李曉晶，于 鴻，楊 蓉，甘平勝，劉 苗，黎志峰

(廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510440)

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超聲輔助分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)水中多種磺胺類抗生素殘留

李曉晶*，于 鴻，楊 蓉，甘平勝，劉 苗，黎志峰

(廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510440)

建立了水中13種磺胺類抗生素的超聲輔助分散液液微萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UA-DLLME/UPLC-MS/MS)測(cè)定方法。以乙腈為分散劑，四氯乙烷為萃取劑，通過超聲分散方式協(xié)同萃取水樣中的目標(biāo)化合物，采用C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)分離，以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，采用UPLC-MS/MS多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)測(cè)定。優(yōu)化了萃取劑和分散劑的類型和用量、萃取時(shí)間、氯化鈉濃度和pH值等條件。在優(yōu)化條件下，13種磺胺類抗生素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998，方法檢出限(S/N=3)為0.6～2.4 ng/L；3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為80.3%～101.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為0.7%～4.5%。該方法前處理簡(jiǎn)單、環(huán)保、靈敏，適用于水樣中多種磺胺類抗生素的測(cè)定。

超聲輔助分散液液微萃??；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；磺胺類抗生素；水樣

磺胺類藥物是應(yīng)用最廣、用量最大的一類廣譜抑菌藥，主要用于畜牧養(yǎng)殖，預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病。使用后的藥物可通過未經(jīng)處理的農(nóng)業(yè)廢水、養(yǎng)殖廢水和生活污水的直接排放，以及通過養(yǎng)殖場(chǎng)排放的糞便以填埋、施肥等方式進(jìn)入到土壤環(huán)境中，最后經(jīng)地表徑流與滲濾污染地下水和人類飲用水水源。毒理學(xué)研究表明，這些藥物可能會(huì)引起耐藥性，具有潛在的致癌作用，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害[1]。目前，磺胺類藥物的前處理方法主要采用液液萃取[2-3]、固相萃取[4-6]、微波萃取[7]、固相微萃取[8-9]等。然而這些技術(shù)存在操作冗繁、萃取時(shí)間長(zhǎng)、使用大量有毒溶劑等缺點(diǎn)。將上述萃取技術(shù)微型化，建立不用或少用有毒有機(jī)溶劑、成本低、操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣的樣品前處理技術(shù)檢測(cè)方法一直是研究者努力的方向。

近些年，分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)因具有所需萃取溶劑用量小、萃取速度快、萃取效率和富集倍數(shù)高、操作簡(jiǎn)便、消耗低和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已發(fā)展成為一種極具潛力的分離富集技術(shù)[10-13]。目前，關(guān)于水中磺胺類抗生素的液液微萃取鮮有報(bào)道[14-15]，這些報(bào)道檢測(cè)的磺胺種類少且檢測(cè)方法主要為傳統(tǒng)的高效液相色譜法。采用DLLME 并加以超聲輔助(Ultrasound-assisted，UA) 對(duì)樣品進(jìn)行富集濃縮前處理，加速了不互溶的兩相之間的質(zhì)量傳遞，可在最小的溶劑使用量和最短的時(shí)間內(nèi)快速提高萃取效率。目前未見將超聲輔助液液微萃取(UA-DLLME)技術(shù)應(yīng)用于多種磺胺類抗生素檢測(cè)的研究。本文采用UA-DLLME技術(shù)對(duì)水體中13種磺胺類抗生素進(jìn)行提取，采用高靈敏度、高選擇性的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。該方法快速、高效、環(huán)保，可同時(shí)進(jìn)行水樣中多種磺胺類抗生素的檢測(cè)和確證分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity UPLCTMXevoTMTQ-S型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司，配電噴霧離子源)、自動(dòng)Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)、TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科技儀器廠)、超聲儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)、精密電子天平(德國Sartorius公司)、氮吹儀(美國Organomation公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3 樣品前處理

移取5.00 mL水樣于10 mL離心管中，加入0.1 g 氯化鈉，振蕩溶解，將 1.00 mL乙腈(分散劑)和150 μL四氯乙烷(萃取劑)混合液用 1 mL 玻璃注射器迅速注入上述溶液中，形成水/四氯乙烷/乙腈乳濁體系，超聲輔助萃取5 min后，以4 000 r/min 離心5 min。棄去上層液體，用微量進(jìn)樣器抽取一定體積沉淀相，氮?dú)獯蹈?，用乙?水(2∶8)溶解并定容至0.5 L，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：Waters ACQUITYTMUPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%A，0.5～7.0 min，95%～5% A，7.0～7.01 min，5%～95%A，7.01～7.5 min，95%A；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流速0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，采用正離子模式；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150 ℃；去溶劑氣流量：650 L/h；去溶劑氣溫度：450 ℃；錐孔反吹氣流量：150 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；各磺胺類抗生素的監(jiān)測(cè)離子對(duì)(m/z)及錐孔電壓、碰撞能量參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)物的串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

﹡quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取劑的選擇

萃取劑的選擇對(duì)萃取效率以及富集倍數(shù)起著重要作用。通常萃取劑的選擇需滿足：密度比水大；對(duì)待測(cè)物有較好的萃取效果；在水中溶解度??；能形成穩(wěn)定的兩相系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)選擇5種萃取劑(二氯甲烷、四氯化碳、四氯乙烷、四氯乙烯和三氯甲烷) 進(jìn)行比較，移取磺胺類抗生素混標(biāo)儲(chǔ)備液于5.0 mL水中，制得含磺胺類抗生素的模擬水樣。采用100 μL萃取劑和1.0 mL乙腈為分散劑的萃取混合液，按照“1.3”方法進(jìn)行處理。結(jié)果表明：四氯乙烷對(duì)絕大部分磺胺類抗生素具有很好的萃取效率，其次是二氯甲烷，而四氯化碳和四氯乙烯的萃取效率較低(見圖1)。可能是由于四氯化碳和四氯乙烯屬于非極性溶劑，而四氯乙烷和二氯甲烷的極性較大，根據(jù)相似相溶原理，磺胺類抗生素屬于極性化合物易溶于極性有機(jī)溶劑。因此，實(shí)驗(yàn)選擇四氯乙烷為萃取劑。

圖1 不同萃取劑對(duì)萃取回收率的影響Fig.1 Effect of various extraction agents on extraction recoveries

2.2 萃取劑體積的選擇

分別以含不同體積的四氯乙烷(50，100，120，150，180 μL)和1.0 mL乙腈為萃取混合液，按照“1.3”方法進(jìn)行萃取，結(jié)果表明，磺胺類抗生素的萃取回收率隨著四氯乙烷體積的增加而增加，當(dāng)體積達(dá)150 μL時(shí)大部分目標(biāo)物的回收率最大，繼續(xù)增大四氯乙烷的體積至180 μL，磺胺類抗生素的回收率反而降低。因此，最終選擇萃取體積為150 μL。

2.3 分散劑的選擇

分散劑的類型也是影響萃取效率的關(guān)鍵因素，通常要求分散劑在萃取溶劑中有良好的溶解性能并能與水互溶，使萃取溶劑在水相中分散成細(xì)小的液滴，增大其與待測(cè)物的接觸面積，從而提高萃取效率。分別考察了甲醇、乙腈和丙酮為萃取劑時(shí)的萃取效率。配制一定濃度的含磺胺類抗生素殘留的水樣，分別采用1.0 mL 上述3種分散劑(均含有150 μL四氯乙烷)按照“1.3”方法進(jìn)行萃取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈的萃取效率最高，其次是丙酮，而甲醇的萃取效率最低，最終選擇乙腈作為分散劑。

2.4 分散劑體積的影響

分散劑乙腈的體積直接影響“水/乙腈/四氯乙烷乳濁液”體系的形成，并導(dǎo)致萃取劑在水中的分散程度發(fā)生改變而影響萃取效率。本實(shí)驗(yàn)考察了不同體積(0.5，1.0，1.5，2.0 mL)的乙腈對(duì)液液微萃取的影響。結(jié)果表明，萃取率先隨乙腈體積的增加而增加，在1.0 mL時(shí)達(dá)到最大值，此后則隨乙腈體積的增加而減小。這是因?yàn)橐译骟w積小時(shí)，萃取劑未能均勻分散在水相中，導(dǎo)致萃取效率低。當(dāng)乙腈體積過大時(shí)，待測(cè)物在水中的溶解度加大，導(dǎo)致萃取效率降低，因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈的最佳體積為1.0 mL。

2.5 鹽加入量與pH值的影響

在水樣中加入氯化鈉，可改變水溶液中的離子強(qiáng)度，產(chǎn)生一定的鹽析效應(yīng)，有利于萃取效率的提高。本實(shí)驗(yàn)考察了氯化鈉的用量分別為0，0.01，0.02，0.04，0.10 g/mL時(shí)13種磺胺類抗生素的萃取效率，以5 mL取樣量計(jì)，則氯化鈉的添加量分別為0，0.05，0.10，0.20，0.50 g。結(jié)果表明，隨著氯化鈉加入量的增加，磺胺類抗生素的萃取回收率逐漸提高；當(dāng)氯化鈉添加量為0.10 g(0.02 g/mL)時(shí)萃取回收率最大；繼續(xù)增加氯化鈉用量，回收率反而減小。因此實(shí)驗(yàn)選擇氯化鈉的用量為0.02 g/mL。溶液的pH值也會(huì)影響磺胺類抗生素的萃取效率，由于磺胺類藥物在酸性或堿性的溶液中有較大溶解度，從而導(dǎo)致萃取效率不高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇在中性條件下對(duì)其進(jìn)行萃取。

2.6 超聲時(shí)間的影響

利用超聲對(duì)DLLME進(jìn)行輔助，能夠加速不互溶兩相之間的質(zhì)量傳遞，使得萃取效率在最小的溶劑用量和最短的時(shí)間內(nèi)得到快速提高。分別選取超聲時(shí)間為0，5，10，15 min進(jìn)行萃取，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)5 min時(shí)萃取效率較高，繼續(xù)增加萃取時(shí)間，回收率無明顯變化，當(dāng)萃取時(shí)間大于10 min后，萃取回收率反而減小。這可能是因?yàn)槌曔^程中產(chǎn)生的熱量使得磺胺類抗生素重新溶解回水相，導(dǎo)致萃取量下降。因此，實(shí)驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為5 min。

2.7 線性方程、檢出限、準(zhǔn)確度及精密度

在優(yōu)化條件下，分別對(duì)系列濃度磺胺類抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以磺胺類抗生素的色譜峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x，μg/L) 進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，13種磺胺類抗生素在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998，以3倍信噪比(S/N=3) 計(jì)算儀器檢出限(LOD) 為0.6～2.4 ng/L，以S/N=10計(jì)算得到方法的定量下限(LOQ)為2.0～7.9 ng/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.8 回收率與精密度

選取陰性水樣，分別添加3個(gè)濃度水平的磺胺類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后，按照“1.3”方法進(jìn)行前處理和色譜檢測(cè)，每個(gè)濃度水平平行測(cè)定5次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表3)。結(jié)果顯示，13種磺胺類抗生素在3個(gè)加標(biāo)水平下，平均回收率為80.3%～101.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=5)為0.7%～4.5%，方法能夠滿足水樣中多種磺胺類抗生素的測(cè)定要求。圖2為陰性水樣在低加標(biāo)水平的MRM圖。

表2 13種磺胺類藥物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限

圖2 空白水樣中加入13種磺胺類抗生素的MRM圖

AnalyteSpiked(μg/L)Found(μg/L)Averagerecovery(%)RSD(%)SPP115，460，230107，423，206930，920，89619，28，17SDM158，630，315139，561，285880，890，90526，30，45SDM′0595，238，1190560，210，110941，882，92416，13，25SQX108，434，2170970，369，179898，850，82509，14，23SCP165，660，330168，648，2971018，982，90024，31，36SPZ115，460，230106，415，211922，902，91717，13，08SMM0785，314，1570640，252，133815，803，84723，27，29SBZ110，440，220107，406，224973，923，101831，15，24SSX142，566，283133，488，256937，862，90527，14，07

(續(xù)表3)

AnalyteSpiked(μg/L)Found(μg/L)Averagerecovery(%)RSD(%)SMZ145，580，290134，501，274924，864，94514，16，24SMP118，474，2370995，381，193843，804，81435，42，27SM2′151，602，301126，491，242834，816，80421，17，32SM2188，752，376175，678，331931，902，88016，23，35

圖3 水樣中檢出SDM′的MRM圖Fig.3 MRM chromatogram of SDM′ in water sample

2.9 實(shí)際水樣的測(cè)定

采用本方法對(duì)5份自來水、2份某養(yǎng)豬場(chǎng)污水、1份養(yǎng)魚池塘水進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，2份養(yǎng)豬場(chǎng)水樣中均檢出SDM′(濃度分別為120 ng/L和270 ng/L)，1份池塘水樣中檢出SM2(濃度為19.2 ng/L)，5份自來水中均未檢出13種磺胺類抗生素殘留。養(yǎng)豬場(chǎng)水樣中檢出SDM′的MRM圖見圖3。

3 結(jié) 論

本文所建立的UA-DLLME-UPLC-MS/MS法具有操作簡(jiǎn)便、萃取速度快、萃取效率和富集倍數(shù)高 、試劑消耗量少、重現(xiàn)性好、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)際水樣中多種磺胺類抗生素的測(cè)定，具有一定的實(shí)用參考價(jià)值。

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Determination of 13 Sulfonamide Residues in Water by Ultrasound-assisted Dispersive Liquid-Liquid Microextraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

LI Xiao-jing*，YU Hong，YANG Rong，GAN Ping-sheng，LIU Miao，LI Zhi-feng

(Guangzhou Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou 510440，China)

A simple and rapid method was established for the preconcentration and determination of 13 sulfonamide residues in water samples by ultrasonic-assisted dispersive liquid-liquid microextraction(UA-DLLME) coupled with ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS)．The target compounds in water samples were synergistically extracted in ultrasonic dispersed mode and separated on a C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm) column with acetonitrile-0.1% formic acid solution as mobile phase，and determined by UPLC-MS/MS under multiple reactions monitoring(MRM) mode．The kind and dosage of extraction agent and dispersing agent，extraction time，dosage of sodium chloride and pH conditions were optimized．Under the optimized conditions，the calibration curves of 13 sulfonamides were linear in the certain concentration range with correlation coefficients greater than 0.998.The detection limits of the method(S/N=3) were between 0.6 ng/L and 2.4 ng/L.The average recoveries of sulfonamides at three spiked levels in water sample ranged from 80.3%to 101.8%with relative standard deviations(RSD，n=5) of 0.7%-4.5%.The developed method was simple，environment-friendly and sensitive,and was suitable for the determination of multiple sulfonamide residues in water.

ultrasonic-assisted dispersive liquid-liquid microextraction(UA-DLLME)；ultra performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole mass spectrometry(UPLC-MS/MS)；sulfonamide；water

2016-03-25；

2016-04-13

廣東省醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目(B2015095)；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(20151A011052)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.006

O657.63；S816.73

A

1004-4957(2016)10-1255-06

*通訊作者：李曉晶，碩士，副主任技師，研究方向：食品安全、儀器分析，Tel:020-36545120，E-mail:saiint@163.com