王希，陳麗，趙春雷，丁廣洲，賈海倫，徐杰

（1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱 150080；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080；4.黑龍江大學(xué)研究生學(xué)院，哈爾濱150080）

總DNA的提取是分子生物學(xué)技術(shù)中最基本、最重要的操作之一，也是決定后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。高質(zhì)量的DNA應(yīng)當(dāng)具備產(chǎn)量/得率理想、足夠完整、無(wú)斷裂無(wú)降解、雜質(zhì)殘留少等特點(diǎn)，同時(shí)，在提取過(guò)程中還應(yīng)當(dāng)盡可能節(jié)省時(shí)間、減少操作步驟、并盡量降低成本。然而DNA在生物體不同組織內(nèi)分布不同，在不同物種中也有差異。因此，DNA提取方法的選擇尤為重要，且針對(duì)不同植物、不同組織所采取的提取方法也應(yīng)有所差別。目前常用的包括高鹽低pH法、改良十二烷基硫酸鈉（SDS）法、改良十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）法及堿裂解法等多種方法[1-5]。

甜菜組織中富含酚類、糖類及其他次生代謝物，這些雜質(zhì)均會(huì)影響到總DNA提取的質(zhì)量與效率，且糖用甜菜為二年生作物，組織樣品的獲取方式與大部分一年生作物不同，往往需要從不同種組織中提取總DNA。因此對(duì)甜菜而言，針對(duì)不同研究目的、不同組織材料選擇適宜的總DNA提取方法，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)有著更為重要的意義，也是開(kāi)展大部分甜菜分子生物學(xué)研究的前提。

本研究選取甜菜的葉片、花、種子、根4種不同組織，分別采用上述4種提取方法進(jìn)行總DNA的提取，并比較提取產(chǎn)物的得率、純度與PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效果，探討各組織最適合的總DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用甜菜材料為所在課題組保存的糖用甜菜種質(zhì)M12，試驗(yàn)組織包括甜菜的幼嫩葉片、幼嫩花序、萌動(dòng)種子及糖分積累期塊根；PCR引物為課題組前期設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）引物，由上海生工生物公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物約100bp；其它常規(guī)試劑與儀器略。

1.2 提取方法

改良CTAB法采用閆慶祥等[1]方法，改良SDS法采用單志等[2]方法，高鹽低pH法采用伍艷芳等[3]方法，堿裂解法采用李筱婷和王茂芊等[4-5]方法。產(chǎn)物用RNA酶處理以減小質(zhì)量檢測(cè)時(shí)的誤差。

1.3 總DNA產(chǎn)量與質(zhì)量檢測(cè)

測(cè)量DNA產(chǎn)物在260nm處的光密度值 （optical density，OD），計(jì)算產(chǎn)物濃度與DNA得率；根據(jù)比值OD260/OD280與OD260/OD230評(píng)價(jià)產(chǎn)物純度。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

DNA濃度與得率計(jì)算公式：樣品濃度（μg/mL）=OD260×稀釋倍數(shù)×50；樣品得率（μg/mg）=樣品濃度×樣品體積（mL）/組織質(zhì)量（mg）每種提取方法對(duì)不同組織均提取3份總DNA作為重復(fù)。

1.4 PCR擴(kuò)增效果檢測(cè)

應(yīng)用特異性及擴(kuò)增效率中等的SSR引物，使用上述4種方法所提取的總DNA組作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析DNA產(chǎn)物質(zhì)量對(duì)PCR效果是否有影響。

2 結(jié)果與分析

組織 方法 OD/OD OD/OD 得率/（μ葉片 堿裂解法 1.141 c 0.890 d 0.046 c cTAB 826 b 175 a 98 a SDS法 1.3 a .89 0.06高鹽低pH法 1.338 c 1.645 b 0.067 b cTAB法 1.970 a 1.821 a 0.105 a SDS 3 79 b 96 b高鹽低pH法 647 b 568 c 82 g/mg）種子 堿裂解法 122 d 075 d 24 c cTAB 1.81 b 1.682 b 0.09 a SDS法 1.888 a 1.888 a 0.030 a高鹽低pH法 376 c 320 d 2 b花 堿裂解法 103 d 418 c 40 c cTAB法 1.846 b 1.730 b 0.051 a SDS 95 a 86 a 9高鹽低pH法 1.596 c 1.503 c 0.040 b根 堿裂解法 1.335 d 1.433 c 0.012 c注：數(shù)據(jù)來(lái)自3次重復(fù)平均值；字母表示方法間差異顯著性

2.1 不同方法提取DNA質(zhì)量及得率比較

通常情況下，核酸及其衍生物紫外光吸收高峰為260nm，可據(jù)此估算核酸溶液濃度；蛋白質(zhì)的吸收峰值為280nm；多糖、酚類及色素的吸收峰值則為230nm。純凈的DNA樣品的OD260/OD230值約為2.0，過(guò)低表明小分子物質(zhì)殘留較多；OD260/OD280值約為1.8，若比值大于1.8表示存在RNA殘留，若值小于1.8則可能存在蛋白質(zhì)污染。本研究共采用了4種方法自各組織中提取總DNA，根據(jù)OD值分析產(chǎn)物純度與得率，結(jié)果見(jiàn)表1。

就葉片而言，改良CTAB法的提取效果最為理想，得率較高，雜質(zhì)去除也較徹底；SDS法次之，得率與CTAB法類似，但蛋白質(zhì)殘留略多；高鹽低pH法與堿裂解法所得產(chǎn)物純度遠(yuǎn)低于另外兩種方法，產(chǎn)量也相對(duì)較低。對(duì)于花的提取，DNA產(chǎn)量與質(zhì)量略低于葉片，其中CTAB法與SDS法均能得到較高得率，并能基本去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，但SDS法對(duì)其它小分子的去除效果優(yōu)于CTAB法；另外兩種方法的產(chǎn)率和質(zhì)量均較低。對(duì)于種子和根，4種方法的得率均遠(yuǎn)低于葉片與花，SDS法在雜質(zhì)去除上優(yōu)于另外3種方法。

此外，比較來(lái)自不同組織的總DNA，使用葉片提取的DNA質(zhì)量?jī)?yōu)于其他3種組織；得率方面，葉片和花相近，而根和種子的得率較低；其中改良CTAB法最適宜葉片的總DNA提取，改良SDS法適宜提取其它3種組織的DNA。

2.2 不同方法所得DNA的完整性檢測(cè)

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，可直觀地對(duì)比DNA產(chǎn)物的質(zhì)量與完整性，結(jié)果見(jiàn)圖1。由于不同方法、不同組織得率差異較大，因此調(diào)整上樣量，避免條帶亮度差異過(guò)大影響圖像采集。其中，堿裂解法所得產(chǎn)物的上樣量為其它3種方法產(chǎn)物的2倍；每種方法中，種子所得DNA的上樣量為葉片與花的2倍，根的上樣量為葉片與花的4倍。

同一方法從不同組織中提取出的DNA電泳帶型相似，表明DNA產(chǎn)物完整性基本不受組織類型的影響。比較不同方法所得DNA的完整性，可見(jiàn)CTAB法與SDS法的產(chǎn)物條帶清晰明亮，幾乎不拖尾，堿裂解法雖然條帶較暗，但也可見(jiàn)無(wú)拖尾的產(chǎn)物條帶，表明這些方法對(duì)DNA完整性的影響均較??；高鹽低pH法則有較明顯的拖尾現(xiàn)象，表明產(chǎn)物斷裂或降解程度較大，或是由于雜質(zhì)的存在，導(dǎo)致了DNA的陸續(xù)降解。

2.3 提取效果對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

將4種提取方法所取得的總DNA樣品分別作為模板，采用SSR引物A1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效率與特異性分析所得DNA對(duì)PCR反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

4種方法所提取的DNA大部分可得到擴(kuò)增產(chǎn)物。其中，CTAB法與SDS法所得產(chǎn)物得到了單一的擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增特異性比較好，表明產(chǎn)物中干擾PCR反應(yīng)的雜質(zhì)較少；高鹽低pH法和堿裂解法除目的條帶外，還得到了一些非特異性條帶，表明產(chǎn)物中殘留的雜質(zhì)有可能影響PCR反應(yīng)的特異性。比較不同組織DNA的PCR結(jié)果，可見(jiàn)來(lái)自葉片與花的DNA均得到了擴(kuò)增產(chǎn)物，而種子與根DNA條帶較淺或幾乎不可見(jiàn)，與DNA得率有類似的趨勢(shì)，表明DNA得率過(guò)低時(shí)，會(huì)使PCR擴(kuò)增效率隨之降低。高鹽低pH法與堿裂解法所得的種子和根的DNA作為模板時(shí)，PCR效率低，非特異產(chǎn)物條帶明顯，說(shuō)明這4份DNA的純度和濃度不足以進(jìn)行高質(zhì)量的PCR反應(yīng)。

3 討論

甜菜組織細(xì)胞中富含多糖、酚類及其他次生代謝物，一方面DNA容易被包埋在雜質(zhì)之中而不能充分溶解，從而影響提取效率，另一方面這些物質(zhì)的殘留會(huì)影響DNA純度，進(jìn)而影響后續(xù)試驗(yàn)[5]。甜菜的不同組織由于自身特點(diǎn)不同，所能夠提取到的總DNA的濃度及產(chǎn)量和得率也有所不同。

3.1 4種提取方法比較與適用性分析

3.1.1 CTAB法 CTAB是一種陽(yáng)離子去污劑，既能夠裂解細(xì)胞，又能夠與DNA形成復(fù)合物，溶解于高鹽溶液中，鹽濃度降低時(shí)析出。CTAB能夠有效地沉淀多糖，但對(duì)蛋白質(zhì)、酚類以及多酚氧化產(chǎn)物等的去除效果一般[6]。改良CTAB法以氯仿為主要抽取試劑，可以在一定程度上避免向產(chǎn)物中引入更多酚類，但對(duì)蛋白質(zhì)的抽提效果也有所下降。本研究結(jié)果表明，改良CTAB法更適宜于甜菜葉片的總DNA提取，但對(duì)于花、種子和根這些細(xì)胞偏老、成分相對(duì)復(fù)雜的組織，雜質(zhì)去除效果則不如SDS法。

3.1.2 SDS法 SDS是一種陰離子去污劑，能夠裂解細(xì)胞，釋放核DNA。改良SDS法改進(jìn)了細(xì)胞破碎及DNA純化步驟，可避免常規(guī)SDS法常出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象[2]。但甜菜組織細(xì)胞中的多糖、酚類及其他次生代謝物含量較多，可能干擾了DNA的溶解，從而使SDS法的提取效率略遜于改良CTAB法。本研究中，改良SDS法更適宜于花、種子及根的總DNA提取，可獲得較純凈的DNA。

3.1.3 高鹽低pH法 高鹽低pH法的酸性環(huán)境能夠避免組織細(xì)胞破碎時(shí)和大量材料沉淀時(shí)的電離化作用及酚類化合物的褐化現(xiàn)象，高鹽則能夠沉淀蛋白質(zhì)，該方法操作較為經(jīng)濟(jì)，比較適用于多糖及次生代謝產(chǎn)物含量較低的提取材料[3]。本研究證明，對(duì)于成分較復(fù)雜的甜菜組織而言，使用高鹽低pH法所提取的總DNA濃度及得率均較低。另外，此方法所得DNA的完整性也相對(duì)較差，可能是由于多步操作中機(jī)械剪切力所致，也有可能是殘留雜質(zhì)的影響。

3.1.4 堿裂解法 堿裂解法采用NaOH溶液裂解細(xì)胞，經(jīng)簡(jiǎn)單的純化步驟后，得到DNA的粗提物。其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)很短，但由于在提取總DNA的過(guò)程中缺乏有針對(duì)性的雜質(zhì)抽提步驟，當(dāng)某些雜質(zhì)殘留較多時(shí)，將對(duì)PCR擴(kuò)增效果造成影響[7]；另外該方法的產(chǎn)量及得率也較低，提取效果不夠理想。堿裂解法的優(yōu)勢(shì)在于每個(gè)樣品提取時(shí)間僅約30min，當(dāng)樣品提取難度不大、對(duì)DNA質(zhì)量要求不高、待提取樣品數(shù)目較多時(shí)，采用堿裂解法能夠有效地提高工作效率。

3.2 不同組織提取效果比較

本文的結(jié)果表明，甜菜不同部位所提取的DNA量有較大差異，4種提取方法從葉片和花中提取的總DNA的產(chǎn)量及得率均優(yōu)于種子和根。這與不同組織中細(xì)胞特征的差異有較大關(guān)系：幼嫩葉片中大部分細(xì)胞為未成熟細(xì)胞，細(xì)胞多且小，細(xì)胞壁較薄，代謝活動(dòng)較為活躍，等質(zhì)量組織中細(xì)胞數(shù)目較多，提取過(guò)程中細(xì)胞容易破碎，DNA釋放量較大，因而提取量較多[8]。幼嫩花序中，有一部分成熟細(xì)胞，也存在相當(dāng)大部分未成熟的細(xì)胞，因此得率也相對(duì)較高。而種子和根為成熟組織，且其中很大一部分是貯藏細(xì)胞，DNA含量較低、復(fù)制不旺盛，因此采用同樣方法進(jìn)行DNA提取，得率僅為葉片或花的一半左右。若使用葉片或花序作為材料，盡可能選取幼嫩部分，即可得到較高的得率，而使用種子或根作為材料時(shí)，建議根據(jù)需要增加濃縮步驟，否則很難得到充足的DNA。

從DNA產(chǎn)物純度來(lái)看，葉片中除糖類與葉綠素以外，其它雜質(zhì)均比較少，產(chǎn)物質(zhì)量也相對(duì)優(yōu)于其它3種組織?；ā⒎N子和根中另有一些色素、貯藏物質(zhì)及多糖，與葉片相比成分比較復(fù)雜，因此經(jīng)過(guò)同樣的抽提步驟，殘留的雜質(zhì)多于葉片，并有可能由于雜質(zhì)的干擾，降低DNA提取的效率。

雜質(zhì)的殘留對(duì)PCR反應(yīng)的特異性有一定影響，DNA產(chǎn)物濃度則影響著PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，當(dāng)DNA純度與濃度低于一定范圍時(shí)，PCR的質(zhì)量與重復(fù)性均會(huì)受到影響。根據(jù)本研究結(jié)果，若要保證PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，DNA產(chǎn)物的濃度應(yīng)不低于0.05μg/μL，當(dāng)需要自根或種子中提取DNA時(shí)，建議將產(chǎn)物濃縮，以免濃度過(guò)低影響PCR效率，同時(shí)選擇雜質(zhì)去除效果較好的SDS法進(jìn)行提取，適當(dāng)增加純化步驟，以盡量避免雜質(zhì)對(duì)PCR特異性的影響。

4 結(jié)論

4.1 以甜菜幼嫩葉片、幼嫩花序、萌動(dòng)種子與糖分積累期塊根作為材料均可獲得總DNA。其中，以葉片與花序作為材料，提取效果較好。種子與塊根提取難度較大，產(chǎn)物得率低，需要提取時(shí)建議增加濃縮步驟。

4.2 改良CTAB法比較適合自甜菜幼嫩葉片中提取總DNA；SDS法比較適合花序、種子、根中的DNA提?。粔A裂解法適用于DNA的快速提??；高鹽低pH法未見(jiàn)優(yōu)勢(shì)。種子與塊根由于總DNA得率低，不建議用堿裂解法提取。

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