劉 蕓，丁 濤*，吳 斌，張 睿，沈崇鈺，費(fèi)曉慶，張闊海，劉建紅，鄧曉軍，郭德華

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001；2.北京同仁堂蜂業(yè)有限公司，北京 102400；3.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200000)

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核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法用于蜂蜜的摻假鑒別

劉 蕓1，丁 濤1*，吳 斌1，張 睿1，沈崇鈺1，費(fèi)曉慶1，張闊海2，劉建紅2，鄧曉軍3，郭德華3

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 南京 210001；2.北京同仁堂蜂業(yè)有限公司，北京 102400；3.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200000)

采用核磁共振技術(shù)(NMR)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析手段研究了真蜂蜜和摻假蜂蜜的指紋圖譜變化情況。采用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)和有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析方法從核磁信號中提取各組的分類信息。結(jié)果表明：建立的OPLS-DA模型能夠區(qū)分真假蜂蜜，所建模型對蜂蜜真假判別的解釋能力為90.5%，對未知樣本的預(yù)測能力為75.5%、識別率為89.7%。置換測試驗(yàn)證表明，化學(xué)計(jì)量學(xué)模型具有很好的穩(wěn)定性和預(yù)測性，可信賴性強(qiáng)，且模型穩(wěn)健。通過OPLS-DA模型的載荷圖和相關(guān)系數(shù)分析找到了對區(qū)分摻假蜂蜜有顯著作用的標(biāo)志物。結(jié)合相關(guān)系數(shù)分析，建立了辨別真假蜂蜜的多元線性回歸方程。該方法可簡單、快速地用于未知蜂蜜的摻假鑒別，為規(guī)范蜂蜜市場提供有利的依據(jù)。

核磁共振技術(shù)；化學(xué)計(jì)量學(xué)方法；模式識別技術(shù)；蜂蜜摻假

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜味物質(zhì)，是一種營養(yǎng)豐富的天然滋養(yǎng)食物[1]。其主要成分為糖類，其中60%～80%是人體易吸收的葡萄糖和果糖。此外，還含有與人體血清濃度相近的多種無機(jī)鹽、維生素、有機(jī)酸及有益人體健康的微量元素和多種氨基酸，并含有生物活性很強(qiáng)的蔗糖轉(zhuǎn)化酶和淀粉酶等[2]，具有極高的保健作用和營養(yǎng)價(jià)值，深受消費(fèi)者的喜愛。我國蜂蜜國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不得在蜂蜜中添加或混入任何淀粉類、糖類或代糖類物質(zhì)[3]。近年來，國內(nèi)和國際市場對蜂蜜的需求量不斷增加，然而蜂蜜的產(chǎn)量難以滿足市場需求[4-6]。在巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，不法分子在高品質(zhì)蜂蜜中加入其它低品質(zhì)的蜂蜜以次充好，或者在蜂蜜中摻入果葡糖漿等甜味物質(zhì)以假亂真，影響了蜂蜜產(chǎn)品的市場秩序和我國蜂蜜產(chǎn)品的出口貿(mào)易。蜂蜜檢測技術(shù)遇到了很大的挑戰(zhàn)。

如何鑒別蜂蜜的摻假問題，成為人們普遍關(guān)心的問題。目前，國家制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對蜂蜜摻假進(jìn)行有效判斷，以保障消費(fèi)者合法權(quán)益。薄層色譜(TLC)是測定高果淀粉糖漿的有效方法[7]。通過高效液相色譜示差折光法測定蜂蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的含量，可以判斷蜂蜜中糖是否符合國家標(biāo)準(zhǔn)[8]，該法可檢測蜂蜜中摻雜的麥芽糖漿，而對于摻雜果葡糖漿的蜂蜜，該方法無效。碳同位素質(zhì)譜法可以有效鑒定天然蜂蜜產(chǎn)品中是否摻入碳4 植物的糖漿[9-10]，但該方法只能用于證明摻雜物超過7%的蜂蜜，而對于蜂蜜摻入利用水稻、小麥、大豆等碳3 植物淀粉制備的糖漿則無法辨別其真?zhèn)蝃11]。目前這些現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)對蜂蜜摻假檢測的主要原理是對蜂蜜中某一種或某一類物質(zhì)進(jìn)行分析。但造假者若根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)指標(biāo)要求進(jìn)行調(diào)配，摻入后各項(xiàng)理化檢測指標(biāo)可完全符合國家標(biāo)準(zhǔn)，這樣很難和真正的蜂蜜進(jìn)行區(qū)分。已有的檢測方法多針對已有的摻假造假技術(shù)而開發(fā)，必然落后于造假摻假技術(shù)的發(fā)展。現(xiàn)有檢測手段自身的不足和缺陷給不法分子提供了蜂蜜摻假的可乘之機(jī)。綜上所述，開發(fā)出多指標(biāo)多組分鑒別蜂蜜真?zhèn)蔚姆椒ㄆ仍诿冀蕖?/p>

核磁共振技術(shù)(NMR)能夠無損地檢測含量在檢出限內(nèi)的所有小分子化合物，在特定的條件下對樣品中所含各化合物的檢測靈敏度相同[12]，是一種無偏向性分析手段。核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法已運(yùn)用于蜂蜜和其它食品分析[13]。Boffo等[14]通過1H NMR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法區(qū)分了巴西蜂蜜的原產(chǎn)地，且明確了對分類起關(guān)鍵作用的核磁信號。野生蜂蜜含有高濃度的苯丙氨酸和酪氨酸，摻假的蜂蜜核磁譜中有5-HMF、檸檬酸和乙醇的信號。該研究分別選用近鄰分類算法(KNN)和有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)算法建立蜂蜜的分類模型，對蜂蜜分類的正確率分別為66.7%和72.2%。Ribeiro等[15]運(yùn)用LF-1H NMR建立了80個蜂蜜樣品的物理化學(xué)參數(shù)與弛豫時間的關(guān)系，弛豫時間T1和T2分別在0.6～1.8 ms和2.3～5.4 ms之間。結(jié)果表明，弛豫時間可用來區(qū)分不同類型的蜂蜜。Ribeiro等[16]運(yùn)用LF-1H NMR建立了蜂蜜中摻入高果淀粉糖漿的鑒定方法，所有樣品的橫向弛豫時間和縱向弛豫時間分別在1.26～1.60 ms和3.33～7.38 ms范圍內(nèi)，且在摻假蜂蜜中，隨著高果淀粉糖漿含量的增加，弛豫時間也增加。Simova等[17]基于NMR技術(shù)建立了快速區(qū)分橡樹蜂蜜與其它蜂蜜的方法，結(jié)合氫譜和碳譜的信息，確定了槲皮醇的結(jié)構(gòu)，所有的橡樹蜂蜜都含有該標(biāo)志物，而其它類型的蜂蜜則不存在。Sandusky等[18]運(yùn)用選擇性的TOCSY方法測定蜂蜜中微量的氨基酸，結(jié)合多維數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法能夠區(qū)分不同產(chǎn)地的蜂蜜，與傳統(tǒng)分析方法相比，更為靈敏、快速，能夠明確化合物的結(jié)構(gòu)。由于蜂蜜具有成分復(fù)雜，且不同地域蜂蜜的內(nèi)部組分含量變化范圍大等特點(diǎn)，以上所建立的方法對我國蜂蜜是否適用還不得而知，而且目前國內(nèi)尚無運(yùn)用NMR技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法判斷蜂蜜真?zhèn)蔚姆椒▓?bào)道。本研究采用核磁共振技術(shù)對蜂蜜中多組分進(jìn)行分析，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，以期能夠從獲得的多核磁信號中提取出對摻假蜂蜜有顯著性影響的標(biāo)記物，從而為蜂蜜真?zhèn)闻袆e提供切實(shí)可行的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Advance 400 M型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)，5 mm雙核z-梯度探頭及Topspin 2.3 試驗(yàn)控制及數(shù)據(jù)處理軟件；5 mm核磁共振樣品管(美國Norell公司)；高速離心機(jī)(德國Sigma公司)；XW-80A型渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；LP403分析天平(德國賽多利斯公司)。

溶劑：重水(D2O，氘帶度為99.8% ，Cambrideg Isotope Laboratories公司)；3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉(純度大于99.9%)、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉(優(yōu)級純)購于Aldich-Sigma公司；NaN3(分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠)。

1.2 蜂蜜樣品信息

61個蜂蜜樣品包括：楊槐蜜、油菜蜜、椴樹蜜、荊條蜜、紫云英蜜、荔枝蜜、龍眼蜜、棗花蜜、枸杞蜜、葵花蜜、黃芪蜜、益母草蜜、枇杷蜜、黨參蜜、小茴香蜜和雜花蜜；蜂蜜的加工工藝包括脫水、脫色、脫抗生素；蜂蜜的產(chǎn)地包括：江蘇、河南、新疆、四川、內(nèi)蒙、湖北、遼寧、吉林、陜西、山東、甘肅；所有的蜂蜜樣品經(jīng)實(shí)驗(yàn)室摻假檢測后指標(biāo)均合格。糖漿樣品包括甜菜糖漿、大米糖漿、木薯糖漿、小麥糖漿、果葡糖漿或其混合糖漿，其加工工藝及儲存時間有詳細(xì)記錄；摻假蜂蜜樣品主要來自市場上銷售的經(jīng)實(shí)驗(yàn)室摻假指標(biāo)檢驗(yàn)合格樣品、糖漿樣品和蜂蜜樣品的任意比例混合；糖漿及摻假蜂蜜樣本總數(shù)共82個。

1.3 樣品制備

對無結(jié)晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過60 ℃的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5 kg作為試樣。將制備好的試樣置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，于室溫下保存。

1.4 樣品前處理及數(shù)據(jù)采集過程

蜂蜜樣品經(jīng)0.10～0.14 mm孔徑尼龍濾布過濾除去蜂蜜中的固體雜質(zhì)后，準(zhǔn)確稱取0.25 g樣品于離心管中，加入1 mL 重水，溶解完全；加入200 μL濃度為1.5 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 4.0)和100 μL含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋振蕩3 min至均勻混合，離心10 min，取上清液于核磁管中。每個樣品制備2份以供測定分析。

所有真蜂蜜和摻假蜂蜜樣品按隨機(jī)順序進(jìn)樣分析以避免在分析過程中可能產(chǎn)生的儀器誤差。為了抑制蜂蜜中水的共振信號，所有蜂蜜樣本的1H NMR分析均采用noesypr1d脈沖序列。在400 MHz核磁共振波譜儀上進(jìn)行1H NMR測試，實(shí)驗(yàn)溫度為298 K，利用D2O進(jìn)行鎖場，采用預(yù)飽和方法壓制水峰；其中在Topspin軟件中各參數(shù)設(shè)置如下：PULPROG=noesypr1 d,AQ_mod=DQD,TD=32 K,NS=8*N,DS=4,TD0=1,SW=6 000 Hz,D1=3 s,DE=4 μs,D8=0.1 s,信號累加240次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

對得到的一維1H NMR譜圖進(jìn)行基線校正和相位校正?；€校正選擇polynomial fit擬合方式，相校正選擇global和metabonomics算法先自動優(yōu)化，后針對特定區(qū)域進(jìn)行手動校正，使盡可能多的積分值為正值。為消除殘留水信號和內(nèi)標(biāo)物信號對分析結(jié)果的影響，其中，蜂蜜1H NMR譜參照3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉定標(biāo)，化學(xué)位移定為δ= 0.000 ppm，將1H NMR譜中化學(xué)位移在δH4.69 ～ 5.20 區(qū)間的數(shù)據(jù)和內(nèi)標(biāo)物信號在δH0.00 ～0.10之間的數(shù)據(jù)從數(shù)據(jù)矩陣中剔除。按每段寬度δ為0.02 ppm進(jìn)行分段積分，共得到470段積分?jǐn)?shù)據(jù)。積分后的核磁數(shù)據(jù)峰面積在不同組分之間和不同樣品之間的差異較大。為了減小這些差異的影響，按每張核磁譜的總積分強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，原始數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)據(jù)歸一化處理后，各積分處于同一數(shù)量級，適合進(jìn)行綜合對比評價(jià)，所得積分?jǐn)?shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換為Excel文件保存。在數(shù)據(jù)集中，行代表某一化學(xué)位移區(qū)間的峰面積，列為樣本的種類。將數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P 12.0 軟件(Umetrics AB，Ume?，Sweden)進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

圖1 正常蜂蜜(A)、摻假蜂蜜(B)和大米糖漿(C)的1H NMR譜(D2O,400 MHz)Fig.1 Representative 400 MHz 1H NMR spectra from pure honey(A)，adulterated honey(B) and rice syrup sample(C)

2.11H NMR代謝指紋圖譜

利用Topspin 2.3軟件對樣品的核磁共振信號進(jìn)行傅立葉變換，得出蜂蜜樣品、摻假蜂蜜和糖漿樣品典型的1H NMR指紋圖譜(如圖1)。由圖1可見，通過典型的指紋圖譜很難直觀地看出純天然蜂蜜和摻假蜂蜜之間的顯著性差異譜峰，因此，必須對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，以從細(xì)微的差別中提取出對天然蜂蜜和摻假蜂蜜顯著的生物標(biāo)志物。

首先對方法學(xué)進(jìn)行考察，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。日內(nèi)精密度考察結(jié)果顯示，選取響應(yīng)值較大的前5個峰積分，其峰面積和對應(yīng)化學(xué)位移的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n= 6)分別為0.39%～2.12%和0.25%～0.80%?；贜MR方法的蜂蜜樣品的穩(wěn)定性結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)過程中，蜂蜜在4 ℃冰箱條件下存儲5 d，共有峰的峰面積和化學(xué)位移的RSD(n= 6)分別為(4.25 ± 0.98)% 和(1.34 ± 0.67)%，表明在該核磁條件下，建立的指紋分析方法準(zhǔn)確、可靠。

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 觀察變量的選擇 在選擇觀察變量時，強(qiáng)烈界外的觀察變量由Hotelling'sT2Range算法得到。對于多維正常分布，所有樣本的T2值形成Hotelling'sT2Range圖。當(dāng)T2超過臨界值時(0.01作為置信區(qū)間)，該觀察變量被認(rèn)為是強(qiáng)烈的界外值，應(yīng)預(yù)以剔除(如圖2)。因此真蜂蜜組中剔除5個樣本，假蜂蜜組中剔除7個樣本，其余所有樣本用于下一步的模型建立。

2.2.2 主成分分析與偏最小二乘判別分析 從核磁指紋圖譜可見真蜂蜜、摻假蜂蜜及糖漿核磁信號的差異。然而僅從單一幾個信號的改變很難全面揭示摻假蜂蜜和真蜂蜜的差異。首先采用非監(jiān)督的主成分分析(PCA)方法對兩組蜂蜜樣品進(jìn)行分類，從PCA得分圖(圖3A)可以看到摻假蜂蜜和真蜂蜜樣品有明顯的分離趨勢，但存在過重合的現(xiàn)象，可能是摻假蜂蜜含有真蜂蜜的成分，與真蜂蜜的性質(zhì)有相似之處。而且，在樣品收集過程中，蜂蜜的蜜種、產(chǎn)地、成熟度等因素會影響分類的準(zhǔn)確性。為避免不必要的變量給樣品分類帶來較大的誤差和分析樣本間個體差異的影響，進(jìn)一步采用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)方法用于分類(如圖3B)，較PCA模型，PLS-DA模型中真假蜂蜜有了明顯的分離。為了提高分類和判別的準(zhǔn)確性，常采用正交信號濾噪技術(shù)(OSC)與PLS相結(jié)合，以除掉分類信息中包含的不相干影響因素，找到個體間更加細(xì)微的差異。因此，本研究又建立了正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)模型(如圖3C)，可觀察到兩組樣品分散在得分圖中的不同區(qū)域，獲得了更好的分類結(jié)果。

圖3 真假蜂蜜的模型得分圖

ModelParameterParCtrUVPCANoA444R2X(cum)083105880789Q2(cum)-0212-02980423Rra/%853816897PLS-DANoA656R2X(cum)062205010522R2Y(cum)081207670850Q2(cum)079806270709Rra/%828823758OPLS-DANoA755R2X(cum)068207890569R2Y(cum)090507970769Q2(cum)075507410785Rra/%897821856

aRr is the abbreviation of the reorganization rate(Rr為識別率的縮寫)；No.A denotes number of principle components calculated by cross validation(No.A為置換測試得到的主成分個數(shù))

圖4 OPLS-DA模型前兩個主成分置換200次對應(yīng)的模型驗(yàn)證圖Fig.4 Corresponding validate model plot from the OPLS-DA models based on 200 permutations test for the first two components

多元統(tǒng)計(jì)分析時需優(yōu)化數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，以確保所建立模型為最佳模型。常見的標(biāo)度化方法有中值標(biāo)度化(Mean-centred，Ctr)、自標(biāo)度化(Autoscaled，UV)和Parto variance(Par) 3種。Ctr更加注重分析數(shù)據(jù)波動部分，缺點(diǎn)是可能導(dǎo)致低含量的變量信息受到高含量信號的抑制[19]；UV可以消除由于含量差異導(dǎo)致的數(shù)據(jù)掩蓋，缺點(diǎn)是小峰的測量誤差被同步放大[20]；Par能夠削減較大數(shù)據(jù)的相對重要性，保持?jǐn)?shù)據(jù)集的部分完整性，缺點(diǎn)是造成變化相對較小的重要組分不能被選為標(biāo)記物[21]。3種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際分析中需要依據(jù)具體數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。在SIMCA-P中評價(jià)模型質(zhì)量的參數(shù)有R2X，R2Y和Q2Y，其中R2X和R2Y分別表示模型對X和Y矩陣的解釋能力，Q2Y表示模型的預(yù)測能力，R2和Q2越接近1則說明模型越穩(wěn)定可靠，一般情況下該值高于0.5即說明模型較好。

依據(jù)3個標(biāo)度化方法，對真假蜂蜜的核磁信息建立3個數(shù)學(xué)模型(PCA，PLS-DA和OPLS-DA)，具體的模型參數(shù)如表1所示。由此可見，Par作為標(biāo)度化方法所建模型的R2Y和Q2均較高，因此選擇Par作為建模前數(shù)據(jù)預(yù)處理的方法，選擇OPLS-DA作為真假蜂蜜分類的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型，所建模型對蜂蜜真假判別的解釋能力為90.5%，對未知樣本的預(yù)測能力為75.5%,識別率為89.7%。

2.2.3 模型有效性確定 為避免模型獲得分類的偶然性，采用置換測試(Permutation test)法對所建模型進(jìn)行驗(yàn)證。保持X變量不變，通過隨機(jī)置換Y變量的順序，觀察多個Y變量的順序隨機(jī)排列的模型與原始Y變量模型之間的差異。排列置換后，以得到的對Y變量順序隨機(jī)排列模型的R2值、Q2值與原始模型的R2值、Q2值之間作回歸曲線，以作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)。通常要求最右端原始鑒別模型的Q2值大于左邊任何一個Y變量隨機(jī)排列模型的Q2值。前兩個主成分置換200次對應(yīng)的模型驗(yàn)證圖如圖4所示。結(jié)果表明，建立的OPLS-DA模型的R2和Q2分別為0.670和-0.778 9，表明模型具有很好的穩(wěn)定性和預(yù)測性，且可信賴性強(qiáng)，模型穩(wěn)健。

2.2.4 標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn) 基于建立的OPLS-DA模型，采用模型的載荷圖來篩選區(qū)分真假蜂蜜潛在的生物標(biāo)記物。對不同組的樣本分類貢獻(xiàn)較大的代謝物質(zhì)通常是在載荷圖中遠(yuǎn)離中心原點(diǎn)的物質(zhì)，即離中心的距離越遠(yuǎn)，對分類的影響越大。如圖5A所示，離中心距離遠(yuǎn)的變量可能代表著潛在的生物標(biāo)記物。同時結(jié)合相關(guān)系數(shù)分析(圖5B)，可更直觀地反映出各變量對分類貢獻(xiàn)的大小，以相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.05為選擇依據(jù)。最終依次選取P130,P152,P297,P319,P357和P363對應(yīng)的核磁分段位移作為對真假蜂蜜分類影響最大的變量。這些變量可作為潛在的標(biāo)記物，然而目前對其結(jié)構(gòu)的解析存在困難，后續(xù)將針對這些標(biāo)記物開展結(jié)構(gòu)鑒定研究。

通過相關(guān)系數(shù)分析，得到各變量的因子相關(guān)性系數(shù)值。類別變量Y代表樣品的類型，將純蜂蜜樣品數(shù)值設(shè)定為“1”，將糖漿和摻假蜂蜜樣品的類型變量數(shù)值設(shè)為“0”，閾值設(shè)為0.5。據(jù)此，得到辨別真假蜂蜜判別函數(shù)的線性回歸方程為:Y=-0.062 90X1-0.074 38X2+0.089 85X3-0.091 60X4-0.078 96X5+0.078 28X6+0.859 5，式中Y表示真蜂蜜或假蜂蜜，X1,X2,X3,X4,X5和X6分別表示第130,152,297,319,357和363個分段積分的峰面積。對于未知樣品，分別提取上述6個核磁分段積分的峰面積，代入線性回歸方程，若Y值接近1±0.5，則判別為真蜂蜜，若Y值接近0±0.5，則判別為假蜂蜜。

3 結(jié) 論

本文建立了核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)模型鑒別蜂蜜真假的方法。針對現(xiàn)行的蜂蜜質(zhì)量檢測方法只關(guān)注一種或幾種成分的含量和變化，該方法首先建立了純蜂蜜和摻假蜂蜜的OPLS-DA模型，由置換測試方法對模型進(jìn)行可靠性驗(yàn)證，避免發(fā)生過擬合現(xiàn)象。OPLS-DA模型的載荷圖和相關(guān)系數(shù)分析用于蜂蜜摻假標(biāo)志物的篩查，并找到了相應(yīng)的核磁分段位移作為對真假蜂蜜分類影響最大的變量。基于找到的摻假標(biāo)志物，建立了辨別真假蜂蜜的多元線性回歸方程。該方法可簡單、快速地對未知蜂蜜進(jìn)行摻假鑒別，具有分析時間短、完整性強(qiáng)、專屬性好、可控性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)目前蜂蜜摻假鑒別方法存在的缺陷。本研究的實(shí)施對推動行業(yè)科技進(jìn)步、規(guī)范蜂產(chǎn)品市場、保障消費(fèi)者合法權(quán)益以及促進(jìn)我國蜂產(chǎn)品事業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

[1] EU-Council Council Directive 2001/110/EC of 20 December 2001 Relating to Honey.Off.J.Eur.Commun.,2002,47-52.[2] Janiszewska K,Aniolowska M,Nowakowski P.PolishJ.FoodNutrit.Sci.,2012,62(2):85-89.

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Identification of Honey Adulteration by Nuclear Magnetic Resonance Technology and Chemometrics Method

LIU Yun1，DING Tao1*，WU Bin1，ZHANG Rui1,SHEN Chong-yu1,FEI Xiao-qing1，ZHANG Kuo-hai2，LIU Jian-hong2，DENG Xiao-jun3，GUO De-hua3

(1.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China；2.Beijing Tongrentang Bee Industry Co.,Ltd.,Beijing 102400,China；3.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200000,China)

Currently existing national standards for honey adulteration are based on one type or certain types of compounds.Therefore,it is necessary to develop a multi-component and multi-index method to identify the honey adulteration.In this research,the changes of fingerprint between pure and adulterated honey were explored based on the NMR fingerprinting analysis and chemometrics method.Unsupervised method of principal component analysis(PCA),supervised method of partial least squares discriminant analysis(PLS-DA) and orthogonal-PLS-DA(OPLS-DA) were all used to extract the useful information from NMR signals.The results showed that OPLS-DA model could distinguish the adulterated honey from pure honey.The explanation abilities based on the OPLS-DA model was 90.5%.The prediction and recognition abilities were 75.5% and 89.7%，respectively.Through permutation test,the chemometric model showed good stability,accurate predictability and high reliability.Several significant markers were found to distinguish honey from the loading plot and correlation coefficient analysis of OPLS-DA model.Combined with the correlation coefficient analysis,multiple linear regression equation was established to distinguish the adulterated honey from pure honey.The proposed method was simple and sensitive.This method provided an effective approach to control the honey quality and detect the honey adulteration.

nuclear magnetic resonance technology(NMR)；chemometrics method；pattern recognition technology；honey adulteration

2016-03-09；

2016-05-21

江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃(2015KJ29，2016KJ05)；上海長三角科技合作項(xiàng)目(15395810100)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.005

O482.532；S896.1

A

1004-4957(2016)10-1248-07

*通訊作者：丁 濤，碩士，高級工程師，研究方向：食品安全分析與質(zhì)量控制，Tel:025-52345183，E-mail：dingt@jsciq.gov.cn