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南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內科1 (210002) 南方醫(yī)科大學南京臨床學院2
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糖分子探針與炎癥因子、Claudin-8在結腸炎大鼠腸黏膜通透性改變中的相關性*
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南京軍區(qū)南京總醫(yī)院消化內科1(210002) 南方醫(yī)科大學南京臨床學院2
背景:腸黏膜通透性改變是潰瘍性結腸炎發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。糖分子探針是檢測通透性的一種安全無創(chuàng)的方法,其與炎癥因子、claudin-8在黏膜通透性改變中的相關性尚不明確。目的:探討糖分子探針與TNF-α、CRP和claudin-8在結腸炎大鼠腸黏膜通透性改變中的相關性。方法: 24只大鼠隨機分為模型組和正常對照組,以DSS溶液制備結腸炎模型。ELISA法檢測TNF-α、CRP表達,免疫組化法檢測claudin-8表達,高效液相色譜儀檢測糖分子探針含量,分析炎癥因子、claudin-8與糖分子探針的相關性。結果:與正常對照組相比,模型組結腸組織TNF-α、CRP表達顯著升高(P<0.01);claudin-8表達顯著降低(P<0.01);乳果糖和三氯蔗糖排出量以及乳果糖/甘露醇比值明顯升高(P<0.01),甘露醇排出量明顯降低(P<0.01)。乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達呈正相關(P<0.01),與claudin-8表達呈負相關(P<0.01);而乳果糖/甘露醇比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達呈負相關(P<0.01),與claudin-8表達呈正相關(P<0.01)。結論:糖分子探針與TNF-α、CRP以及claudin-8表達在提示大鼠腸黏膜通透性改變上的結果一致。糖分子探針可作為一種反映腸黏膜通透性改變的潛在檢測方法。
通透性; 分子探針; 腫瘤壞死因子α; C反應蛋白質; claudin-8; 結腸炎, 潰瘍性
Colitis, Ulcerative
潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種腸道慢性炎癥性疾病,腸黏膜屏障功能損傷是UC發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。TNF-α在UC患者結腸組織和巨噬細胞表面均有表達,血清TNF-α水平與反映疾病活動度的臨床和實驗指標密切相關。CRP在炎癥性腸病與腸道功能性疾病的鑒別診斷中起重要作用,UC患者血清CRP含量明顯升高,與疾病嚴重程度相關,可作為檢測UC病情進展的重要參數(shù)。Claudin是一種四次跨膜的結構蛋白,是細胞間隙通透性的重要調節(jié)因子。UC活動期結腸上皮細胞claudin-8亞型與上皮細胞間隙通透性有密切的關系。糖分子探針通過口服一定劑量的糖,檢測糖在代謝過程中的消耗量來評估胃腸道吸收情況,從而間接反映胃腸黏膜受損情況,特定糖的吸收部位有所不同,故可根據(jù)糖的種類確定受損部位。目前糖分子探針與炎癥因子、claudin-8在黏膜通透性改變中的相關性尚不明確。本實驗采用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測大鼠尿液中糖分子探針含量,旨在對其與炎癥因子、claudin-8在UC腸黏膜通透性中的相關性作一分析。
一、實驗動物和主要試劑
健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只,3月齡,體質量(200±20) g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科提供。大鼠飼養(yǎng)于標準實驗鼠籠中,適應性喂養(yǎng)1周。
二、研究方法
1. 模型制備:SD大鼠隨機分成正常對照組和模型組,每組各12只,正常對照組大鼠自由飲水進食,模型組大鼠自由飲用DSS溶液7 d,建立結腸炎模型。每日測定大鼠體質量,糞便隱血試驗陽性甚至出現(xiàn)肉眼血便,表示造模成功。
2. 取材和標本處理:造模成功后,采取灌胃法分別口服2 mL 0.06 g/mL乳果糖、0.04 g/mL甘露醇、0.03 g/mL三氯蔗糖。10%的麝香草酚加入異丙醇配制成100 mL溶液,以阻止細菌降解尿糖。大鼠禁水3 h。收集24 h尿液。麻醉后處死大鼠,取結腸遠端長約0.5 cm的組織,置于4%甲醛溶液中固定,用于HE染色和免疫組化染色。其余結腸組織-20 ℃保存,用于檢測TNF-α和CRP水平。
3. ELISA法檢測結腸組織TNF-α、CRP水平:將結腸組織配制成勻漿液后離心,經(jīng)稀釋、加樣、洗滌、孵育后測定波長為450 nm處的A值。BCA法定量,用上清液蛋白含量對樣品中炎癥因子含量進行再校正。
4. 免疫組化法檢測claudin-8表達:取各組大鼠結腸組織切片,按試劑盒說明書行免疫組化二步法(一抗和二抗的工作濃度分別為 1∶100 和 1∶10)。
結果判斷:細胞膜和細胞間隙呈棕黃色為claudin-8陽性表達。用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行圖像分析,隨機計數(shù)4個視野,高倍鏡下計數(shù)陽性細胞,參照王娟等[1]的研究方法,半定量計算claudin-8陽性表達。
5. HPLC法:尿樣、標準樣置于氮氣環(huán)境中,75 ℃溫箱干燥。冷卻后每管加100 μL肟化液,75 ℃溫箱放置30 min。冷卻后每管加100 μL N-3甲基硅烷咪唑,75 ℃溫箱放置15 min,冷卻。采用HPLC檢測尿液中乳果糖、甘露醇、三氯蔗糖含量,計算乳果糖/甘露醇(L/M)比值,具體步驟按說明書操作。
三、統(tǒng)計學分析
其中,HU(Hounsfield Unit)為三維空間中每個單元對于二維圖像的CT值,ρash為灰度密度值,E為相應位置單元材料的彈性模量,單位為MPa。通過Mimics材料賦值模塊,完成骨骼網(wǎng)格模型的非均勻單元賦值。
一、HE染色
正常對照組黏膜上皮完整,細胞形態(tài)正常,杯狀細胞可見,腺體排列整齊,黏膜下層、肌層、漿膜層結構清晰。模型組黏膜上皮壞死脫落,上皮內杯狀細胞減少,隱窩破壞;炎癥滲出,典型潰瘍形成,大量炎性細胞浸潤,以中性粒細胞為主,可見出血性壞死(圖1)。表明成功制備結腸炎模型。
A:正常對照組;B:模型組
二、炎癥因子水平
與正常對照組相比,模型組結腸組織TNF-α[(8.51±1.55) pg/mg對(2.21±0.38) pg/mg,P<0.01]、CRP[(161.80±35.60) ng/mg對(50.50±5.90) ng/mg,P<0.01]表達均顯著升高。
三、免疫組化染色
模型組claudin-8陽性表達主要定位于上皮細胞和血管內皮細胞的細胞膜和細胞間隙,正常對照組claudin-8表達較低,可見上皮細胞和血管內皮細胞少量表達(圖2);模型組claudin-8表達較正常對照組顯著降低(0.100±0.007對0.200±0.011,P<0.01)。
A:正常對照組;B:模型組
四、分子探針含量
與正常對照組相比,模型組乳果糖排出量、三氯蔗糖排出量明顯升高(P<0.01),L/M比值明顯升高(17.55±5.02對0.80±0.69,P<0.01),甘露醇排出量顯著降低(P<0.01)(圖3)。
五、相關性分析
乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達呈正相關(P<0.01),與claudin-8表達呈負相關(P<0.01);L/M 比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達呈負相關(P<0.01),與claudin-8表達呈正相關(P<0.01)。
圖3 兩組大鼠糖分子探針排出量比較(HPLC法)
目前研究認為UC的發(fā)病機制可能與環(huán)境、遺傳、免疫等因素共同作用所致的腸黏膜屏障功能損傷有關[2]。腸黏膜通透性改變可能是發(fā)病的基礎。
腸黏膜局部炎癥反應是UC發(fā)生、發(fā)展的主要病理機制,與一系列細胞因子的級聯(lián)瀑布效應有關。TNF-α是一種前炎癥因子,主要由巨噬細胞、單核細胞和分化的T細胞分泌,可刺激免疫細胞分泌IL-1β和IL-6,上調黏附分子和促凝血因子的表達,引發(fā)細胞毒性急性反應[3]。Olsen等[4]發(fā)現(xiàn),組織TNF-α水平與局部炎癥反應的分級呈正相關。有研究[5]發(fā)現(xiàn)claudin-8在結腸炎模型大鼠結腸組織中的表達降低,導致緊密連接中斷,提示claudin-8可能與UC的發(fā)生、發(fā)展有一定關聯(lián)。有研究認為,UC患者的CRP與臨床表現(xiàn)、內鏡下表現(xiàn)以及組織學表現(xiàn)有較好的相關性[6-7];CRP亦可提示UC患者內鏡下腸道表現(xiàn)[8]。
糖分子探針可對尿液中的糖進行檢測,無需取血,是目前公認的檢測胃腸黏膜損傷的無創(chuàng)性方法[9]。目前有三類糖分子探針:第一類糖探針在離開胃時就已完全被破壞,如蔗糖,用于檢測上胃腸道黏膜通透性;第二類糖探針在離開小腸時就已完全被破壞,如乳果糖、甘露醇,用于檢測小腸黏膜通透性;第三類糖探針全程均不降解,如三氯蔗糖,用于檢測全消化道黏膜通透性[10]。乳果糖和甘露醇在腸道內的吸收途徑不同[11],乳果糖分子質量為342 kDa (1 Da=0.992 1 u),通過小腸黏膜上皮細胞間的靜脈連接吸收;甘露醇分子質量為182 kDa,通過小腸上皮細胞膜的水溶性微孔吸收。進入血液循環(huán)后兩者均不易代謝,最終從尿液中排出,因此可通過定量尿液中兩者的含量,反應其吸收量。尿液中L/M比值升高,表明上皮細胞間的結構發(fā)生改變,如腸黏膜緊密連接破壞,區(qū)域性腸上皮細胞缺失或絨毛末梢損傷,并因此造成黏膜通透性增加,組織間隙水腫。故測定尿液中L/M比值可較為準確地反映腸黏膜通透性的改變[12]。
結合多種檢測方法可較為準確地反映腸黏膜的改變。目前臨床上主要通過結腸鏡觀察黏膜的潰瘍性改變,并通過取活檢觀察黏膜超微結構的改變來了解腸道損傷情況,有時還需進一步采取免疫組化檢測炎癥因子來了解腸黏膜損傷情況,但這些檢測耗時且費用不低。而糖分子探針是一種更為簡單易行、創(chuàng)傷小、費用低、安全可靠的檢測方法。本研究首先成功構建了結腸炎大鼠模型,再分別利用結腸組織TNF-α、CRP、claudin-8表達以及糖分子探針檢測大鼠腸道通透性的改變。結果顯示模型組大鼠表現(xiàn)為典型的結腸炎改變,黏膜上皮壞死脫落,炎癥滲出,典型潰瘍形成,大量炎性細胞浸潤,可見出血性壞死。L/M比值和三氯蔗糖排出量明顯改變,提示結腸炎時腸黏膜通透性發(fā)生改變。且模型組TNF-α、CRP表達均明顯高于正常對照組,說明結腸炎時腸道發(fā)生炎癥性改變,與文獻報道一致[4-5,13];緊密連接蛋白claudin-8表達明顯降低,提示腸黏膜通透性發(fā)生改變。上述結果與糖分子探針一致,共同反映了腸黏膜的炎癥損害。相關性分析顯示乳果糖、三氯蔗糖排出量與TNF-α、CRP表達呈正相關,與claudin-8表達呈負相關;而L/M比值、甘露醇排出量與TNF-α、CRP表達呈負相關,與claudin-8表達呈正相關。
綜上所述,糖分子探針與TNF-α、CRP、claudin-8表達在提示大鼠腸黏膜通透性改變上具有一致性。有望作為臨床上檢測腸黏膜通透性的無創(chuàng)方法,具有較好的臨床使用前景。
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(2016-03-08收稿;2016-04-03修回)
Correlation of Sugar Molecular Probes with Inflammatory Factors and Claudin-8 in Intestinal Permeability in Colitis Rats
SHIHui1,2,WANGZhenkai1,WANGShaodong1,LUYouke1,WANGFangyu1.
1DepartmentofGastroenterologyandHepatology,JinlingHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Nanjing(210002);2SouthernMedicalUniversity,SchoolofMedicine,Guangzhou
WANG Fangyu, Email: wangfy65@nju.edu.cn
Permeability; Molecular Probes; Tumor Necrosis Factor-alpha; C-Reactive Protein; Claudin-8;
10.3969/j.issn.1008-7125.2016.10.006
南京軍區(qū)南京總醫(yī)院青年課題基金(批準號:2008021)、中國博士后科學基金面上資助(201150M1575)、中國博士后科學基金特別資助(2012T50895)
#Email: 32767572@qq.com
▲本文通信作者, Email: wangfy65@nju.edu.cn
Background: Intestinal permeability plays an important role in the development of ulcerative colitis. Sugar molecular probes is a safe and non-invasive method to measure intestinal permeability, and its correlation with inflammatory factors and claudin-8 is not clear. Aims: To explore the correlation of sugar molecular probes with TNF-α, CRP and claudin-8 in intestinal permeability in colitis rats. Methods: Twenty-four rats were assigned randomly to model group and normal control group. Colitis model was induced by DSS solution. Expressions of TNF-α, CRP were determined by ELISA, and expression of claudin-8 was determined by immunohistochemistry. Sugar molecular probes were determined by high performance liquid chromatography. Correlations of inflammatory factors and claudin-8 with sugar molecular probes were analyzed. Results: Compared with normal control group, expressions of colonic tissue TNF-α and CRP were significantly increased while expression of claudin-8 was significantly decreased in model group (P<0.01); secretion of lactulose and sucrolose, ratio of lactulose/mannitol (L/M) were significantly increased (P<0.01) while mannitol secretion was significantly decreased (P<0.01). Secretion of lactulose and sucrolose were positively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but negatively with expression of claudin-8 (P<0.01). L/M ratio and mannitol secretion were negatively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but positively with expression of claudin-8 (P<0.01). Conclusions: Sugar molecular probes and expressions of TNF-α, CRP, claudin-8 have similar results in predicting intestinal permeability in rats. Sugar molecular probes can be used as a potential method to measure intestinal permeability.