于可響，黃 兵，凌紅麗，龐運(yùn)倩，王友令，李 峰，亓麗紅，宋敏訓(xùn)

（1.山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，青島 266061）

山東省血清4型禽腺病毒的分離鑒定

于可響1，黃 兵1，凌紅麗2，龐運(yùn)倩1，王友令1，李 峰1，亓麗紅1，宋敏訓(xùn)1

（1.山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心 山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250023；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，青島 266061）

近期從山東省許多地區(qū)爆發(fā)的主要以心包積液為主要病變特征的發(fā)病雞中分離到10株病毒，經(jīng)PCR檢測(cè)和血清型鑒定，確定為血清4型禽腺病毒。SPF雞回歸試驗(yàn)證實(shí)，分離到的病毒能完全復(fù)制出與臨床相同的癥狀與病變。用該病毒制備的滅活疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用，制作的抗體也具有良好的治療效果。

Ⅰ群禽腺病毒；血清4型；心包積液

禽腺病毒（Fowl adenovirus，F(xiàn)AV）根據(jù)抗原性差異可以分為3個(gè)群，其中Ⅰ群禽腺病毒又可分為12個(gè)血清型，能引起包涵體肝炎、心包積液、肌胃糜爛等病變。1987年在巴基斯坦安卡拉地區(qū)的肉雞場(chǎng)爆發(fā)了一種以心包積液為特征的疾病，稱為心包積液綜合征，又稱安卡拉病，該病后來蔓延至全國(guó)，給當(dāng)?shù)氐娜怆u養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的損失。隨后心包液綜合征在科威特、伊朗、日本、墨西哥等地相繼發(fā)生。經(jīng)研究證實(shí)，這些地區(qū)的心包積液綜合征均由Ⅰ群禽腺病毒的血清4型引起[1-5]。近幾年有研究人員從國(guó)內(nèi)臨床癥狀為包涵體肝炎和心包積液的發(fā)病雞群中分離到了血清4型禽腺病毒[6]。

自2015年6月開始，山東省部分地區(qū)的817肉雞中爆發(fā)了一種以死亡快、死亡率高、剖檢以心包積液為主要病變特征的傳染病。隨后該病傳至山東省多個(gè)地區(qū)，感染宿主也擴(kuò)大到蛋雞、麻雞、白羽肉雞、三黃雞、土雞等品種。

本研究從山東省不同地區(qū)不同品種的發(fā)病雞中收集到20份病料，通過SPF雞胚分離到10株病毒，SPF雞回歸試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離到的病毒能完全復(fù)制出與臨床相同的癥狀。經(jīng)陽性血清中和試驗(yàn)證實(shí)，該病是由Ⅰ群禽腺病毒血清4型引起。滅活疫苗和抗體對(duì)該病能起到較好的預(yù)防和治療作用。

1　材料與方法

1.1 發(fā)病情況 本病主要發(fā)生在10～30日齡的肉雞、30～80日齡的蛋雞、20～60日齡的麻雞，具有發(fā)病急、死亡快、死亡率高的特點(diǎn)，若不采取有效的治療措施，死亡率可達(dá)80%以上。該病傳播較慢，病程較長(zhǎng)，一般持續(xù)10 d以上，籠養(yǎng)蛋雞傳播更慢，有的可達(dá)30 d以上。發(fā)病雞常常突然倒地不起，數(shù)分鐘內(nèi)死亡；有的出現(xiàn)精神沉郁，臥地不起，而后出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，隨后很快死亡。死亡的雞大多有嚴(yán)重的心包積液，呈透明的淡黃色或淺褐色，相當(dāng)一部分死雞肝臟腫大、出血或壞死，部分死雞腎臟腫脹出血。

1.2 材料和試劑 采集20份發(fā)病雞的肝臟、脾臟和法氏囊用于病毒分離檢測(cè)；Ⅰ群禽腺病毒血清4型陽性血清由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)尹燕博教授惠贈(zèng)；SPF雞胚、SPF雞由山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育公司提供；817肉雞購自高唐縣某種雞場(chǎng)；RNAiso Reagent、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTP、Taq酶購自TaKaRa（大連）公司；蛋白酶K、SDS、苯酚購自北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 病料檢測(cè) 按照常規(guī)方法分別提取20份病料的DNA和RNA，利用PCR或RT-PCR方法進(jìn)行新城疫病毒、H9亞型禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、傳染性貧血病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖癥病毒、禽白血病病毒、Ⅰ群禽腺病毒等9種常見病毒的檢測(cè)。

1.4 病毒分離 取無其他病毒混感的發(fā)病雞的肝臟，加入5倍的體積生理鹽水和終濃度為1000 U/mL的青鏈霉素，剪碎后充分研磨，然后分裝，反復(fù)凍融3次，8000×g離心10 min，取上清經(jīng)細(xì)菌檢測(cè)無污染后，經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚（0．1 mL/枚），共6枚。收集接種后3～10 d內(nèi)死亡雞胚的尿囊液和胚體，測(cè)定尿囊液的血凝價(jià)，并觀察死胚的病變情況。

1.5 病毒鑒定

1.5.1 PCR鑒定 按照常規(guī)方法提取病毒DNA，利用PCR方法對(duì)Ⅰ群禽腺病毒進(jìn)行檢測(cè)。引物參照GenBank發(fā)表的禽腺病毒序列（登錄號(hào)：HQ709226）進(jìn)行設(shè)計(jì)。P1：5'-TTCGACCCCAT GACGCGCCAG G-3'；P2：5'-GCGAAAGGCGTA CGGAAGTAAGC-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為503 bp，引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.5.2 電鏡觀察 取有明顯病變的雞胚，研磨勻漿后凍融2次，然后3000×g離心20 min，上清液置于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸負(fù)染1～2 min，利用透射電鏡觀察。

1.5.3 血清型鑒定 按照常規(guī)的血清中和試驗(yàn)方法[7]，利用Ⅰ群禽腺病毒陽性血清對(duì)分離到的10株病毒進(jìn)行血清型鑒定。

1.6 SPF雞回歸試驗(yàn) 選取血清4型禽腺病毒YG8株，采用腿部肌肉注射的方式接種14日齡SPF雞10只，每只接種的劑量為100ELD50，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)雞發(fā)病、死亡與病變情況。

采集病死雞的肝臟，處理后接種6日齡SPF雞胚，觀察雞胚死亡及病變情況，以確定是否能從實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)再次分離到病毒。

1.7 滅活疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn) 將血清4型禽腺病毒YG8株的第10代雞胚毒接種SPF雞胚，收獲24 h后死亡雞胚的尿囊液和胚體，搗碎并凍融2次后，5000×g離心20 min，取上清經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚，測(cè)定其ELD50；病毒上清用終濃度為1．2‰的甲醛滅活，按照水相:油相為1:3的比例制備成油乳劑疫苗。

7日齡SPF雞隨機(jī)分成兩組。Ⅰ組為1次免疫攻毒組（n=8），疫苗通過皮下注射的方式免疫7日齡SPF雞8只，0．2 mL/只，免疫后10 d進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為100ELD50，同時(shí)非免疫攻毒組（n=8）；Ⅱ組為2次免疫攻毒組，（n=8）疫苗通過皮下注射的方式免疫7日齡SPF雞8只，0．2 mL/只，免疫后7 d進(jìn)行二次免疫，0．4 mL/只，二次免疫后10 d對(duì)免疫實(shí)驗(yàn)雞進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為100ELD50，同時(shí)各設(shè)非免疫攻毒組（n=8）。

1.8 抗體治療試驗(yàn) 利用1．7中制備的滅活疫苗免疫230日齡的商品蛋雞，免疫程序：首免0．5 mL/只，7 d后進(jìn)行二免（0．8 mL/只），二免14 d后進(jìn)行三免（1．0 mL/只）。收集三免后14～21 d的雞蛋，蛋黃用氯仿處理后，利用雞胚中和試驗(yàn)測(cè)定其中和效價(jià)。

40只18日齡的817肉雞隨機(jī)分成兩組，每組20只。A組為攻毒治療組，先采用肌肉注射的方式進(jìn)行攻毒，每只攻毒劑量為100ELD50，當(dāng)實(shí)驗(yàn)雞開始出現(xiàn)癥狀時(shí)，進(jìn)行抗體注射，每只0．5 mL；B組為攻毒對(duì)照組，只攻毒不治療。觀察記錄實(shí)驗(yàn)雞死亡情況直至攻毒后14 d。

2　結(jié)果

2.1 病料檢測(cè) 從山東省不同地區(qū)不同品種發(fā)病雞中收集到20份有嚴(yán)重心包積液的病料（圖1），對(duì)這些病料進(jìn)行了9種雞常見病毒的檢測(cè)。結(jié)果顯示，20份病料Ⅰ群禽腺病毒均為陽性，10份混有傳染性法氏囊病毒感染，6份混有傳染性貧血病毒感染，2份混有H9亞型禽流感病毒感染，其中5份同時(shí)存在禽腺病毒、傳染性法氏囊病毒和傳染性貧血病毒感染。

圖1　發(fā)病雞心包積液情況Fig. 1 Pericardial effusion of infected chicken

2.2 病毒分離 將10份無其他病毒混合感染的病料接種6日齡SPF雞胚，雞胚大多在接種后5～8 d內(nèi)死亡，胚體通身出血，部分胚體肝臟壞死。

2.3 病毒鑒定 利用PCR方法對(duì)通過雞胚分離到的病毒進(jìn)行Ⅰ群禽腺病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示這10株病毒均為陽性（圖2）。

圖2　病毒分離株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 PCR result of virus isolated from SPF chicken embryo

通過電鏡觀察可以看到典型的腺病毒特征：球形、無囊膜、呈二十面體對(duì)稱，直徑約70～80 nm（圖3）。利用Ⅰ群禽腺病毒陽性血清對(duì)分離到的10株病毒進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果表明這10株病毒均為血清4型。

圖3　病毒的電鏡觀察（40 000×）Fig. 3 Electron microscopic observation of the isolates (40 000×)

2.4SPF雞回歸試驗(yàn) 采用腿部肌肉注射途徑接種14日齡SPF雞，結(jié)果顯示，接種后4 d攻毒組開始出現(xiàn)死亡，至20 d攻毒組共死亡6只，死亡率為60%，死亡雞均有典型的心包積液和肝炎特征。

取病死雞的肝臟處理后接種SPF雞胚，結(jié)果雞胚出現(xiàn)死亡，胚體出血，病變與病毒初次分離時(shí)一致，說明能從實(shí)驗(yàn)雞體內(nèi)重新復(fù)制出Ⅰ群禽腺病毒。

2.5 滅活疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn) 用篩選的禽腺病毒制備滅活疫苗，免疫7日齡SPF雞。攻毒保護(hù)試驗(yàn)表明，一次免疫（Ⅰ組）即可產(chǎn)生較好的保護(hù)，兩次免疫（Ⅱ組）可以提供完全的保護(hù)（表1）。

表1　滅活疫苗免疫保護(hù)試驗(yàn)Table 1 The preventing test of inactivated vaccine

2.6 抗體治療試驗(yàn) 用制備的疫苗免疫健康產(chǎn)蛋雞，收集雞蛋制作抗體，用于抗體治療實(shí)驗(yàn)。結(jié)果治療組（A組）僅1只死亡，對(duì)照組（B組）死亡11只（表2），說明抗體對(duì)該病具有良好的治療作用。

表2　抗體治療效果試驗(yàn)Table 2 Treatment effect of antibody

3　討論

近幾年來，Ⅰ群禽腺病毒病在山東省膠東地區(qū)大型肉雞中一直呈散發(fā)性流行，主要是由血清2型8a型和8b型禽腺病毒引起，臨床癥狀為以肝臟發(fā)黃、腫大、變脆等為主要病變特征的包涵體肝炎，較少出現(xiàn)心包積液[8]。病程較短，死亡率一般不會(huì)超過30%；817肉雞、蛋雞、麻雞等發(fā)病較少。但本次調(diào)查研究顯示，這次流行的禽腺病毒病是由血清4型病毒引起，主要侵害817肉雞、蛋雞、麻雞，兩者在血清型、發(fā)病宿主、病變特征、流行特點(diǎn)等方面存在很大的差別。

我們發(fā)現(xiàn)，臨床上多數(shù)心包積液的病例并不單存在禽腺病毒的感染，而是同時(shí)存在傳染性法氏囊病毒或傳染性貧血病毒感染，甚至3種病毒的共同感染。有研究表明，傳染性法氏囊病毒、傳染性貧血病毒能增加Ⅰ群禽腺病毒的致病力，同時(shí)傳染性法氏囊病毒本身就有很強(qiáng)的致死性，這些都是造成該病高發(fā)病率、高死亡率的原因。

疫苗免疫實(shí)驗(yàn)和抗體治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，滅活疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用，抗體具有很好的治療效果。由于心包積液導(dǎo)致氧氣供應(yīng)不足是造成死亡的直接原因，因此降低飼養(yǎng)密度，增加正壓通風(fēng)，提供足夠的氧氣可以降低死亡率。從根本上預(yù)防本病，需要盡快研發(fā)相關(guān)疫苗進(jìn)行免疫接種。同時(shí)本病能夠通過垂直傳播，防控本病還應(yīng)從種雞著手。

血清4型禽腺病毒為什么會(huì)突然大面積爆發(fā)？為什么發(fā)病宿主的范圍突然擴(kuò)大？是病毒變異造成的？還是疫苗污染引起的？這些問題還需要進(jìn)一步研究。

[1] Saif Y M． 禽病學(xué)[M]． 蘇敬良, 高福, 索勛, 譯． 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2005．

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[4] Monreal G． Adenoviruses and adeno-associated viruses of poultry[J]． Poultry Sci Rev, 1992, 4: 1-27．

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CHARACTERIZATION OF SEROTYPE 4 FOWL ADENOVIRUS FROM SHANDONG

YU Ke-xiang1, HUANG Bing1, LING Hong-li2, PANG Yun-qian1, WANG You-ling1, LI Feng1, QI Li-hong1, SONG Min-xun1
(1. Shandong Provincial Key Laboratory of Poultry Disease Diagnosis and Immunology, Poultry Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250023, China; 2. Qingdao Vland Biotech Inc. Qingdao 266061, China)

Ten virus isolates were obtained from the diseased chickens with pericardial effusion in Shandong province. These isolates were identifi ed as serotype 4 Fowl adenovirus through PCR detection and serotyping. The clinical signs and lesions were reproduced in SPF chickens via experimental infection with the isolated viruses. The inactivated vaccine prepared from the obtained isolate prevented the reoccurrence and injection of immune serum provided good therapeutic treatment for diseased chickens.

Fowl adenovirus; serotype 4; pericardial effusion

S852.659.1

A

1674-6422（2016）05-0001-05

2016-01-07

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（SDAIT-13-011-01）；山東省海外高層次人才（泰山學(xué)者）引進(jìn)計(jì)劃；山東省2016年度農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“山東省血清4型禽腺病毒病流行病學(xué)及防控技術(shù)研究”

于可響，男，博士，副研究員，主要從事禽病研究

宋敏訓(xùn)，E-mail：mxsong@aliyun．com；亓麗紅，E-mail：lwsdjn@163．com