在延吉市千盛超市購買今年新生長白山野生藍莓，進行清洗后選擇充實飽滿無病害的藍莓，放入榨汁機中制成漿狀藍莓，取潔凈的稱量瓶，加 10克海砂及一根小玻棒，置于50℃干燥箱中，干燥 1.0小時后取出，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5小時后稱量，并重復(fù)干燥至恒重。然后稱取 5～10克試樣（精確至 0.0001克），置于蒸發(fā)皿中，用小玻棒攪勻放在沸水浴上蒸干，并隨時攪拌，擦去皿底的水滴，置 50℃干燥箱中干燥4小時后蓋好取出，放入干燥器內(nèi)冷卻 0.5小時后稱量、保存，再用索式提取器對藍莓進行脫脂，脫脂時間為大約 12小時左右，脫脂處理后把藍莓放入干燥箱內(nèi)揮發(fā)掉其中的石油醚，大約需要0.5小時，剝?nèi)ズＩ?，最后放入低溫條件下，以保存待用[7]。

1.2.3 DTNB衍生化分光光度法 GSH的定量分析原理是利用5，5＇-二硫硝基苯甲酸(DTNB)衍生化試劑和植物材料同步破壁提取的樣品處理方法，采用分光光度法對枸杞中還原型谷胱甘肽(GSH)進行定性、定量分析。藍莓樣品提取過程中GSH受破壁后胞外化學(xué)環(huán)境的影響導(dǎo)致氧化變性。利用5，5＇-二硫硝基苯甲酸(DTNB)衍生化試劑同步提取，因生成穩(wěn)定的GSH的衍生化產(chǎn)物避免了GSH氧化變性導(dǎo)致的GSH分析信息丟失。用分光光度法測定 GSH含量，發(fā)現(xiàn)藍莓中含有豐富的GSH。

GSH的定量分析原理是利用DTNB在pH值為7環(huán)境中與巰基發(fā)生反應(yīng)，生成 3-羧基-4-硝基苯硫酚，其離子呈黃色而且在波長409nm處有強烈的吸收峰，并且該吸收峰在過量的DTNB的溶液下其吸光度值與加入的GSH量呈良好的線性關(guān)系[6-7]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：分別在6個試管中分別加入（0毫升，0.2毫升，0.4毫升，0.6毫升，0.8毫升，1.0毫升）2× 10-4mol/L的 GSH溶液，然后分別對應(yīng)在 6個不同濃度梯度的試管中分別加入 25毫升（20mlDTNB+5mlPBS）含有2× 10-4mol/LDTNB溶液和pH值為 7.00的PBS緩沖液，充分混勻后，等待 10分鐘，再調(diào)節(jié) pH至 7.00在409nm下確定存在強吸收峰的λ值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

GSH含量測定的具體操作方法：取 25毫升（20mlDTNB+5mlPBS）含有2×10-4mol/LDTNB溶液和pH為7.00的 PBS緩沖液作為提取液，在提取液中加入 0.25克藍莓粉末，充分混勻后放入超聲波機中進行震蕩破壁，工藝條件：500W，30分鐘。然后把提取液倒入離心管中進行離心（6000r/min10min），離心后取出 10毫升上清液，加入其 2倍體積無水乙醇溶液，然后靜置 30分鐘，在 5000轉(zhuǎn) /分鐘轉(zhuǎn)速下離心10分鐘除蛋白，倒出上清液，調(diào)節(jié)酸堿度為 pH為 7.00，用分光光度計測定其吸光值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對實驗樣品中的GSH進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

疏基與DTNB更適合在pH=7.00溶液中反應(yīng)后在409nm處測定。且實驗中GSH的定量分析的原理是根據(jù)疏基與DTNB在pH為7.00的環(huán)境中發(fā)生反應(yīng)，生成3-羧基-4-硝基苯硫酚，其3-羧基-4-硝基苯硫酚溶液中離子的顏色為黃色且在波長409nm處具有強烈吸收峰值。從而可以得出在pH為7.00時的線性回歸方程為y=0.0354x+0.0236R2=0.9922。

2.2 GSH的含量分析

根據(jù)圖1，在 pH為7.00時的線性回歸方程為 y=0.0354 +0.0236R2=0.9922根據(jù)表1平均值 0.149，得出 x=3.5424

圖1 GSH的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 樣品在409nm下吸光值含量的分析

根據(jù)計算公式m=M×n

M-溶質(zhì)的摩爾質(zhì)量

n-樣品中GSH的物質(zhì)的量

m-樣品中GSH的質(zhì)量

由上可知在pH為7.00的環(huán)境下可測得藍莓樣液中GSH的物質(zhì)的量為 2.88×10-5mol，從而可以推算出藍莓樣品中還原性谷胱甘肽的含量為（1.0977±0.0264）mg/g。每克藍莓粉末中GSH的含量達到0.8395毫克 /克藍莓中的還原性谷胱甘肽含量里處于植物中等水平。

3 結(jié)果與討論

DTNB衍生化法是在對長白山野生藍莓粉末細胞破碎的同時衍生化反應(yīng)也在進行，這樣可以使GSH不易被外界其他的環(huán)境所影響變性，使反應(yīng)產(chǎn)物更加穩(wěn)定，測定結(jié)果的數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。在 pH為 7.00的條件下，疏基與 DTNB反應(yīng)后在409nm有強吸收峰，在此光度下分析得出長白山野生藍莓中還原型谷胱甘肽（GSH）的含量 1.0977±0.0264毫克 /克，每克藍莓粉末中GSH的含量達到0.8395毫克/克。

我省長白山地區(qū)有豐富的野生藍莓資源，本研究為長白山野生藍莓資源的進一步開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

[1]蔡俊.谷胱甘肽的研究進展[J].糧食與飼料工業(yè),2000 (10):41-42.

[2]劉超，袁建國，李峰.谷胱甘肽國內(nèi)外研究進展[J].山東食品發(fā)酵,2010(04):7-10.

[3]聶飛,韋吉梅,文光琴.藍莓的經(jīng)濟價值及其在我國產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的前景探討[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(01):117-119.

[4]劉國琴,陳潔,趙雷,等.小麥胚芽中谷胱甘肽提取方法探討及工藝條件優(yōu)化 [J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報自然科學(xué)版. 2007,28(02):l-5.

[5]周惠明，朱科學(xué).小麥胚中谷胱甘肽的純化與富集的研究[J].中國糧報,2003,18(01):17-20

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5009.3-2010食品中水分的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2004.

[7]周楠迪,李寅,陳堅,等.從酵母中提取谷胱甘肽的初步研究［J］生物技術(shù),1997(04):30-33.

TS255.7

A

10.14025/j.cnki.jlny.2016.21.030

樸泓潔，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，在讀本科生，研究方向：食品分析。

李鉉軍，朝鮮族，碩士，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，講師，研究方向：食品分析。