鐘登科，魏建超，趙秋華，張克龍，李倫峰，石 坤，顧劍新，秦愛建

（1. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.上海市閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109）

·研究論文·

上海市犬流行性乙型腦炎血清流行病學(xué)調(diào)查與分析

鐘登科1,2，魏建超3，趙秋華4，張克龍3，李倫峰3，石 坤3，顧劍新1，秦愛建2

（1. 上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，上海 201600；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；4.上海市閔行區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201109）

為了解上海市犬流行性乙型腦炎（japanese encephalitis，JE）的感染狀況及其流行特點(diǎn)，本研究應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)對2013～2014年采自上海市的653份犬血清進(jìn)行了日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）抗體檢測，共檢出陽性血清195份，總陽性率為29.86%，并比較分析不同季節(jié)、城市區(qū)域、生存環(huán)境、年齡和性別的犬JEV抗體陽性率的差異。結(jié)果表明，犬JEV抗體陽性率與JE流行季節(jié)有相關(guān)性，在不同城市區(qū)域和生存環(huán)境中差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而不同性別和不同年齡犬JEV抗體陽性率差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。調(diào)查結(jié)果表明上海市犬JEV感染率較高，應(yīng)加強(qiáng)犬JEV的監(jiān)測與防控。

流行性乙型腦炎；血凝抑制試驗(yàn)；血清學(xué)調(diào)查；犬

流行性乙型腦炎又稱日本腦炎(japanese encephalitis，JE) ，是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染引起的一種嚴(yán)重的損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的人畜共患傳染病[1]。該病具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生于蚊蟲孳生的夏秋季節(jié)。JEV以三帶喙庫蚊為主要傳播媒介，可以通過叮咬將病毒傳染給人和動物?，F(xiàn)已報道自然界中有60多種動物可感染JEV，例如豬、馬、牛、山羊、綿羊、猴、野禽和嚙齒動物等。此外，國內(nèi)外一些研究結(jié)果表明犬也能感染JEV，且抗體陽性率較高[2]。

隨著我國社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和城市化進(jìn)程加快，近年來犬作為伴侶動物日益成為人們生活的一部分。上海市犬的數(shù)量逐年增大，與人類關(guān)系愈來愈密切，所以無論是從動物的健康出發(fā)還是出于對公共衛(wèi)生的考慮，了解本地區(qū)犬的JEV感染情況都勢在必行。因此，本研究采用血凝抑制試驗(yàn)對上海市犬流行性乙型腦炎病毒的感染情況進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，旨在掌握該地區(qū)犬的流行性乙型腦炎病毒感染情況和流行規(guī)律，為流行性乙型腦炎的研究和防控提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 犬血清樣品的收集 2013～2014年分別在上海市長寧區(qū)、徐匯區(qū)、閔行區(qū)、奉賢區(qū)和松江區(qū)的犬類免疫點(diǎn)、寵物醫(yī)院、飼養(yǎng)場以及流浪犬收容所隨機(jī)采集犬血液樣本653份，所有樣本均注明來源地、采樣時間、犬齡、性別及健康狀況等。血樣送回實(shí)驗(yàn)室后離心分離血清，置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 流行性乙型腦炎病毒血凝抑制試驗(yàn)（hemagglutination，HI）診斷試劑，購自中國疾病預(yù)防控制中心病毒所；犬流行性乙型腦炎病毒陽性血清由本研究室前期采用107PFU的JEV（SHJEV01）人工感染比格犬制備（HI 效價為1:160），其陰性血清采自感染前比格犬血液制備（HI 結(jié)果為陰性），其他試劑均自行配制。

1.3 方法 血凝抑制試驗(yàn)按文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行。用12．5%高嶺土溶液及鵝紅細(xì)胞吸附待檢血清，直至完全不凝集0．5%鴿紅細(xì)胞，HI試驗(yàn)采用4 個單位的血凝素。取清潔干燥96孔V型微量板，于1～6孔中加入pH9．0硼酸鹽緩沖液，每孔25μL，再加入 1∶10血清（25 μL）于第1孔，依次倍比稀釋至第6孔，第6孔棄掉25 μL，再于每孔中加入25 μL4個單位的血凝素抗原25 μL，充分混勻；第7孔加入1∶10血清（50 μL）作血清對照，第8孔加入50 μL pH 9．0硼酸鹽緩沖液作細(xì)胞對照。加蓋置室溫1 h，最后于每孔中加入50 μL的0．5%鵝紅細(xì)胞懸液，充分混勻，置室溫l h后判斷結(jié)果。結(jié)果判定：HI 效價大于1:20判為陽性，試驗(yàn)孔全部呈現(xiàn)+++和++++的紅細(xì)胞凝集為陰性結(jié)果，以++凝集孔作為該份血清的終點(diǎn)抑制效價。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 16．0軟件對各組陽性率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，計算χ2值，P＜0．05和P＜0．01表示為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 樣品來源與犬JEV抗體總陽性率 共采集犬血液樣本653份，其中393份采自上海市長寧區(qū)、徐匯區(qū)、閔行區(qū)、奉賢區(qū)和松江區(qū)的十余家犬類免疫點(diǎn)或?qū)櫸镝t(yī)院，另外分別有98份、162份來源于上海市某流浪犬收容所以及某飼養(yǎng)場。經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)檢測，檢出JEV抗體陽性樣品195份，總陽性率為29．86%。

2.2 犬JEV感染率與季節(jié)的關(guān)系 6～9月是上海市蚊子孳生期，亦是JE的流行期。對每個月犬的JEV抗體陽性數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，春季（3～5月）JEV抗體平均陽性率為17．04%，顯著低于流行季節(jié)后秋、冬季的JEV抗體平均陽性率（44．60%、36．53%）（P＜0．01)（表1），說明上海市犬的JEV感染具有一定的季節(jié)性。

2.3 犬JEV感染率與城市區(qū)域的關(guān)系 對上海市中心城區(qū)（長寧區(qū)、徐匯區(qū)）、近郊（閔行區(qū)）、遠(yuǎn)郊（松江區(qū)、 奉賢區(qū)）3個不同區(qū)域犬進(jìn)行分類和抗體檢測，中心城區(qū)和近郊的陽性率較低，分別為17．87%和23．44%。而以遠(yuǎn)郊陽性率較高，為47．79%（表2），且與中心城區(qū)和近郊的差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。

表1　上海市不同月份犬JEV抗體檢測結(jié)果Table 1 Seroprevalence of JEV antibodies in dogs in different months in Shanghai

表2　上海市不同區(qū)域犬JEV抗體檢測結(jié)果Table 2 Seroprevalence of Japanese encephalitis virus antibodies in dogs from different areas in Shanghai

2. 4 犬JEV感染率與生存環(huán)境的關(guān)系 根據(jù)犬生存環(huán)境的不同，將犬分為寵物犬、養(yǎng)殖場犬和流浪犬三類，分別統(tǒng)計犬JEV抗體檢測結(jié)果。結(jié)果顯示，流浪犬的JEV抗體陽性率最高，為48．98%，其次是養(yǎng)殖場犬，寵物犬JEV抗體陽性率顯著低于前兩者，僅為20．10%（表3）。

2.5 犬JEV感染率與年齡的關(guān)系 按照不同年齡段（＜1歲、1～2歲、2～3歲、大于3歲和年齡不詳共5組）對JEV抗體陽性率進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示：小于1歲的犬JEV抗體陽性率為25．33%；1～2歲齡的犬陽性率為29．59%；2～3歲齡的犬陽性率為34．23%；3歲以上的犬陽性率為36．72%?？梢姡琂EV抗體陽性率呈現(xiàn)隨年齡增長呈上升趨勢，但不同犬齡間差異不具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）（表4）。

表3　上海市不同環(huán)境中犬JEV抗體檢測結(jié)果Table 3 Seroprevalence of Japanese encephalitis virus antibodies in dogs from different environment in Shanghai

表4　上海市不同年齡犬JEV抗體檢測結(jié)果Table 4 Seroprevalence of Japanese encephalitis virus antibodies in dogs of different age in Shanghai

2.6犬JEV感染率與性別的關(guān)系 對不同性別（雄或雌）犬的JEV抗體陽性數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，雄性和雌性犬抗體陽性率分別為32．63%（109/334）、26．96%（86/319），兩者無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），提示不同性別的犬感染情況不存在明顯的差異性。

3　討論

犬是人類的最重要伴侶動物之一。近年來，犬的數(shù)量不斷增加，與人類關(guān)系愈來愈密切。本研究應(yīng)用血凝抑制試驗(yàn)檢測了采自上海市不同區(qū)域的653份犬血清樣品，檢出JEV抗體陽性樣品195份，總陽性率為29．86%，表明上海地區(qū)犬JEV感染率較高。犬與人生活在同一生活范圍，且沒有注射JEV疫苗，犬JEV抗體陽性率能反映人所處環(huán)境中蚊子攜帶JEV的情況。因此，犬可作為一種哨兵動物來評估人受到JEV感染的風(fēng)險性。

目前檢測JEV抗體的方法有很多，包括血凝抑制試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、中和試驗(yàn)和ELISA等[4]。其中血凝抑制試驗(yàn)具有簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，且不需要專門的儀器，受操作人員的主觀因素影響較小，更適合大量樣品的犬JEV抗體檢測評估。因此，本研究選定血凝抑制試驗(yàn)作為犬JE血清流行病學(xué)調(diào)查的檢測方法。同時，本研究采用鵝紅細(xì)胞泥吸附待檢血清，這樣既沒有改變待檢血清的體積，又有效地消除了血清中非特異性凝集。

上海屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，6～9月溫度較高（氣溫20℃～31℃），雨量充沛，空氣濕度較大，適宜蚊蟲媒介孳生，蚊媒密度高，容易傳播JEV[5]。本研究發(fā)現(xiàn)犬抗體陽性率與JE流行季節(jié)（6～9月）相關(guān)，抗體陽性率在流行季節(jié)后有明顯的升高，10月和11月抗體陽性率分別高達(dá)50．72%和46．30%，顯著高于JEV流行季節(jié)前JEV抗體陽性率（P＜0．01)，上海地區(qū)犬的JEV感染具有一定的季節(jié)性。

本研究調(diào)查結(jié)果顯示上海市遠(yuǎn)郊區(qū)域（松江區(qū)、奉賢區(qū)）犬JEV抗體陽性率為47．79%，顯著高于中心城區(qū)和近郊（17．87%、23．44%）（P＜0．05），且流浪犬和養(yǎng)殖場犬的JEV抗體陽性率分別為48．98%、 41．98%，顯著高于寵物犬（20．10%）（P＜0．05）。Shimoda等[6]研究結(jié)果也顯示，鄉(xiāng)村犬的JEV抗體陽性率（43%）顯著高于城市犬（21%），且室外犬（38%）和室內(nèi)犬（10%）的JEV中和抗體陽性率之間差異具備顯著統(tǒng)計學(xué)意義。這可能與犬的所在生存環(huán)境因素有關(guān)，如寵物犬絕大多數(shù)飼養(yǎng)在室內(nèi)，戶外活動相對較少，減少了被蚊媒叮咬的概率，而流浪犬長期在戶外逗留，流浪犬收留所和犬養(yǎng)殖場均在遠(yuǎn)郊區(qū)域，那里存在大量蚊媒孳生的稻田，蚊媒密度高，使得犬與蚊媒接觸頻率增大，增加了感染JEV的概率[7]。這可能是導(dǎo)致遠(yuǎn)郊區(qū)域JEV感染率和流浪犬、養(yǎng)殖場犬JEV抗體陽性率較高的主要原因，但也需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證。

本研究初步明確了上海市犬流行性乙型腦炎流行特征，有助于流行性乙型腦炎的科學(xué)合理的防控，并對于保障公共衛(wèi)生安全有重要意義。

[1] 杜立中, 魏建超, 馬志永． 流行性乙型腦炎流行病學(xué)新進(jìn)展及面臨的挑戰(zhàn)[J]． 畜牧與獸醫(yī), 2014, 46(10): 116-119．

[2] Shimoda H, Inthong N, Noguchi K, et al． Development and application of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay for serological survey of Japanese encephalitis virus infection in dogs[J]． J Virol Methods, 2013, 187(1): 85-89．

[3] 宋大偉, 魏建超, 鄭其升, 等． 新型SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)檢測豬乙型腦炎病毒特異性抗體的比較[J]．畜牧與獸醫(yī), 2006, 38(6): 44-46．

[4] 殷震, 劉景華． 動物病毒學(xué)[M]． 2版． 北京: 科學(xué)出版社, 1997． 633-641．

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[7] 鄧緒芳, 史子學(xué), 邱亞峰, 等． 流行性乙型腦炎病原生態(tài)學(xué)的研究概況[J]． 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 32( 2) : 111-114．

SEROLOGICAL SURVEY OF JAPANESE ENCEPHALITIS IN DOGS IN SHANGHAI

ZHONG Deng-ke1,2, WEI Jian-chao3, ZHAO Qiu-hua4, ZHANG Ke-long3, LI Lun-feng3, SHI Kun3, GU Jian-xin1, QIN Ai-jian2
(1. Shanghai Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Shanghai 201600, China; 2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China; 3. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 4. Minhang Center of Animal Disease Prevention and Control in Shanghai, Shanghai 201109, China)

To understand the infection status and epidemiological features of Japanese encephalitis virus(JEV) in dogs in Shanghai, 653 canine serum samples were collected from 2013 to 2014 in Shanghai for detection of anti-JEV antibodies using hemagglutination inhibition(HI). The survey revealed that the overall seropositive rate was 29.86% (195/653). The distributions of anti-JEV seropositive rates in dogs were analyzed regarding different seasons, locations, living environments, ages or genders. The positive relationship between anti-JEV seropositive rate and epidemic season was revealed. The difference in seropositive rates were signifi cant (P ＜ 0.05) between locations and living environments but not significant between genders and ages (P ＞ 0.05). These findings indicated there was high prevalence of JEV infection in dogs in Shanghai, so it is necessary to monitor strictly and prevent JEV infection in dogs.

Japanese encephalitis; hemagglutination inhibition test; serological survey; dog

S852.659.6

A

1674-6422（2016）05-0006-04

2016-04-25

國家自然科學(xué)基金(31302116)；上海高校青年教師培養(yǎng)資助計劃(ZZnlzl2003)；上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級科研項(xiàng)目（091227）

鐘登科，女，碩士，講師，主要從事動物疫病研究

秦愛建，E-mail：aijian@yzu．edu．cn；魏建超，E-mail：jianchaowei@shvri．a(chǎn)c．cn