張軍麗，李瑞玲，潘慶才

(黃淮學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000 )

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電化學(xué)傳感器在H2O2檢測(cè)中的應(yīng)用

張軍麗*，李瑞玲，潘慶才

(黃淮學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000 )

將辣根過(guò)氧化酶(HRP)固定在殼聚糖(CTS) -羧基化多壁碳納米管(C-MWNTs)復(fù)合物修飾的玻碳電極(GCE)表面，制得殼聚糖-羧基化多壁碳納米管(HRP-CTS/C-MWNTs/GCE)電化學(xué)傳感器。采用傅立葉變換紅外光譜儀檢測(cè)復(fù)合物包埋的HRP，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)性質(zhì)未發(fā)生改變；采用循環(huán)伏安法對(duì)該電極的電化學(xué)性能進(jìn)行研究，結(jié)果表明：在1/15 mol·L-1的PBS(pH 6.98)緩沖溶液中出現(xiàn)1對(duì)氧化還原峰，傳感器對(duì)過(guò)氧化氫有良好的電催化還原作用。過(guò)氧化氫濃度在0.1～12 mmol·L-1范圍內(nèi)與還原峰電流呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 6，并檢測(cè)出市售醫(yī)用雙氧水的平均含量為2.93%。

殼聚糖；羧基化多壁碳納米管；辣根過(guò)氧化物酶；電化學(xué)傳感器；過(guò)氧化氫

多壁碳納米管具有高的金屬性、獨(dú)特的電子傳導(dǎo)性及電催化性能，并具有大的比表面積以及良好的生物兼容性，是優(yōu)越的電子傳遞媒介，易與周圍的其它物質(zhì)發(fā)生電子傳遞作用，已用于促進(jìn)生物傳感器的電活性，從而被廣泛用于各種領(lǐng)域[1-5]。羧基化多壁碳納米管是經(jīng)酸化處理后，其開(kāi)口端和外表面含有一定數(shù)量的活性基團(tuán)(如羥基、羧基等)，大大提高了碳納米管的電催化能力[6]。生物傳感器是用固定的生物材料作為敏感元件，電極作為轉(zhuǎn)換元件，以電勢(shì)或電流為特征檢測(cè)信號(hào)[7-8]。殼聚糖分子內(nèi)同時(shí)含有氨基和羥基，具有優(yōu)異的成膜性，良好的水通透性，無(wú)毒，具有模板的記憶能力和選擇吸附性能，以及良好的生物相容性而被用于生物傳感器的構(gòu)建[9]，并將其用于過(guò)氧化氫含量的測(cè)定[10-16]。以往應(yīng)用殼聚糖、多壁碳納米管和HRP修飾電極時(shí)，大多采取簡(jiǎn)單混合的方法，而本文采用循環(huán)伏安電化學(xué)分析法，利用羧基化的多壁碳納米管帶負(fù)電荷與帶正電荷的殼聚糖之間存在靜電吸附及生物相容性，將辣根過(guò)氧化物酶包埋固定在殼聚糖-羧基化多壁碳納米管復(fù)合膜上，制備了HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電化學(xué)傳感器，對(duì)痕量過(guò)氧化氫的電化學(xué)性能進(jìn)行研究，并測(cè)定了市售雙氧水的含量。結(jié)果表明，HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極對(duì)H2O2的電催化氧化效果相比于裸玻碳電極有較大提高，為快速、準(zhǔn)確檢測(cè)生活用品和食品中H2O2的含量提供了可能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Zennium電化學(xué)工作站(德國(guó)Zahner公司)；三電極系統(tǒng)：參比電極為飽和甘汞電極，輔助電極為鉑絲電極，工作電極為HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極。FTIR 表征采用Tensor27 型傅立葉變換紅外光譜議(德國(guó)Bruker 公司);殼聚糖(分析純，脫乙酰度96%，恒臺(tái)縣金湖甲殼制品有限公司)；辣根過(guò)氧化物酶(生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；過(guò)氧化氫(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；羧基化多壁碳納米管(<50 nm，中科院成都有機(jī)化學(xué)研究所)。其它試劑均為分析純。

1.2 HRP-CTS/C-MWNTs/GCE的制備

稱取0.1 g殼聚糖放入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中溶解，再加入C-MWNTs在超聲波振蕩30 min使其完全分散。磁力攪拌器攪拌2 h，得到均勻的多壁碳納米管殼聚糖復(fù)合膜溶液。用移液槍移取復(fù)合膜溶液滴涂在干凈的玻碳電極表面，自然條件下晾干備用，在晾干的玻碳電極表面滴涂辣根過(guò)氧化物酶溶液，然后將制得的HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極放在冰箱中24 h晾干備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 C-MWNTs(a)、自由狀態(tài)下的HRP(b)與 HRP-CTS/C-MWNTs(c)的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of C-MWNTs(a),free state HRP(b) and HRP-CTS/C-MWNTs(c)

圖2 不同電極的循環(huán)伏安圖Fig.2 CV curves for different modified electrodesa：GCE;b：CTS/C-MWNTs/GC;c：HRP-CTS/C-MWNTs/GCE

圖1曲線a為羧基化多壁碳納米管(C-MWNTs)的紅外光譜，納米管表面引進(jìn)了羧基(1 641.7 cm-1)、羧基根基團(tuán)(1 400.7 cm-1)和羥基(1 111.3 cm-1)等官能團(tuán)。這些官能團(tuán)提供了一種穩(wěn)定的親水環(huán)境，同時(shí)保持酶的活性，為酶促反應(yīng)提供了穩(wěn)定的微環(huán)境。由曲線b和c可知：在CTS-C-MWNTs復(fù)合物膜上固定的HRP的酰胺峰(1 650.3 cm-1)和(1 750.7 cm-1)，與自由狀態(tài)下的HRP酰胺峰(1 650.3 cm-1)和(1 739.1 cm-1)相差較小，這說(shuō)明復(fù)合物膜修飾電極固定的HRP結(jié)構(gòu)性質(zhì)未發(fā)生改變。

2.2 MWNTs和CTS對(duì)HRP直接電子轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用

2.2.1 不同修飾電極的循環(huán)伏安圖 在PBS緩沖溶液(pH 6.98)，掃描速率80 mV/s的條件下，采用不同修飾電極對(duì)同一PBS緩沖溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(見(jiàn)圖2)?？捎^察到裸GCE電極在掃描電壓范圍內(nèi)未出現(xiàn)氧化還原峰，說(shuō)明裸GCE電極對(duì)PBS的催化作用不明顯(曲線a)。在GCE電極表面修飾上CTS-C-MWNTs復(fù)合膜后的循環(huán)伏安曲線，在電位-0.3 V附近出現(xiàn)氧化峰，但還原峰不明顯，說(shuō)明修飾上復(fù)合物膜之后的電極對(duì)PBS緩沖溶液的催化作用不明顯(曲線b)。而在電極表面修飾上復(fù)合物膜之后固定HRP(HRP-CTS/C-MWNTs/GCE)進(jìn)行掃描，可觀察到1對(duì)較為明顯的氧化還原峰(曲線c)，這對(duì)氧化還原峰是由HRP的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)產(chǎn)生，為HRP血紅素的輔基中氧化還原中心Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)的氧化還原峰，其峰電流也有了較大的提高，表明對(duì)電極進(jìn)行修飾可以提高電極的靈敏性。

圖3 pH 值對(duì)傳感器響應(yīng)電流的影響Fig.3 Effect of pH value on response current of electrode

圖4 不同修飾電極對(duì)H2O2測(cè)定的循環(huán)伏安曲線Fig.4 CVs of different modified electrodes to H2O2a.GCE;b.CTS/C-MWNTs/GCE;c.HRP-CTS/C-MWNTs/GCE

2.2.2 pH值對(duì)HRP-CTS/C-MWNTs/GCE測(cè)定的影響 在80 mV/s的掃描速率下，改變?nèi)芤簆H值，研究不同pH值對(duì)PBS緩沖溶液在電極上電化學(xué)行為的影響。結(jié)果顯示，pH值對(duì)PBS緩沖溶液在HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極的電化學(xué)行為影響較大，在pH值為6.98時(shí)有最大峰電流，pH值大于或小于6.98時(shí)，均會(huì)導(dǎo)致峰電流降低。這可能是因?yàn)槊傅幕钚源笮∨c酶所處的環(huán)境有關(guān)，實(shí)驗(yàn)選擇最佳pH值為6.98。

2.2.3 掃描速率對(duì)HRP-CTS/C-MWNTs/GCE測(cè)定的影響 取1/15 mol·L-1的PBS緩沖溶液(pH 6.98) 20 mL，在不同掃描速率下進(jìn)行測(cè)定，考察了掃描速率的影響。結(jié)果顯示，在不同的掃描速率條件下氧化電位幾乎無(wú)變化，說(shuō)明該電極的可逆性較好。隨著掃描速率的增大，氧化峰電流Ipa增大，且氧化峰電流與掃描速率(v,mV/s)呈線性關(guān)系，表明該過(guò)程主要受吸附控制，線性方程為Ipa=0.020 0v-0.347 5，相關(guān)系數(shù)(r)為0.971 4。

2.3 HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極

對(duì)H2O2催化性能的研究

2.3.1 不同修飾電極對(duì)H2O2催化性能的研究 由圖4可知，不同的修飾電極對(duì)測(cè)定10 mmol·L-1H2O2的靈敏度不同。裸GCE對(duì)H2O2底物幾乎無(wú)催化氧化作用(曲線a)；CTS/C-MWNTs/GCE的循環(huán)伏安曲線，雖然可以觀察到其對(duì)H2O2的催化作用，但無(wú)明顯的還原峰(曲線b)；而在HRP-CTS/C-MWNTs/GCE的循環(huán)伏安曲線上，可觀察到H2O2的還原電流明顯增大(曲線c)，表明修飾后電極對(duì)H2O2具有良好的電催化性能。2.3.2 底物濃度對(duì)酶修飾電極測(cè)定的影響 研究了底物濃度對(duì)HRP催化活性的影響，用HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極在pH 6.98，掃速80 mV/s的條件下對(duì)不同濃度的H2O2進(jìn)行測(cè)定(見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明，加底物H2O2后，修飾電極的氧化峰電流Ipa急劇減小，而還原峰電流Ipc急劇增大，這種還原峰電流的產(chǎn)生是由于HRP的催化還原H2O2引起，表明HRP對(duì)底物的性質(zhì)有一定的選擇性，且還原峰電流隨著H2O2的濃度增大而增大，在0.1～12 mmol·L-1范圍內(nèi)濃度與還原峰電流呈線性關(guān)系：Ipc=3.439 2×10-6c-1.177 1×10-6，r=0.998 6。由3倍信噪比計(jì)算出檢出限為0.05 mmol·L-1，達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流的95%所需時(shí)間約為16 s。

圖5 不同濃度的過(guò)氧化氫溶液在HRP-CTS/C-MWNTs/GCE上的循環(huán)伏安圖Fig.5 CVs of different concentration of H2O2at HRP-CTS/C-MWNTs/GCE concentration of H2O2(a-e):0,4,6,8,10 mmol/L;1/15 mol/L PBS buffer，pH 6.98;insert:fitting curve of biosensor for detecting H2O2

2.4 修飾電極的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

H2O2濃度為10 mmol/L，PBS濃度為1/15 mol/L，將HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極在pH 6.98緩沖液中連續(xù)循環(huán)掃描10圈后，其電流響應(yīng)信號(hào)仍能保持初始信號(hào)的90.6%，表明其重現(xiàn)性較好。而將此電極在PBS緩沖溶液中于4 ℃下冰箱中存放10 d，再次進(jìn)行測(cè)定，其電流響應(yīng)減小9.1%，表明修飾電極具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

分別取3份不同質(zhì)量的市售醫(yī)用H2O2配成50 mL待測(cè)液，以HRP-CTS/C-MWNTs/GCE生物傳感器為工作電極，采用循環(huán)伏安法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得雙氧水的平均含量為2.93%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與市售的醫(yī)用過(guò)氧化氫含量3%(標(biāo)簽值)比較接近。表明HRP-CTS/C-MWNTs/GCE可用于實(shí)際樣品中H2O2含量的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

研究了HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極的電催化性能，同時(shí)對(duì)催化機(jī)理進(jìn)行了探討;用修飾電極測(cè)定PBS或H2O2溶液時(shí)均出現(xiàn)1對(duì)較為明顯的氧化還原峰，表明HRP-CTS/C-MWNTs/GCE生物傳感器很大地提高了催化效率。在pH 6.98，PBS緩沖溶液中HRP-CTS/C-MWNTs/GCE電極對(duì)H2O2具有良好的電催性能，并能準(zhǔn)確、快速檢測(cè)市售醫(yī)用雙氧水的含量。

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Application of Chitosan-Carboxylic Multi-walled Carbon Nanotubes(HRP-CTS/C-MWNTs/GCE) Electrochemical Sensor in H2O2Detection

ZHANG Jun-li*，LI Rui-ling，PAN Qing-cai

(The College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Huanghuai University，Zhumadian 463000，China)

The horseradish peroxidase(HRP) was fixed on the surface of glassy carbon electrode(GCE) modified by chitosan(CTS)-carboxylic multi-walled carbon nanotubes(MWNTs).The modified electrode thus prepared was named abbreviately as HRP-CTS/C-MWNTs/GCE.The HRP imbedded in the complex was characterized by fourier transform infrared spectrometry.The result indicated that its composition had no change.The electrochemical property of HRP-CTS/C-MWNTs/GCE was studied by cyclic voltammetry.It was found that the modified electrode exhibited an excellent electrocatalytic response toward the reduction of H2O2.In 1/15 mol·L-1PBS(pH 6.98) buffer solution， a pair of redox peaks were observed,and a good linear relationship(r=0.998 6) between values of reduction peak current and H2O2concentration was obtained in the range of 0.1-12 mmol·L-1.The method was applied in the detection of hydrogen peroxide the commercially available medical hydrogen peroxide，with content of 2.93%.

chitosan;carboxylic carbon nanotube;horseradish peroxidase;electrochemical sensor;hydrogen peroxide

2016-03-30；

2016-07-04

河南省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(132300410312);駐馬店市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(13604)；河南省教育科學(xué)規(guī)劃課題資助項(xiàng)目([2012]-JKGHAD-0249)；黃淮學(xué)院青年骨干教師資助計(jì)劃資助項(xiàng)目

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.024

O657.1；O625.524

A

1004-4957(2016)10-1351-04

*通訊作者：張軍麗，碩士，研究方向：殼聚糖及衍生物的合成及應(yīng)用，Tel：0396-2853661，E-mail：zjl529@126.com