王希,陳麗,趙春雷,丁廣洲,賈海倫,徐杰
(1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所,哈爾濱 150080;2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實驗室,哈爾濱150080;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實驗室,黑龍江哈爾濱150080;4.黑龍江大學(xué)研究生學(xué)院,哈爾濱150080)
總DNA的提取是分子生物學(xué)技術(shù)中最基本、最重要的操作之一,也是決定后續(xù)試驗結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。高質(zhì)量的DNA應(yīng)當(dāng)具備產(chǎn)量/得率理想、足夠完整、無斷裂無降解、雜質(zhì)殘留少等特點(diǎn),同時,在提取過程中還應(yīng)當(dāng)盡可能節(jié)省時間、減少操作步驟、并盡量降低成本。然而DNA在生物體不同組織內(nèi)分布不同,在不同物種中也有差異。因此,DNA提取方法的選擇尤為重要,且針對不同植物、不同組織所采取的提取方法也應(yīng)有所差別。目前常用的包括高鹽低pH法、改良十二烷基硫酸鈉(SDS)法、改良十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法及堿裂解法等多種方法[1-5]。
甜菜組織中富含酚類、糖類及其他次生代謝物,這些雜質(zhì)均會影響到總DNA提取的質(zhì)量與效率,且糖用甜菜為二年生作物,組織樣品的獲取方式與大部分一年生作物不同,往往需要從不同種組織中提取總DNA。因此對甜菜而言,針對不同研究目的、不同組織材料選擇適宜的總DNA提取方法,對后續(xù)試驗有著更為重要的意義,也是開展大部分甜菜分子生物學(xué)研究的前提。
本研究選取甜菜的葉片、花、種子、根4種不同組織,分別采用上述4種提取方法進(jìn)行總DNA的提取,并比較提取產(chǎn)物的得率、純度與PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效果,探討各組織最適合的總DNA提取方法。
1.1 試驗材料
試驗用甜菜材料為所在課題組保存的糖用甜菜種質(zhì)M12,試驗組織包括甜菜的幼嫩葉片、幼嫩花序、萌動種子及糖分積累期塊根;PCR引物為課題組前期設(shè)計的簡單序列重復(fù)標(biāo)記(simple sequence repeat,SSR)引物,由上海生工生物公司合成,擴(kuò)增產(chǎn)物約100bp;其它常規(guī)試劑與儀器略。
1.2 提取方法
改良CTAB法采用閆慶祥等[1]方法,改良SDS法采用單志等[2]方法,高鹽低pH法采用伍艷芳等[3]方法,堿裂解法采用李筱婷和王茂芊等[4-5]方法。產(chǎn)物用RNA酶處理以減小質(zhì)量檢測時的誤差。
1.3 總DNA產(chǎn)量與質(zhì)量檢測
測量DNA產(chǎn)物在260nm處的光密度值 (optical density,OD),計算產(chǎn)物濃度與DNA得率;根據(jù)比值OD260/OD280與OD260/OD230評價產(chǎn)物純度。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。
DNA濃度與得率計算公式:樣品濃度(μg/mL)=OD260×稀釋倍數(shù)×50;樣品得率(μg/mg)=樣品濃度×樣品體積(mL)/組織質(zhì)量(mg)每種提取方法對不同組織均提取3份總DNA作為重復(fù)。
1.4 PCR擴(kuò)增效果檢測
應(yīng)用特異性及擴(kuò)增效率中等的SSR引物,使用上述4種方法所提取的總DNA組作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分析DNA產(chǎn)物質(zhì)量對PCR效果是否有影響。
組織 方法 OD/OD OD/OD 得率/(μ葉片 堿裂解法 1.141 c 0.890 d 0.046 c cTAB 826 b 175 a 98 a SDS法 1.3 a .89 0.06高鹽低pH法 1.338 c 1.645 b 0.067 b cTAB法 1.970 a 1.821 a 0.105 a SDS 3 79 b 96 b高鹽低pH法 647 b 568 c 82 g/mg)種子 堿裂解法 122 d 075 d 24 c cTAB 1.81 b 1.682 b 0.09 a SDS法 1.888 a 1.888 a 0.030 a高鹽低pH法 376 c 320 d 2 b花 堿裂解法 103 d 418 c 40 c cTAB法 1.846 b 1.730 b 0.051 a SDS 95 a 86 a 9高鹽低pH法 1.596 c 1.503 c 0.040 b根 堿裂解法 1.335 d 1.433 c 0.012 c注:數(shù)據(jù)來自3次重復(fù)平均值;字母表示方法間差異顯著性
2.1 不同方法提取DNA質(zhì)量及得率比較
通常情況下,核酸及其衍生物紫外光吸收高峰為260nm,可據(jù)此估算核酸溶液濃度;蛋白質(zhì)的吸收峰值為280nm;多糖、酚類及色素的吸收峰值則為230nm。純凈的DNA樣品的OD260/OD230值約為2.0,過低表明小分子物質(zhì)殘留較多;OD260/OD280值約為1.8,若比值大于1.8表示存在RNA殘留,若值小于1.8則可能存在蛋白質(zhì)污染。本研究共采用了4種方法自各組織中提取總DNA,根據(jù)OD值分析產(chǎn)物純度與得率,結(jié)果見表1。
就葉片而言,改良CTAB法的提取效果最為理想,得率較高,雜質(zhì)去除也較徹底;SDS法次之,得率與CTAB法類似,但蛋白質(zhì)殘留略多;高鹽低pH法與堿裂解法所得產(chǎn)物純度遠(yuǎn)低于另外兩種方法,產(chǎn)量也相對較低。對于花的提取,DNA產(chǎn)量與質(zhì)量略低于葉片,其中CTAB法與SDS法均能得到較高得率,并能基本去除蛋白質(zhì)雜質(zhì),但SDS法對其它小分子的去除效果優(yōu)于CTAB法;另外兩種方法的產(chǎn)率和質(zhì)量均較低。對于種子和根,4種方法的得率均遠(yuǎn)低于葉片與花,SDS法在雜質(zhì)去除上優(yōu)于另外3種方法。
此外,比較來自不同組織的總DNA,使用葉片提取的DNA質(zhì)量優(yōu)于其他3種組織;得率方面,葉片和花相近,而根和種子的得率較低;其中改良CTAB法最適宜葉片的總DNA提取,改良SDS法適宜提取其它3種組織的DNA。
2.2 不同方法所得DNA的完整性檢測
通過瓊脂糖凝膠電泳,可直觀地對比DNA產(chǎn)物的質(zhì)量與完整性,結(jié)果見圖1。由于不同方法、不同組織得率差異較大,因此調(diào)整上樣量,避免條帶亮度差異過大影響圖像采集。其中,堿裂解法所得產(chǎn)物的上樣量為其它3種方法產(chǎn)物的2倍;每種方法中,種子所得DNA的上樣量為葉片與花的2倍,根的上樣量為葉片與花的4倍。
同一方法從不同組織中提取出的DNA電泳帶型相似,表明DNA產(chǎn)物完整性基本不受組織類型的影響。比較不同方法所得DNA的完整性,可見CTAB法與SDS法的產(chǎn)物條帶清晰明亮,幾乎不拖尾,堿裂解法雖然條帶較暗,但也可見無拖尾的產(chǎn)物條帶,表明這些方法對DNA完整性的影響均較??;高鹽低pH法則有較明顯的拖尾現(xiàn)象,表明產(chǎn)物斷裂或降解程度較大,或是由于雜質(zhì)的存在,導(dǎo)致了DNA的陸續(xù)降解。
2.3 提取效果對PCR擴(kuò)增的影響
將4種提取方法所取得的總DNA樣品分別作為模板,采用SSR引物A1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增效率與特異性分析所得DNA對PCR反應(yīng)的影響,結(jié)果見圖2。
4種方法所提取的DNA大部分可得到擴(kuò)增產(chǎn)物。其中,CTAB法與SDS法所得產(chǎn)物得到了單一的擴(kuò)增條帶,擴(kuò)增特異性比較好,表明產(chǎn)物中干擾PCR反應(yīng)的雜質(zhì)較少;高鹽低pH法和堿裂解法除目的條帶外,還得到了一些非特異性條帶,表明產(chǎn)物中殘留的雜質(zhì)有可能影響PCR反應(yīng)的特異性。比較不同組織DNA的PCR結(jié)果,可見來自葉片與花的DNA均得到了擴(kuò)增產(chǎn)物,而種子與根DNA條帶較淺或幾乎不可見,與DNA得率有類似的趨勢,表明DNA得率過低時,會使PCR擴(kuò)增效率隨之降低。高鹽低pH法與堿裂解法所得的種子和根的DNA作為模板時,PCR效率低,非特異產(chǎn)物條帶明顯,說明這4份DNA的純度和濃度不足以進(jìn)行高質(zhì)量的PCR反應(yīng)。
甜菜組織細(xì)胞中富含多糖、酚類及其他次生代謝物,一方面DNA容易被包埋在雜質(zhì)之中而不能充分溶解,從而影響提取效率,另一方面這些物質(zhì)的殘留會影響DNA純度,進(jìn)而影響后續(xù)試驗[5]。甜菜的不同組織由于自身特點(diǎn)不同,所能夠提取到的總DNA的濃度及產(chǎn)量和得率也有所不同。
3.1 4種提取方法比較與適用性分析
3.1.1 CTAB法 CTAB是一種陽離子去污劑,既能夠裂解細(xì)胞,又能夠與DNA形成復(fù)合物,溶解于高鹽溶液中,鹽濃度降低時析出。CTAB能夠有效地沉淀多糖,但對蛋白質(zhì)、酚類以及多酚氧化產(chǎn)物等的去除效果一般[6]。改良CTAB法以氯仿為主要抽取試劑,可以在一定程度上避免向產(chǎn)物中引入更多酚類,但對蛋白質(zhì)的抽提效果也有所下降。本研究結(jié)果表明,改良CTAB法更適宜于甜菜葉片的總DNA提取,但對于花、種子和根這些細(xì)胞偏老、成分相對復(fù)雜的組織,雜質(zhì)去除效果則不如SDS法。
3.1.2 SDS法 SDS是一種陰離子去污劑,能夠裂解細(xì)胞,釋放核DNA。改良SDS法改進(jìn)了細(xì)胞破碎及DNA純化步驟,可避免常規(guī)SDS法常出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象[2]。但甜菜組織細(xì)胞中的多糖、酚類及其他次生代謝物含量較多,可能干擾了DNA的溶解,從而使SDS法的提取效率略遜于改良CTAB法。本研究中,改良SDS法更適宜于花、種子及根的總DNA提取,可獲得較純凈的DNA。
3.1.3 高鹽低pH法 高鹽低pH法的酸性環(huán)境能夠避免組織細(xì)胞破碎時和大量材料沉淀時的電離化作用及酚類化合物的褐化現(xiàn)象,高鹽則能夠沉淀蛋白質(zhì),該方法操作較為經(jīng)濟(jì),比較適用于多糖及次生代謝產(chǎn)物含量較低的提取材料[3]。本研究證明,對于成分較復(fù)雜的甜菜組織而言,使用高鹽低pH法所提取的總DNA濃度及得率均較低。另外,此方法所得DNA的完整性也相對較差,可能是由于多步操作中機(jī)械剪切力所致,也有可能是殘留雜質(zhì)的影響。
3.1.4 堿裂解法 堿裂解法采用NaOH溶液裂解細(xì)胞,經(jīng)簡單的純化步驟后,得到DNA的粗提物。其優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單、耗時很短,但由于在提取總DNA的過程中缺乏有針對性的雜質(zhì)抽提步驟,當(dāng)某些雜質(zhì)殘留較多時,將對PCR擴(kuò)增效果造成影響[7];另外該方法的產(chǎn)量及得率也較低,提取效果不夠理想。堿裂解法的優(yōu)勢在于每個樣品提取時間僅約30min,當(dāng)樣品提取難度不大、對DNA質(zhì)量要求不高、待提取樣品數(shù)目較多時,采用堿裂解法能夠有效地提高工作效率。
3.2 不同組織提取效果比較
本文的結(jié)果表明,甜菜不同部位所提取的DNA量有較大差異,4種提取方法從葉片和花中提取的總DNA的產(chǎn)量及得率均優(yōu)于種子和根。這與不同組織中細(xì)胞特征的差異有較大關(guān)系:幼嫩葉片中大部分細(xì)胞為未成熟細(xì)胞,細(xì)胞多且小,細(xì)胞壁較薄,代謝活動較為活躍,等質(zhì)量組織中細(xì)胞數(shù)目較多,提取過程中細(xì)胞容易破碎,DNA釋放量較大,因而提取量較多[8]。幼嫩花序中,有一部分成熟細(xì)胞,也存在相當(dāng)大部分未成熟的細(xì)胞,因此得率也相對較高。而種子和根為成熟組織,且其中很大一部分是貯藏細(xì)胞,DNA含量較低、復(fù)制不旺盛,因此采用同樣方法進(jìn)行DNA提取,得率僅為葉片或花的一半左右。若使用葉片或花序作為材料,盡可能選取幼嫩部分,即可得到較高的得率,而使用種子或根作為材料時,建議根據(jù)需要增加濃縮步驟,否則很難得到充足的DNA。
從DNA產(chǎn)物純度來看,葉片中除糖類與葉綠素以外,其它雜質(zhì)均比較少,產(chǎn)物質(zhì)量也相對優(yōu)于其它3種組織?;?、種子和根中另有一些色素、貯藏物質(zhì)及多糖,與葉片相比成分比較復(fù)雜,因此經(jīng)過同樣的抽提步驟,殘留的雜質(zhì)多于葉片,并有可能由于雜質(zhì)的干擾,降低DNA提取的效率。
雜質(zhì)的殘留對PCR反應(yīng)的特異性有一定影響,DNA產(chǎn)物濃度則影響著PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率,當(dāng)DNA純度與濃度低于一定范圍時,PCR的質(zhì)量與重復(fù)性均會受到影響。根據(jù)本研究結(jié)果,若要保證PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性與重復(fù)性,DNA產(chǎn)物的濃度應(yīng)不低于0.05μg/μL,當(dāng)需要自根或種子中提取DNA時,建議將產(chǎn)物濃縮,以免濃度過低影響PCR效率,同時選擇雜質(zhì)去除效果較好的SDS法進(jìn)行提取,適當(dāng)增加純化步驟,以盡量避免雜質(zhì)對PCR特異性的影響。
4.1 以甜菜幼嫩葉片、幼嫩花序、萌動種子與糖分積累期塊根作為材料均可獲得總DNA。其中,以葉片與花序作為材料,提取效果較好。種子與塊根提取難度較大,產(chǎn)物得率低,需要提取時建議增加濃縮步驟。
4.2 改良CTAB法比較適合自甜菜幼嫩葉片中提取總DNA;SDS法比較適合花序、種子、根中的DNA提??;堿裂解法適用于DNA的快速提取;高鹽低pH法未見優(yōu)勢。種子與塊根由于總DNA得率低,不建議用堿裂解法提取。
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