楊少華，許傳田，黃艷艷，張 琳，黃慶華，張秀美

（山東省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100）

·研究論文·

鷺源新城疫病毒的生物學與遺傳學特性研究

楊少華，許傳田，黃艷艷，張 琳，黃慶華，張秀美

（山東省農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所 山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100）

對2013年從健康野生鷺科候鳥中分離的新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）蝕斑純化后，選擇5株病毒進行了生物學鑒定和遺傳進化分析。致病指數(shù)和腦內接種指數(shù)測定結果顯示5個分離株均為弱毒株；F蛋白裂解位點處氨基酸序列均為112ERQERL117，具有典型的弱毒株特征。交叉HI試驗結果發(fā)現(xiàn)ClassⅠ分離株與LaSota的HI抗原同源性為0.56～0.57，與ClassⅡ強毒株的HI抗原同源性為0.44～0.51；遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)5個NDV毒株與目前流行的強毒株遺傳關系較遠，均屬于ClassⅠ3c亞型，表明健康鷺攜帶I類新城疫病毒，在遷飛的過程可能傳播給家養(yǎng)水禽，對其構成潛在威脅，提示加強野鳥NDV 的監(jiān)控及流行病學研究具有緊迫性和重要性。

新城疫病毒；健康鷺；生物學特性

新城疫是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒性傳染病之一，給許多國家的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。其病原是新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV），又稱為禽副粘病毒I型（Avian paramyxovirus serotype 1，APMV-1），屬于單鏈負股RNA病毒目（Mononegavirales）、副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）的禽腮腺炎病毒屬[1,2]。NDV為單股負鏈、不分節(jié)段RNA病毒，基因組長度約為15．2 kb，基因排列方式為 3′-NP-P-M-FHN-L-5′，分別編碼6種主要結構蛋白[3]。NDV只有一個血清型，但基因型較多[4-7]。

NDV宿主非常廣泛，可感染多種鳥類和野生水禽，而野生水禽是NDV的天然貯存宿主，一般感染后表現(xiàn)為帶毒和排毒，不會引起臨床疾病[7]。本研究對從野生鷺科候鳥分離的5株NDV進行了生物學和遺傳學特性鑒定，以期為ND的防控提供科學的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1 病毒與雞胚 5株野生鷺源NDV由吉林大學畜牧獸醫(yī)學院2013年從鄱陽湖鷺鳥泄殖腔棉拭子中分離；9～10日齡SPF雞胚購自山東省農業(yè)科學院家禽研究所SPF場。

1.2 主要試劑 Trizol 購自Invitrogen 公司；反轉錄酶（M-MLV）Taq酶、膠回收試劑盒及pMD18-T Vector 購自大連寶生物公司；DH5α感受態(tài)細胞購自北京全氏金公司。

1.3 病毒的純化 病毒接種于9～10日齡SPF雞胚，每個胚0．2 mL，37℃孵化箱孵化，每天照胚，收集雞胚的尿囊液，采用血凝（hemagglutination test, HA）和血凝抑制實驗（hemagglutination inhibition, HI）對病毒進行血清學鑒定。陽性病毒接種雞胚成纖維細胞（chicken embryo fibroblast, CEF），觀察細胞病變情況，并以HA實驗測定細胞培養(yǎng)液的病毒效價。挑選能在CEF上繁殖并產生病變的病毒，接種CEF并進行蝕斑純化，蝕斑純化3次后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病指數(shù)檢測 檢測分離病毒致雞胚平均死亡時間（mean death times, MDT）和腦內接種指數(shù)（intracerebral pathogenicity indexes, ICPI），實驗流程按照OIE 標準進行。

1.5 交叉血凝抑制試驗 按照常規(guī)方法分別制備分離株SD21/13、SD24/13和疫苗株LaSota及基因Ⅶ型強毒株Duck/China/SD03/2009（GenBank登錄號JN400895，簡寫為SD03）的單因子血清。將4種NDV病毒和陽性血清分別進行交叉HI實驗，HI抗原同源性的計算按免疫學方法進行：R＝（r1×r2）1/2×100%，r1＝異源血清效價1/同源血清效價1，r2＝異源血清效價2/同源血清效價2。

1.6 病毒F基因的擴增和克隆

1.6.1 病毒RNA的提取 取200 μL病毒的尿囊液，加入800 μL Trizol，按照TaKaRa公司Trizol試劑使用說明書步驟提取病毒全基因RNA，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 F基因的RT-PCR擴增與克隆測序 ND-F：5′-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3′，ND-R：5′-TCACATTTTTGTAGTGGCTC-3′，以上為所用引物序列。RT反應條件：42℃ 60 min，70℃ 15 min；PCR反應條件：95℃預變性2 min；94℃變性40 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.6.3 基因克隆 PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，按凝膠回收試劑盒步驟回收PCR產物。將純化后的產物按pMD18-T載體說明書進行連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，常規(guī)方法提取質粒，用PCR進行初步鑒定，陽性質粒的菌液送上海生物工程有限公司進行測序。

1.7 F基因序列比對與遺傳進化分析 應用分析軟件Lasergene和MAGA 4．1軟件對實驗毒株與GenBank中收錄的NDV代表毒株F基因序列進行比對分析，利用MAGA4．1軟件對F基因變異區(qū)（nt47～420）進行系統(tǒng)進化分析。

2　結果

2.1 病毒鑒定 經(jīng)血清學檢測及蝕斑純化，在鄱陽湖鷺鳥泄殖腔棉拭子中共鑒定5株NDV，這些毒株致死雞胚時間較長，胚體有輕度出血，接種CEF細胞后約60 h產生細胞病變。

2.2分離株致病力測定結果 鷺源NDV分離株經(jīng)雞胚傳代和蝕斑克隆純化后，按照OIE規(guī)定的方法進行MDT和ICPI的測定。結果5個NDV分離株MDT均大于116 h，ICPI為0～0．2（見表1），根據(jù)國際獸疫局（OIE）推薦的毒力判定標準，5個分離株均為弱毒株。

表1　本研究中NDV分離株的生物學及遺傳學特征Table 1 Biological and genetic characterization of isolated NDV strains from wild waterfowl

2.3 交叉血凝抑制試驗結果 分離株SD21/13，SD24/13與疫苗毒LaSota及基因Ⅶ型強毒的交叉HI結果顯示，SD21/13與SD24/13之間的HI同源性為93%，兩個ClassⅠ分離株與LaSota的同源性為56%～57%，與ClassⅡ強毒株的同源性為44%～51%（表2）。

表2　不同NDV毒株間的HI同源性（%）Table 2 Correlations rate of HI among different NDV strains（%）

2.4 病毒F基因序列與遺傳進化分析 利用MEGA4．1軟件對5個鷺源分離株和26個參考毒株的F基因47～420 bp可變區(qū)進行系統(tǒng)進化分析（圖1）。結果31個分離株被分為8個基因群，均屬于classⅠ分支，5個分離株與7株2010～2014年分離的參考株聚于一簇，屬于classⅠ目前主要流行的3c亞型，且具有典型的弱毒株F 蛋白裂解位點112ERQERL117。

3　討論

圖1　5株鷺源NDV毒株F基因可變區(qū)（47～420 bp）系統(tǒng)進化分析Fig.1 Phylogenetic relationships of the nucleotide sequence of 5 NDV strains isolated from ardeid wildbird based on a variable portion (47～420 bp) of the F gene

野鳥在新城疫的流行病學中充當了一定的角色，國外報道過多次野鳥爆發(fā)ND的病例：1992年美國野鳥發(fā)生ND，死亡水鳥多達2萬只；2002年荷蘭野鳥暴發(fā)ND，海鷗、野鴨和貓頭鷹均被感染[8]。調查發(fā)現(xiàn)，我國三江自然保護區(qū)、秦嶺地區(qū)、上海的野鳥血清樣品中均攜帶新城疫抗體[8-10]，表明NDV在野鳥中廣泛存在，但目前對野鳥中NDV的分離報道較少。本研究中鷺源NDV均分離于江西省都昌鄱陽湖區(qū)，該地區(qū)處于“東亞－澳大利亞”候鳥遷飛線路之中，每年立春后大批鷺鳥從東南亞等地遷徙至此度夏。5株鷺源NDV毒株與2010～2014年分離的CK/JS/02/10、Go/JS/01/11和SD10/14等毒株聚于一簇，屬于3c亞型，目前從健康野鳥和家禽中分到的classⅠ毒株的基因型以3c亞型為主[11,12]。

classⅠ弱毒株與LaSota疫苗株的遺傳距離較遠，對野鳥無致病性。盡管classⅠ弱毒株無致病性，甚至還能提高禽群對新城疫的免疫保護[13,14]，但這些弱毒株在健康野鳥中長期存在，相互影響，相互作用，存在基因重組和毒力返強的可能[15]，并產生新的毒株和新的基因型，對家禽構成潛在的威脅。目前對野鳥NDV的流行病學調查較少，今后有必要針對野鳥NDV特別是弱毒株開展長期的流行病學監(jiān)測，研究其毒力演化，以期對NDV的爆發(fā)和流行提前預警，減少經(jīng)濟損失。

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BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND GENETIC ANALYSIS OF NEWCASTLE DISEASE VIRUSES ISOLATED FROM ARDEID WILDBIRDS

YANG Shao-hua, XU Chuan-tian, HUANG Yan-yan, ZHANG Lin, HUANG Qing-hua, ZHANG Xiu-mei
(Shandong Key Lab of Animal Disease Control and Breeding, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Science, Jinan 250100, China)

In order to understand the biological characteristics and genetic evolution of fi ve class Ⅰ Newcastle disease viruses (NDV) isolated from ardeid wildbirds, these viruses were inoculated into one-day-old chicks. Results indicated that these five NDV isolates were all lentogenic according to the mean death time (MDT) and intracerebral pathogenicity index (ICPI). Cross HI test showed that HI homology was 0.56～0.57 between these isolates and LaSota and 0.44～0.51 between these isolates and Class Ⅱ isolates. Phylogenetic analysis of these isolates based on 47-470 bp of F genes revealed that all isolates were clustered into Class I group 3c clade. Class I NDV carried by healthy wild water fowls might have spread to domestic waterfowls through migration, posing a potential threat to domestic poultry. The results from the present study suggested the urgency and importance of strengthening the epidemiological studies of NDV in wild birds.

Newcastle disease virus; healthy wild water fowl; biological feature

S852.659.5

A

1674-6422（2016）05-0021-04

2016-03-01

公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201003012，201303033）；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-42-Z12）

楊少華，女，碩士，助理研究員，主要從事禽病綜合防控技術研究

張秀美，E-mail: zxm820410@163．com