張慶彬, 孔祥貴, 程 成

(1. 浙江工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用物理系, 杭州 310023;2. 中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所激發(fā)態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長春 130033)

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疏水上轉(zhuǎn)換納米晶的均相體系聚合物包覆及在發(fā)光檢測中的應(yīng)用

張慶彬1, 孔祥貴2, 程 成1

(1. 浙江工業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用物理系, 杭州 310023;2. 中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所激發(fā)態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長春 130033)

選用水解的十八碳烯-馬來酸酐共聚物(PMAO)為表面修飾分子, 發(fā)展了一種以疏水納米粒子吸附表面活性劑十二烷基磺酸鈉(NaYF4-SDS)為中間體的均一液相聚合物包覆納米粒子方法. 該方法解決了油溶性納米晶與弱極性聚合物分子難以在單一體系下均勻分散的問題, 實(shí)現(xiàn)了在均一液相體系下對疏水納米晶的單分散包覆以及表面羧酸官能團(tuán)修飾. 紅外光譜與表面Zeta電位測試結(jié)果表明納米晶已被聚合物包覆, 粒子表面為強(qiáng)電負(fù)性的羧酸基團(tuán). 電鏡結(jié)果表明聚合物包覆的上轉(zhuǎn)換納米晶粒徑無明顯的變化, 具有良好的單分散性. 發(fā)射光譜表明聚合物包覆前后粒子的發(fā)射譜帶無顯著變化, 保持了原油相粒子的發(fā)光性能. 進(jìn)一步的特異性識別熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)聚合物包覆后的粒子(NaYF4-PMAO)可用于生物學(xué)檢測.

納米粒子; 上轉(zhuǎn)換發(fā)光; 聚合物表面包覆; 生物應(yīng)用

近年來, 以NaYF4∶Yb3+, Er3+等為代表的上轉(zhuǎn)換發(fā)光(980 nm激發(fā))納米粒子作為一類新的熒光探針在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用引起了人們廣泛的興趣[1～7], 其獨(dú)特優(yōu)勢在于近紅外光源激發(fā)下低的生物背景熒光能夠極大地提高光學(xué)檢測的靈敏度[8,9]. 相對于水相體系合成, 高溫有機(jī)相體系合成的納米晶展現(xiàn)出結(jié)晶性高、 粒徑均一、 發(fā)光強(qiáng)等優(yōu)良性能[10～12]. 然而, 高溫有機(jī)相體系合成的納米晶表面為油酸、 油胺等疏水有機(jī)配體, 不具有水溶性, 且不含有可用于偶聯(lián)生物分子的官能團(tuán), 限制了其在生物醫(yī)學(xué)檢測中的實(shí)際應(yīng)用.

對高溫有機(jī)體系合成的高性能納米晶進(jìn)行表面功能化修飾是獲得適合生物應(yīng)用發(fā)光納米探針的必要途徑. 目前對油溶性納米晶進(jìn)行表面修飾的主要方法可概括為兩類: 一類是利用雙官能團(tuán)分子替代粒子表面疏水配體的配體交換法修飾; 另一類是選用雙親性聚合物或SiO2等直接對疏水納米晶進(jìn)行表面包覆[1,8,13～23]. 表面配體交換的優(yōu)點(diǎn)在于取代劑一般為小分子, 實(shí)驗(yàn)過程簡單, 但配體交換過程需經(jīng)歷原有配體的解離與新配體的再配位過程, 難免會(huì)對納米晶的性能造成影響[19,20]. 與配體交換法相比, 表面包覆法具有明顯的優(yōu)點(diǎn): 首先, 修飾過程直接在疏水粒子外附加包覆層, 不改變納米粒子的原表面狀態(tài), 從而降低了對功能性質(zhì)的影響; 其次, 包覆層的存在使粒子具有更高的水溶穩(wěn)定性[13,15,16]. 然而, 表面包覆法也存在一些明顯不足, 如SiO2包覆納米粒子的操作過于復(fù)雜且包覆層厚度難于控制, 聚合物的長碳鏈容易造成納米粒子的團(tuán)聚等[15,17]. 因此, 選擇適合的表面包覆劑, 并發(fā)展有效的表面包覆技術(shù)仍然是發(fā)光納米晶應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)檢測需解決的重要問題.

本文選用水解處理的十八碳烯-馬來酸酐共聚物(PMAO)為包覆劑, 發(fā)展了一種借助疏水納米晶與表面活性劑吸附中間體(NaYF4-SDS)過程的表面包覆技術(shù), 克服了雙親性聚合物與疏水納米粒子的界面問題, 在均一液相體系下實(shí)現(xiàn)了對納米粒子的有效包覆. 獲得的粒子為水溶性并具有豐富的表面羧酸官能團(tuán). 修飾后的粒子表現(xiàn)出良好的單分散性, 包覆前后納米晶的發(fā)光性能無明顯變化. 進(jìn)一步的特異性識別熒光顯微成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)該粒子適合用于生物學(xué)檢測.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Y2O3(純度99.99%)、 Yb2O3(純度99.99%)和Er2O3(純度99.99%)購于北京稀土創(chuàng)新技術(shù)有限公司; 油酸(OA)、 NH4F(98%)、 N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo-NHS)、 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、 牛血清白蛋白(BSA)和十二烷基磺酸鈉(SDS)等購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 馬來酸酐與十八碳烯的交替共聚物(PMAO, Mn=30000～50000)購于Aldrich公司; 十八碳烯(純度90%)購于Alfa aesar公司; 實(shí)驗(yàn)用水為自制去離子水.

8100IV型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司), 加速電壓200 kV; F4500熒光光譜儀(日本Hitachi公司), 激發(fā)光源為外接的980 nm激光器(功率1 mW); Colloidal Dynamics Zeta電位分析儀(美國Colloidal Dynamics公司); Motic AE30 倒置生物顯微鏡以外接980 nm激光器為激發(fā)光源.

1.2 NaYF4∶Yb3+,Er3+納米晶的制備

NaYF4∶Yb3+, Er3+發(fā)光納米晶的制備參照文獻(xiàn)[24]方法. 將鹽酸與稀土氧化物反應(yīng)獲得的YCl3(0.78 mmol), YbCl3(0.2 mmol), ErCl3(0.02 mmol)按計(jì)量比放入50 mL三頸瓶中, 向體系中加入12 mL十八碳烯和9 mL油酸, 加熱至160 ℃使稀土鹽充分溶解, 冷卻至室溫. 將溶有氟源(4 mmol NH4F)和鈉源(2.5 mmol NaOH)的甲醇溶液加入反應(yīng)器中, 緩慢攪拌使之充分混合. 然后, 在氬氣流保護(hù)下緩慢加熱蒸出低沸點(diǎn)的甲醇溶劑, 升溫至330 ℃回流反應(yīng)1 h后停止反應(yīng), 冷卻至常溫, 離心收集樣品, 用乙醇-水混合液和乙醇-氯仿混合液分別清洗2次, 獲得的納米晶分散于環(huán)己烷中備用.

1.3 NaYF4-PMAO納米晶的制備

聚合物PMAO的酸酐水解處理: 稱取40 mg聚合物溶解于20 mL丙酮中, 加入2～4 mL水, 于65 ℃緩慢攪拌回流12 h, 使聚合物中的酸酐水解為羧基. 高速離心收集產(chǎn)物, 移除體系中的丙酮和水, 水解聚合物分散于乙醇中備用.

將1 mL含有5 mg NaYF4∶Yb3+, Er3+納米晶的環(huán)己烷溶液與10 mL溶解了20 mg SDS的水溶液混合, 在200 r/min轉(zhuǎn)速下磁力攪拌乳化30 min, 之后在攪拌下緩慢加熱到70 ℃蒸發(fā)掉體系內(nèi)的環(huán)己烷, 高速離心沉化, 將獲得的納米粒子與表面活性劑吸附中間體NaYF4-SDS分散于2 mL無水乙醇中. 然后緩慢滴加到10 mL含有20 mg水解的PMAO的乙醇體系中, 高速攪拌超過12 h, 離心收集樣品, 用乙醇清洗3次移除過量的游離聚合物, 最后將NaYF4-PMAO樣品分散在去離子水中用于進(jìn)一步分析.

1.4 NaYF4-PMAO納米粒子的親核素修飾

取約2.0 mg NaYF4-PMAO分散于1.0 mL MES(0.02 mol/L)緩沖溶液(pH=6.0)中, 加入5 mg EDAC 與 15 mg sulfo-NHS, 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4 h后離心純化, 再分散于MES中, 加入1 mg 親核素, 在4 ℃ 下攪拌反應(yīng)48 h. 最后, 將親核素化的NaYF4-PMAO粒子離心純化后分散于5 mmol/L 的硼酸鹽緩沖液(pH=8.5)中備用.

取2片表面醛基化的硅片與0.1 mg/mL的人血清蛋白在37 ℃下反應(yīng)2 h, 使人血清蛋白固定于硅片表面, 清洗3次后加入2%的 BSA溶液, 反應(yīng)1 h用于表面封閉. 之后, 將2個(gè)硅片分別放入0.1 mg/mL羊抗人蛋白(對照細(xì))與生物素化的羊抗人蛋白溶液中, 在37 ℃下反應(yīng)2 h, 清洗備用. 獲得的兩組硅片分別與親核素功能化的NaYF4-PMAO納米粒子進(jìn)行特異性識別反應(yīng), 用于熒光顯微檢測. 檢測系統(tǒng)為Motic AE30 倒置熒光顯微鏡, 外加980 nm激光器為激發(fā)光源.

2 結(jié)果與討論

2.1 PMAO聚合物均一液相體系包覆NaYF4∶Yb3+,Er3+上轉(zhuǎn)換納米晶

PMAO同時(shí)含有親水性基團(tuán)與親油性碳鏈, 是常見的油水雙親性聚合物. 聚合物本身含有豐富的酸酐, 經(jīng)水解反應(yīng)為羧酸化PMAO后極性明顯增強(qiáng), 可溶解于弱極性溶劑無水乙醇中. 高溫有機(jī)相合成得到的NaYF4∶Yb3+,Er3+上轉(zhuǎn)換納米晶由于表面存在疏水配體, 僅能分散于氯仿和環(huán)己烷等溶劑中. 羧酸化PMAO分子與NaYF4∶Yb3+,Er3+納米晶表面的極性差異導(dǎo)致兩者難以在同一溶劑中形成均一反應(yīng)體系, 從而無法有效接觸實(shí)現(xiàn)聚合物對納米晶的有效包覆. 因此, 我們設(shè)計(jì)了借助疏水納米晶與表面活性劑吸附中間體NaYF4-SDS來完成聚合物對納米晶的包覆. 利用SDS分子親、 疏水基團(tuán)在納米晶表面的取向吸附作用, 經(jīng)過水包油微乳液過程, 在納米晶表面吸附一層SDS分子(NaYF4-SDS, 見Scheme 1), 表面磺酸基團(tuán)使得納米晶能夠短時(shí)間內(nèi)在乙醇溶劑中保持分散. 當(dāng)將NaYF4-SDS加入到PMAO的乙醇溶液中時(shí), 在高速攪拌下不穩(wěn)定的NaYF4-SDS吸附結(jié)構(gòu)被打開, SDS從納米晶表面脫落, 長碳鏈的PMAO分子逐漸纏繞包覆于納米晶表面, 實(shí)現(xiàn)了在均一乙醇溶劑體系中聚合物對疏水納米晶的表面包覆(NaYF4-PMAO), 具體過程見Scheme 1.

Fig.1 TEM images of NaYF4∶Yb3+, Er3+ nanocrystals before(A) and after(B) surface coating process

Fig.2 Hydrodynamic diameter distribution of the polymer coated NaYF4∶Yb3+, Er3+ in water

圖1為聚合物包覆前后NaYF4∶Yb3+, Er3+納米晶的TEM照片. 可見, 表面包覆前油酸穩(wěn)定的納米晶平均尺寸為(12±1.99) nm[圖1(A)], 具有良好的分散性. 包覆后水溶性納米晶的形貌與尺寸未發(fā)生明顯的變化, 尺寸為(12±1.76) nm[圖1(B)]. NaYF4-PMAO納米粒子表面含有豐富的羧酸基團(tuán), 能夠穩(wěn)定分散于去離子水中. 在生物學(xué)中常用的磷酸鹽(PBS, pH=7.4)、 硼酸鹽(50 mmol/L, pH=8.3)和MES(20 mmol/L, pH=6.1) 等緩沖溶液中也可以保持穩(wěn)定分散, 未發(fā)生可見的聚集與沉淀. 通過激光粒度分析(DLS)測試了NaYF4-PMAO粒子在水溶液中的伸展尺寸, 結(jié)果如圖2所示.

2.2 NaYF4-PMAO納米粒子的表面分子分析

Fig.3 FTIR spectra of NaYF4-SDS(A) and NaYF4-PMAO(B)

采用本文方法制備的NaYF4-PMAO納米粒子表面含有大量的羧酸基團(tuán), 這些羧基不僅使NaYF4-PMAO納米粒子具有良好的水溶性, 同時(shí)也可以作為反應(yīng)基團(tuán)為后續(xù)的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用偶聯(lián)功能分子. 為了進(jìn)一步確定粒子的表面性質(zhì), 對NaYF4-PMAO進(jìn)行了表面Zeta電位測試, 結(jié)果表明粒子表面電位為-38.3 mV(圖4). 強(qiáng)的電負(fù)性進(jìn)一步證實(shí)NaYF4∶Yb3+, Er納米粒子的表面被PMAO分子所包覆.

Fig.4 Zeta potential at the surface of NaYF4-PMAO nanoparticles

Fig.5 Luminescence spectra of NaYF4∶Yb3+, Er3+ nanoparticles in cyclohexane(a) and NaYF4-PMAO nanoparticles in water(b)λex=980 nm.

2.3 聚合物修飾前后的光譜性質(zhì)

圖5為NaYF4∶Yb3+, Er3+粒子包覆前后的上轉(zhuǎn)換發(fā)射光譜. 發(fā)射譜中位于521, 540和654 nm的發(fā)射峰分別歸屬于Er3+離子2H11/2,4S3/2和4F9/2能級到4I15/2能級的躍遷. 經(jīng)過表面聚合物包覆后, 納米粒子的發(fā)光性質(zhì)受到了較小的影響, 譜帶中2個(gè)主發(fā)光峰的相對強(qiáng)度比(I540/I654)由油溶納米晶的5.65降低為4.79. 這種譜帶相對強(qiáng)度的變化歸因于納米粒子表面分子與分散環(huán)境的改變. 表面分子基團(tuán)的變化會(huì)造成不同的非輻射躍遷[25,26], 同時(shí), 聚合物親水表面的吸附水也會(huì)對發(fā)射譜帶產(chǎn)生一定的影響[27,28].

2.4 NaYF4-PMAO納米粒子檢測蛋白的熒光顯微成像

對親核素功能化的NaYF4-PMAO納米粒子的特異性識別能力進(jìn)行了研究. 圖6(A)中的熒光來自于NaYF4-PMAO納米粒子的上轉(zhuǎn)換發(fā)光, 表明親核素化的納米粒子已經(jīng)與在硅片表面固定的生物素化羊抗人血清蛋白特異性結(jié)合; 而在未進(jìn)行生物素處理的硅片上只觀測到很少的熒光[圖6(B)], 這些光點(diǎn)歸因于納米粒子與固定于硅片表面的蛋白少量的非特異性吸附. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備NaYF4-PMAO納米粒子適合用于生物學(xué)檢測.

Fig.6 Fluorescence image of avidin-coated NaYF4-PMAO and biotinylated IgG bioconjugates(A) and the result of control experiment(B)

3 結(jié) 論

本文以十八碳烯-馬來酸酐共聚物(PMAO)為表面包覆分子, 發(fā)展了一種以納米粒子吸附表面活性劑作為中間體的均一液相聚合物包覆納米粒子方法. 借助于表面活性劑兩端的親、 疏水特性, 使得疏水納米粒子能夠與油、 水雙親性聚合物分子均勻分散于乙醇溶劑中, 實(shí)現(xiàn)了雙親性聚合物對油溶性納米粒子的表面包覆修飾. 獲得的NaYF4-PMAO納米粒子展示了良好的水溶性與單分散性, 保持了較好的上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能. 通過熒光顯微成像技術(shù)對聚合物包覆的納米粒子進(jìn)行了特異性生物識別檢測研究, 表明獲得的NaYF4-PMAO納米粒子適合用于生物學(xué)檢測.

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(Ed.: F, K, M)

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21305126) and the Natural Science Foundation of Zhejiang University of Technology, China(No.2102X2003).

Surface Coating of Hydrophobic Up-converting Nanoparticles in Homogenous Liquid Phase System and Application in Optical Detection?

ZHANG Qingbin1*, KONG Xianggui2, CHENG Cheng1

(1. Department of Applied Physics, College of Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310023, China 2. Key Laboratory of Excited State Process, Changchun Institute of Optics, Fine Mechanics and Physics Chinese Academy of Sciences, Changchun 130033, China)

NaYF4∶Yb3+,Er3+nanoparticles were successfully surface-coated via a hydrophobic nanoparticles adsorption surfactant intermediate(NaYF4-SDS)process with hydrolysed poly(maleic anhydride-alt-1-octadecene) molecules(PMAO). This method overcomes the defect that oil-soluble nanocrystals and weak polar polymer molecules could hardly well-disperse in a single system and the surface-coating was realized in homo-genous solution system. The surface-coating process was confirmed by Fourier transform infrared spectra(FTIR) and surface Zeta potential. Investigations by transmission electron microscopy(TEM) and photoluminescence(PL) spectroscopy showed no obvious variations in the morphologies and luminescent properties of the nanoparticles during the surface-coating process. The specific molecular recognition capacity of PMAO-coated nanoparticles confirms that hydrophilic NaYF4-PMAO are suitable for potential biological labeling.

Nanoparticles; Up-conversion luminescence; Polymers surface coating; Biological application

10.7503/cjcu20150944

2015-12-10.

日期: 2016-02-03.

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 21305126)和浙江工業(yè)大學(xué)自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 2012XZ003)資助.

O614

A

聯(lián)系人簡介: 張慶彬, 男, 博士, 副教授, 主要從事納米光電材料制備與光學(xué)檢測研究. E-mail: qbzhang@zjut.edu.cn