夏 楊付希安田洪青劉 紅張福仁

·短篇論著·

播散性淺表性光化性汗孔角化癥SLC17A9基因突變分析

夏 楊1，2付希安2田洪青2劉 紅2張福仁2

目的: 檢測(cè)11例山東漢族播散性淺表性光化性汗孔角化癥SLC17A9基因突變位點(diǎn)。方法: 提取患者外周血DNA，采用PCR擴(kuò)增患者SLC17A9基因的全部外顯子及其側(cè)翼序列，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序檢測(cè)。結(jié)果: 11例播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)患者的SLC17A9基因編碼區(qū)的所有外顯子均未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論: 本研究中11例DSAP患者的發(fā)病與SLC17A9基因的編碼區(qū)序列無關(guān)。

播散性淺表性光化性汗孔角化癥； SLC17A9基因； 基因突變

汗孔角化癥(porokeratosis，PK)是一種常染色體顯性遺傳的慢性進(jìn)行性角化性皮膚病，具有遺傳異質(zhì)性[1]。本病的發(fā)病誘因有遺傳、免疫抑制、紫外線、感染及外傷等。該病是由 Mibelli于 1893年首次報(bào)道[2]，根據(jù)形態(tài)學(xué)、皮損分布、臨床特征的不同，目前公認(rèn)分為5種臨床類型[3]:Mibelli型汗孔角化癥(PM)，播散性淺表性汗孔角化癥(DSP)，播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)，掌跖合并播散性汗孔角化癥(PPPD)，線狀汗孔角化癥(LP)。其中，播散性淺表性光化性汗孔角化癥(Disseminated superficial actinic porokeratosis，DSAP)是一組以環(huán)狀排列的異常角化性皮損為特征表現(xiàn)，主要發(fā)生在曝光部位的常染色體顯性遺傳性皮膚病，它是汗孔角化癥中最為常見的一種類型，30～40歲多見，由Chenosky等于1969年在德克薩斯人群首先描述[4]，DSAP作為一種遺傳性疾病，其表型改變是以基因的改變?yōu)榛A(chǔ)，因此尋找其致病基因不僅可以對(duì)疾病做出明確診斷，而且可以在分子水平更好的認(rèn)識(shí)其發(fā)病機(jī)制。通過傳統(tǒng)的以家系為基礎(chǔ)的全基因組連鎖分析研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6個(gè)DSAP的致病區(qū)域[5-10]:12q23.2-24.1，12q24.1-q24.2，15q25.1-26.1，Ip31.3-p31.1，16q24.1-24.3和20q13.33。2014年，張學(xué)軍團(tuán)隊(duì)通過對(duì)1個(gè)DSAP家系進(jìn)行全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)新的致病基因SLC17A9，并在6家系和19個(gè)散發(fā)DSAP患者中進(jìn)行驗(yàn)證，其中，在DSAP-2家系中發(fā)現(xiàn)SLC17A9基因突變位點(diǎn)1個(gè)[10]。為進(jìn)一步驗(yàn)證SLC17A9為 DSAP的致病基因，我們對(duì)收集到的4例DSAP家系的先證者及7例散發(fā)共11例患者進(jìn)行SLC17A9基因突變位點(diǎn)檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究選擇的用于驗(yàn)證的DSAP樣本都是經(jīng)之前MVK基因檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)變異的樣本，從中選擇4例有家族史的DSAP患者以及7例散發(fā)DSAP病例進(jìn)行基因檢測(cè)(圖1、2)。

1.2 材料 外周血DNA的提取:核對(duì)臨床資料、臨床圖片及組織病理檢查結(jié)果，從-80℃冰柜取出冷凍保存的血液，采用AXYGEN試劑盒提取基因組DNA。取適量DNA進(jìn)行純度檢測(cè)并標(biāo)化。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增 通過美國國家生物信息中心(NCBI)基因庫及UCSC數(shù)據(jù)庫檢索到SLC17A9基因的基因組序列，采用Premier Primer5.0軟件設(shè)計(jì)合適的引物，由北京華大基因科技有限公司合成(表1)。按照說明書將其稀釋為20μmol/L，并采用溫度梯度法探索每一對(duì)引物的最佳退火溫度。PCR反應(yīng)在9700型PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)上完成，反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min，94℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸8 min，4℃保存。

圖1 家系圖(1a:家系1；1b:家系2；1c:家系3；1d:家系4。箭頭示進(jìn)行基因測(cè)序檢測(cè)的患者)

圖2 2a:散發(fā)1患者腹部典型的DSAP皮損:曝光部位分布的邊緣堤狀隆起，中央輕度萎縮的褐色皮疹2b:散發(fā)1患者右側(cè)臀部和大腿的典型皮損2c:典型的角化不全柱(HE，×200)

表1 本研究中設(shè)計(jì)的引物

1.3.2 DNA測(cè)序 PCR產(chǎn)物采用ABI3130xl遺傳分析儀(美國ABI公司)直接測(cè)序。

2 結(jié)果

直接測(cè)序結(jié)果SLC17A9基因整個(gè)編碼區(qū)具有編碼功能的13條外顯子及其側(cè)翼序列被擴(kuò)增，并且個(gè)別外顯子采用了雙向測(cè)序，以確保測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。11例患者的DNA測(cè)序結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。

3 討論

DSAP是汗孔角化癥最常見的一種類型，屬常染色體顯性遺傳。暴露于紫外線和輻射治療為本病的誘發(fā)因素。長時(shí)間日曬后皮損可加重，因此皮損主要分布于面、頸、軀干、四肢伸側(cè)等曝光部位，表現(xiàn)為離心性角化性丘疹，界清，中央輕度凹陷萎縮，邊緣有突起的嵴。本病的診斷依靠皮損特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)及組織病理學(xué)檢查。

到目前為止，通過全基因組掃描技術(shù)、單倍型和重組連鎖分析等方法共定位了DSAP的6個(gè)致病區(qū)域:12q23.2-24.1，12q24.1-q24.2，15q25.1-26.1，1p31.3-p31.1，16q24.1-24.3和20q13.33[5-10]。并在上述 6個(gè)致病區(qū)域中，發(fā)現(xiàn) 4個(gè)致病基因 SSH1 (12q24.1-q24.2)[11]，SART3(12q24.1-q24.2)[6]，MVK(12q24)[12]和 SLC17A9(20q13.33)[10]，在其他致病區(qū)域未發(fā)現(xiàn)致病基因。

有證據(jù)表明SLC17A9負(fù)責(zé)溶酶體ATP積累[13]。據(jù)說ATP可激活蛋白酶如溶酶體中的組織蛋白酶D[14]和增加蛋白質(zhì)水解。組織蛋白酶D缺乏可引起溶酶體脂褐質(zhì)累積[15]表明，SLC17A9調(diào)節(jié)溶酶體蛋白水解作用通過保持ATP水平足以激活蛋白酶，如組織蛋白酶D。因此，沒有功能的SLC17A9可以減弱組織蛋白酶D活動(dòng)，促進(jìn)脂褐質(zhì)的積累和細(xì)胞死亡[13]。

SLC17A9是一種活化的ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它編碼蛋白感受不同的刺激因素啟動(dòng)ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)，如無機(jī)鹽離子，蛋白激酶 C等。其中無機(jī)鹽離子中包括Ca2+，K+，Cl-以及 Br-等[16]，負(fù)電荷無機(jī)鹽離子依賴的SLC17A9在結(jié)構(gòu)上與Cl-依賴的VGLUT相似。外來因素的刺激可以通過不同的通路來激活離子濃度的改變，從而啟動(dòng)由SLC17A9介導(dǎo)的ATP的轉(zhuǎn)運(yùn)，比如在T細(xì)胞受體受抗原刺激可以激活蛋白激酶C，導(dǎo)致細(xì)胞外Ca2+流入，從而啟動(dòng)ATP轉(zhuǎn)運(yùn)。與ATP轉(zhuǎn)運(yùn)伴隨發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化對(duì)于維持表皮的分化至關(guān)重要，表皮屏障功能缺失內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+的丟失可以導(dǎo)致增高水平的細(xì)胞增殖和降低水平的分化標(biāo)記的表達(dá)，同樣Ca2+濃度增加可以增加分化水平，抑制增殖[17]。對(duì)于角質(zhì)形成細(xì)胞，Ca2+通過質(zhì)膜向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞分化進(jìn)程有至關(guān)重要的作用[18]。Ca2+濃度升高可以增加細(xì)胞分化水平，同時(shí)抑制其增殖。研究證實(shí)遺傳性的Ca2+濃度失衡可以導(dǎo)致以多發(fā)性角質(zhì)性丘疹為主要皮損特征的常染色體顯性遺傳性毛囊角化病(Darier病)[19]。與Darier病類似，DSAP同樣表現(xiàn)角化過度，棘層肥厚以及角化不良的病理學(xué)特點(diǎn)，文獻(xiàn)中推斷SLC17A9基因變異導(dǎo)致的VNUT與ATP結(jié)合[13]，轉(zhuǎn)運(yùn)以及釋放異常，同時(shí)依賴ATP轉(zhuǎn)運(yùn)的Ca2+濃度發(fā)生改變，對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生影響，繼而導(dǎo)致DSAP發(fā)病。

迄今已發(fā)現(xiàn)2個(gè)DSAP相關(guān)的SLC17A9基因突變位點(diǎn)(表2)，但本研究中11例患者所有SLC17A9基因編碼區(qū)域及側(cè)翼序列均未發(fā)現(xiàn)突變。推測(cè)可能的原因:一是突變位點(diǎn)可能位于內(nèi)含子區(qū)域，而我們并沒有檢測(cè)所有的內(nèi)含子區(qū)域；二是該病可能存在其他致病基因。下一步我們會(huì)對(duì)非編碼區(qū)進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)內(nèi)含子區(qū)域是否存在突變。

表2 文獻(xiàn)中報(bào)道的關(guān)于DSAP的致病基因SLC17A9突變位點(diǎn)

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·病例報(bào)告·

Analysis of SLC17A9 genemutations in dissem inated superficial actinic porokeratosis

XIA Yang1，2，F(xiàn)U Xi'an2，TIAN Hongqing2，LIU Hong2，ZHANG Furen2.
1.School ofMedicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China；2.Shandong Provincial Institute ofDermatology and Venereology，Jinan 250022，China

Objective:To identifymutations of SLC17A9 gene in eleven patientswith disseminated superficial actinic porokeratosis.M ethods:After extracting DNA from peripheral blood，all the exons of SLC17A9 gene and their flanking intronic sequences were amplified by PCR，and then direct sequencing was performed to screen themutations in the gene.Results:No mutation was found in any of the exons in SLC17A9 gene from the eleven patients.Conclusion:The pathogenesis of the eleven patients with disseminated superficial actinic porokeratosis is not associated with the sequence of coding region in SLC17A9 gene.

disseminated superficial actinic porokeratosis；SLC17A9 gene；mutation

1濟(jì)南大學(xué)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250000 2山東省皮膚病性病防治研究所，濟(jì)南，250022

張福仁，E-mail:zhangfuren@hotmail.com