肖雪蓉，佘玉奇，張國改，吳 霞，馮毅凡

(廣東藥科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

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二苯基庚烷A干預(yù)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型甘油磷脂的UPLC-Q/TOF MS分析

肖雪蓉，佘玉奇，張國改，吳 霞，馮毅凡*

(廣東藥科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

對(duì)RAW264.7細(xì)胞在不同狀態(tài)(正常、炎癥、給藥)下的甘油磷脂成分進(jìn)行分析，尋找相關(guān)的潛在病理藥理標(biāo)志物，闡明二苯基庚烷A在抗炎過程中對(duì)甘油磷脂代謝的影響。實(shí)驗(yàn)分為空白組(C)、炎癥模型組(L)、二苯基庚烷A給藥組(D)和布洛芬給藥組(B，陽性對(duì)照藥組)4組?？瞻捉M和炎癥組給予新鮮培養(yǎng)基，給藥組分別給予新配含20 μg/mL二苯基庚烷A和100 μg/mL布洛芬的培養(yǎng)基，1 h后，炎癥模型組和給藥組按終濃度為0.5 μg/mL加入脂多糖(LPS)培養(yǎng)，24 h后，運(yùn)用修飾后的Bligh-Dyer方法提取不同狀態(tài)下RAW264.7細(xì)胞的甘油磷脂成分，并通過超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q/TOF MS)在正負(fù)離子模式下對(duì)甘油磷脂進(jìn)行一級(jí)(MS)和二級(jí)(MS/MS)質(zhì)譜分析。結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)、元素組成、數(shù)據(jù)庫比對(duì)等方法鑒定磷脂成分，再通過主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)以及t檢驗(yàn)篩選潛在的甘油磷脂生物標(biāo)志物。結(jié)果顯示，炎癥組與空白組比較得到27個(gè)潛在病理標(biāo)志物，二苯基庚烷A給藥組與炎癥組比較得到23個(gè)潛在藥理標(biāo)志物，布洛芬給藥組與炎癥組比較得到17個(gè)潛在藥理標(biāo)志物，主要包括磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(lysoPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysoPE)。研究表明二苯基庚烷A在抗炎過程中引起了甘油磷脂代謝的明顯變化，而這些代謝變化與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

炎癥；甘油磷脂；二苯基庚烷A；布洛芬；生物潛在標(biāo)志物；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF MS)

炎癥是機(jī)體對(duì)致炎因子的損傷所發(fā)生的一種以防御反應(yīng)為主的基本病理過程。在正常情況下，炎癥的發(fā)生可殺滅病原體、限制感染擴(kuò)散及修復(fù)組織損傷等。然而，過度的炎癥反應(yīng)會(huì)造成組織損傷，器官功能障礙等危害機(jī)體[1-2]。如動(dòng)脈粥樣硬化[3]、缺血/再灌注損傷[4]、支氣管哮喘[5]、糖尿病[6]、老年性癡呆[7]等均伴有炎癥的發(fā)生。因此，對(duì)炎癥機(jī)制的研究，對(duì)于各種炎癥性疾病的治療具有重要意義。

隨著脂質(zhì)組學(xué)的誕生，對(duì)炎癥機(jī)制的研究逐漸轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)層面。脂質(zhì)作為細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)成分具有廣泛的生物功能，如激活和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、維持電化學(xué)梯度和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等[8-9]。甘油磷脂作為脂質(zhì)中的主要成分以及花生四烯酸的前體物質(zhì)，其代謝紊亂也會(huì)導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[10]。然而，目前從磷脂方面探討藥物對(duì)發(fā)生炎癥的影響并不多見。

二苯基庚烷類是山姜屬植物的主要有效成分，藥理作用廣泛，包括抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化等[11]。有文獻(xiàn)證明二苯基庚烷A可通過抑制NF-κB活性進(jìn)而抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達(dá)，最終達(dá)到抗炎鎮(zhèn)痛的作用[12-13]。布洛芬是臨床上廣泛應(yīng)用的非甾體抗炎藥，其被認(rèn)為主要通過抑制COX-2的活性而產(chǎn)生抗炎機(jī)制[14-15]，然而，Manrique-Moreno等[16]也證明了布洛芬可與細(xì)胞膜上脂質(zhì)層反應(yīng)，從而影響細(xì)胞膜上的離子通道、受體和酶等。但是，對(duì)于二苯基庚烷A和布洛芬在抗炎過程中對(duì)甘油磷脂代謝的影響卻鮮見報(bào)道。

為闡明二苯基庚烷A在抗炎過程中對(duì)甘油磷脂代謝的影響，本文應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q/TOF MS)，分別對(duì)正常狀態(tài)、炎癥狀態(tài)、給藥狀態(tài)下RAW264.7細(xì)胞甘油磷脂成分進(jìn)行快速分析鑒定，利用PCA,PLS-DA,OPLS-DA以及t檢驗(yàn)等化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選出潛在的病理藥理標(biāo)志物，初步探討了二苯基庚烷A在抗炎過程中對(duì)甘油磷脂代謝的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-Q/TOF MS液質(zhì)聯(lián)用儀和UPLC BEH-C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)均為美國Waters公司產(chǎn)品；-86 ℃超低溫冰箱(中科美菱公司)；HF90CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-1FD超凈臺(tái)(蘇凈安泰)；顯微鏡。

高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；雙抗(北京康貝源科技有限責(zé)任公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone公司)；甲醇(色譜純，CNW公司)；乙腈(色譜純，CMY公司)；異丙醇(色譜純，Merk公司)；乙酸(色譜純，Aladdin公司)；醋酸銨、氯仿(分析純)；二苯基庚烷A(本課題組前期分離純化獲得)；布洛芬、脂多糖(LPS)、亮氨酸腦啡肽(Sigma公司)；甘油磷脂標(biāo)準(zhǔn)品：PC(16∶0/18∶1)，PC(16∶0/0∶0)，PE(18∶0/0∶0)，PC(18∶1/0∶0)(Avanti polar lipids公司)。

1.2 溶液的配制

含二苯基庚烷A或布洛芬培養(yǎng)基的配制：精密稱取適量二苯基庚烷A和布洛芬粉末，移取少量DMSO溶解，加入空白培養(yǎng)基，配制成1 mg/mL的含藥培養(yǎng)基母液。精密移取適量含藥培養(yǎng)基母液，加空白培養(yǎng)基配制成濃度為20 μg/mL的二苯基庚烷A培養(yǎng)基以及100 μg/mL的布洛芬培養(yǎng)基(DMSO不超過藥物培養(yǎng)基總體積的0.1%)。

LPS的配制：精密移取1 mL PBS加入裝有1 mg LPS的棕色玻璃瓶中，超聲溶解混勻，完全轉(zhuǎn)移至50 mL無菌離心管中，加入39 mL PBS，超聲混勻，即配成25 μg/mL的LPS母液，用Eppendorf管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

磷脂標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：精密稱取各甘油磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配成10 μg/mL的溶液，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中備用。

1.3 細(xì)胞樣品的制備

本實(shí)驗(yàn)分為空白組(C)、炎癥模型組(L)、二苯基庚烷A給藥組(D)和布洛芬給藥組(B，陽性對(duì)照藥組)，共4組，每組6個(gè)平行樣。以2×106/皿將細(xì)胞接種至60 mm培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后進(jìn)行換液，給藥組分別更換為新配含20 μg/mL的二苯基庚烷A以及100 μg/mL的布洛芬培養(yǎng)基，對(duì)照組及炎癥模型組更換為新鮮的空白培養(yǎng)基(含與給藥組等量的DMSO)，藥物干預(yù)1 h后，炎癥模型組及給藥組加入LPS，使其終濃度為0.5 μg/mL，空白組加入等量的PBS，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行細(xì)胞甘油磷脂的提取。

1.4 脂類成分的提取

采用修飾后的Bligh-Dyer方法提取RAW264.7細(xì)胞的脂質(zhì)成分，整個(gè)提取過程需在4 ℃以下操作。具體提取過程如圖1。

圖1 RAW264.7細(xì)胞脂類成分的提取Fig.1 The extraction of lipids of RAW264.7 cells

1.5 UPLC-Q/TOF MS

色譜條件：UPLC BEH-C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；流速0.3 mL/min；curve=7。流動(dòng)相：A為含10 mmol/L乙酸銨的0.25%乙酸水溶液，B為含10 mmol/L乙酸銨和0.25%乙酸的乙腈-異丙醇(1∶1) 混合溶液。梯度洗脫條件：0～4 min，61%～81.4% B；4～20 min，81.4%～90% B；20～21 min，100% B；21～24 min，100% B。

質(zhì)譜條件：以ESI為離子源在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，以500 ng/mL亮氨酸-腦啡肽為參照進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量數(shù)校正，其在正、負(fù)離子模式下的質(zhì)荷比分別為m/z556.277 1和m/z554.261 5。質(zhì)量掃描范圍為420～950 Da。正、負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：毛細(xì)管電壓：3 000 V；錐孔電壓：30 V；萃取錐孔電壓：1.0 V；離子源溫度：100 ℃；去溶劑溫度：300 ℃，碰撞能量：6 V；離子能量：1.0 V，錐孔氣體流速：50 L/h,脫溶劑氣體流速：500 L/h。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)：不同種類的甘油磷脂成分所需碰撞能量不同，需根據(jù)其種類選擇合適的碰撞能量。

1.6 甘油磷脂成分的鑒定

借助Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)分子量進(jìn)行元素組成分析，限定誤差范圍為5 ppm以內(nèi)，再結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜信息以及數(shù)據(jù)庫比對(duì)的方法鑒定RAW264.7細(xì)胞甘油磷脂成分。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用centroid模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，獲得直觀的總離子流色譜圖，通過Masslynx對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，將總離子流圖轉(zhuǎn)換成包含保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰面積的數(shù)據(jù)矩陣，用于后續(xù)的數(shù)據(jù)處理。

經(jīng)Masslynx預(yù)處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-p軟件進(jìn)行PCA,PLS-DA,OPLS-DA分析。利用PCA,PLS-DA,OPLS-DA分別對(duì)空白組-炎癥模型組(C-L)、炎癥模型組-布洛芬給藥組(L-B)、炎癥模型組-二苯基庚烷A給藥組(L-D)進(jìn)行兩兩比較分析，篩選出具有顯著變化的變量，并以能被上述3種分析方法重復(fù)提取的顯著變量作為潛在的磷脂標(biāo)志物，再通過t檢驗(yàn)，篩選出符合P<0.05的變量作為潛在的磷脂標(biāo)志物。

2 結(jié)果與討論

2.1 RAW264.7細(xì)胞甘油磷脂的UPLC-Q/TOF MS

在正、負(fù)離子模式下對(duì)RAW264.7細(xì)胞甘油磷脂進(jìn)行UPLC-Q/TOF MS掃描。由于磷脂成分的極性基團(tuán)、Sn-1和Sn-2脂肪酸鏈復(fù)雜多樣，同一類中不同的磷脂可能保留時(shí)間相同或相近，色譜很難將其很好的分離，圖2為正離子模式下RAW264.7細(xì)胞甘油磷脂的總離子流色譜圖。由于所得到的每個(gè)色譜峰涵蓋多個(gè)甘油磷脂成分的信息，并且在每個(gè)樣品組的含量差異較大，人工處理數(shù)據(jù)較為困難，因此引入化學(xué)計(jì)量方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，簡化了數(shù)據(jù)處理過程，極大地提高了數(shù)據(jù)處理效率。

圖2 4組細(xì)胞樣品甘油磷脂在正離子模式下的總離子流色譜圖

2.2 數(shù)據(jù)處理

2.2.1 主成分分析(PCA) PCA是無監(jiān)督分析方法，可對(duì)多維空間的變量進(jìn)行降維，并在最大限度減少信息丟失的情況下，有效提取發(fā)揮作用的主要成分[17]。通過優(yōu)化，選擇最佳的標(biāo)度化方法，對(duì)空白組-炎癥模型組(C-L)、炎癥模型組-二苯基庚烷A給藥組(L-D)、炎癥模型組-布洛芬給藥組(L-B)進(jìn)行PCA分析。結(jié)果顯示，正、負(fù)離子模式下，組與組之間基本得以分離，表明組間樣品存在差異。圖3為正離子模式下各組的得分圖。

圖3 ESI+模式下最佳標(biāo)度化處理的PCA得分圖

2.2.2 抗炎藥物干預(yù)RAW264.7細(xì)胞的甘油磷脂潛在標(biāo)志物 PCA分析只能達(dá)到粗略的分型，獲得直觀可見的分型圖，為進(jìn)一步具體化地篩選出造成組間差異的變量，需進(jìn)行有監(jiān)督的PLS-DA和OPLS-DA分析，在PLS-DA和OPLS-DA分析中，選擇在兩種方法中VIP值均大于1的變量作為候選標(biāo)志物。將候選標(biāo)志物進(jìn)行t檢驗(yàn)，篩選P值小于0.05的變量作為最終的潛在甘油磷脂生物標(biāo)志物。通過空白組與炎癥模型組的對(duì)比，篩選得到潛在病理標(biāo)志物，將二苯基庚烷A給藥組和布洛芬給藥組分別與炎癥模型組對(duì)比，篩選得到其潛在藥理標(biāo)志物如表1～3所示。

從表1～3可以看到，炎癥模型組與空白組之間的潛在病理標(biāo)志物和給藥組(二苯基庚烷A和布洛芬)與炎癥模型組之間的潛在藥理標(biāo)志物主要包括磷脂酰膽堿(PC)、溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血磷脂酰醇胺(LysoPE)。炎癥狀態(tài)下，有27個(gè)甘油磷脂類成分發(fā)生了顯著變化，而在二苯基庚烷A和布洛芬干預(yù)下分別有23個(gè)和17個(gè)潛在藥理標(biāo)志物。通過潛在病理標(biāo)志物和潛在藥理標(biāo)志物的對(duì)比可得，兩者存在共同的磷脂類成分，并且在炎癥狀態(tài)和給藥狀態(tài)下的變化趨勢(shì)相反，說明RAW264.7細(xì)胞炎癥模型在藥物干預(yù)下，炎癥狀態(tài)下發(fā)生顯著變化的甘油磷脂類成分得以回調(diào)，恢復(fù)到正常狀態(tài)。同時(shí)也表明二苯基庚烷A在磷脂組學(xué)層面的抗炎作用機(jī)制與布洛芬相近。

表1 空白組與炎癥模型組之間的潛在病理標(biāo)志物信息(C vs.L)

+：increase in content for the inflammation model group compared with control group;-：decrease in content for the inflammation model group compared with control group(+:與空白組相比，該物質(zhì)在炎癥模型組呈上升趨勢(shì)；-:與空白組相比，該物質(zhì)在炎癥模型組呈下降趨勢(shì))

表2 炎癥模型組與二苯基庚烷A給藥組之間的潛在藥理標(biāo)志物信息(L vs.D)

+：increase in content for the diphenylheptane A group compared with inflammation model group;-：decrease in content for the diphenylheptane A group compared with inflammation model group(+:與炎癥模型組相比，該物質(zhì)在二苯基庚烷A給藥組呈上升趨勢(shì);-：與炎癥模型組相比，該物質(zhì)在二苯基庚烷A給藥組呈下降趨勢(shì))

表3 炎癥模型組與布洛芬給藥組之間的潛在藥理標(biāo)志物信息(L vs.B)

+：increase in content for the ibuprofen group compared with inflammation model group；-：decrease in content for the ibuprofen group compared with inflammation model group(+：與炎癥模型組相比，該物質(zhì)在布洛芬給藥組呈上升趨勢(shì)；- ：與炎癥模型組相比，該物質(zhì)在布洛芬給藥組呈下降趨勢(shì))

2.3 討 論

炎癥過程中，炎癥介質(zhì)主要由花生四烯酸(AA)代謝產(chǎn)生。正常情況下，游離AA的含量非常低，主要以磷脂的形式存在，而當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，AA會(huì)在磷脂酶A2的作用下從磷脂中釋放，發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的前列腺素類炎癥介質(zhì)。然而，游離出的AA只有小部分用于合成前列腺素類物質(zhì)，大部分在酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下重新與溶血磷脂生成磷脂[18]。Rouzer等[19]測(cè)定了LPS誘導(dǎo)前后，與C20∶4代謝有關(guān)的甘油磷脂的結(jié)構(gòu)以及RPMS巨噬細(xì)胞和RAW264.7巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)組成，進(jìn)一步研究表明，含有C20∶4碳鏈的PC類是AA的主要來源，而烷?；腜E類作為一種瞬時(shí)來源，可被快速補(bǔ)充。表1～3顯示，炎癥狀態(tài)下，含20∶4的甘油磷脂類，如LysoPC(20∶4/0∶0)，PC(14∶0/20∶4)，PC(16∶0/20∶4)，PC(16∶1/20∶4)，PC(15∶0/20∶4)的含量減少，給藥(二苯基庚烷A或者布洛芬)干預(yù)后，其含量增加。這主要是因?yàn)樵贚PS刺激下，花生四烯酸在環(huán)氧合酶的作用下生成大量的前列腺素類物質(zhì)，而含有C20∶4碳鏈的PC和PE類作為花生四烯酸的前體物質(zhì)在磷脂酶的作用下水解產(chǎn)生大量的AA，導(dǎo)致炎癥的持續(xù)發(fā)生。而當(dāng)給藥干預(yù)之后，布洛芬和二苯基庚烷A通過干預(yù)COX2進(jìn)而阻礙了AA的代謝，使得20∶4脂肪酸鏈合并入溶血磷脂形成含20∶4脂肪酸鏈的甘油磷脂類的含量增加。此外，研究表明[19-20]，受到適當(dāng)?shù)拇碳?，體內(nèi)含20∶4的甘油磷脂成分減少時(shí)，伴隨著含16-C和18-C脂肪酸鏈的甘油磷脂類含量的增加。通過病理和藥理潛在標(biāo)志物的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，炎癥模型組中含16-C和18-C的甘油磷脂類，如PC(O-14∶0/18∶3)，PC(O-14∶0/16∶0)，PC(16∶0/20∶3)，PC(O-16∶0/16∶0)，PC(18∶1/20∶3),PC(18∶0/20∶2)的含量增加，給藥(二苯基庚烷A或者布洛芬)干預(yù)之后，其含量減少。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同狀態(tài)下的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行甘油磷脂的UPLC-Q/TOF MS分析，并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理發(fā)現(xiàn)，二苯基庚烷A和布洛芬在發(fā)揮抗炎作用的過程中導(dǎo)致細(xì)胞甘油磷脂發(fā)生顯著變化，而這些甘油磷脂成分的代謝與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，這些磷脂可以作為抗炎藥物發(fā)揮作用的潛在標(biāo)志物。

[1] Yao L B.MedicalMolecularBiology.2nd ed.Beijing：People's Medical Publishing House(藥立波．醫(yī)學(xué)分子生物學(xué).2版．北京：人民衛(wèi)生出版社)，2004：180.

[2] Wu X，Zhao L L，Peng H B，She Y Q，F(xiàn)eng Y F.Chromatographia，2015，78(3/4)：211-220．

[3] Chang G R，Chen P L，Hou P H，Mao F C.IranJ.BasicMed.Sci.，2015，18(11)：1063-1071．

[4] Xian W J，Wu Y，Xiong W，Li L Y，Li T，Pan S W，Song L M，Hu L S，Pei L，Yao S L，Shang Y．Biochem.Biophys.Res.Commun.，2016，472(1)：175-181．

[5] Lin J T，Yin K S，Su N，Huang M，Qiu C，Liu C T，Cai S X，Hao C L．Ann.Trans.Med.，2015，7(11)：2061-2078．

[6] Pereira S S，Alvarez-Leite J I.CurrentObesityReports，2014，3(4)：422-431．

[7] Candore G，Bulati M，Caruso C，Castiglia L，Colonna-Romano G，Di Bona D，Duro G，Lio D，Matranga D，Pellicano M，Rizzo C，Scapagnini G，Vasto S．Rejuv.Res.，2010，13(2/3)：301-313．

[8] Gupta S，Maurya M R，Stephens D L，Dennis E A，Subramaniam S．Biophys.J.，2009，96(11)：4542-4551．

[9] Watson A D.J.LipidRes.，2006，47(10)：2101-2111．

[10] Fitzpatrick F A，Soberman R．J.Clin.Invest.，2001，107：1347-1351．

[11] An N，Yang S L，Xu L Z，Zou Z M．WorldNotesPlantMedicine(安寧，楊世林，徐麗珍，鄒忠梅．國外醫(yī)藥· 植物藥分冊(cè)) ，2006，21(5)：185-189．

[12] Lee S L，Huang W J，Lin W W，Lee S S，Chen C H．Bioorg.Med.Chem.，2005，(13)：6175-6181．

[13] Chun K S，Kang J Y，Kim O H，Kang H，Surh Y J．Toxicol.Oncol.，2002，21(2)：131-139．

[14] Zhang B，Du G H．Chin.Pharmacol.Bull.(張斌，杜冠華．中國藥理學(xué)通報(bào))，2005，21(8)：905-910．

[15] Xu Q，Ran Z H．Chin.J.Gastroenterol.(許琦，冉志華．胃腸病學(xué))，2005，10(2)：119-122．

[16] Manrique-Moreno M，Villena F，Sotomayor C P，Edwards A M，Muoz M A，Garidel P，Suwalsky M．Biochim.Biophys.

Acta，2011，1808(11)：2656-2664．[17] Jolliffe I T，Cadima J.Philos.Trans.A，2016，374:1-16．

[18] Pérez-Chacón G，Astudillo A M，Balgoma D，Balboa M A，Balsinde J．Biochim.Biophys.Acta，2009，1791(12)：1103-1113．

[19] Rouzer C A，Ivanova P T，Byrne M O，Brown H A，Marnett L J．Biochemistry，2007，46(20)：6026-6042．

[20] Rouzer C A，Ivanova P T，Byrne M O，Milne S B，Marnett L J，Brown H A．Biochemistry，2007，45(49)：14795-14808．

Analysis of Glycerophospholipids in RAW264.7 Cell Inflammation Model Interfered by Diphenylheptane A with UPLC-Q/TOF MS

XIAO Xue-rong，SHE Yu-qi，ZHANG Guo-gai，WU Xia，F(xiàn)ENG Yi-fan*

(Central Laboratory，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)

The study aims to illustrate the effect of diphenylheptane A on the glycerophospholipids metabolism in the inflammatory process through analyzing glycerophospholipids components of RAW264.7 cells under different status(control，inflammation，administration) and screening potential pathological and pharmacological biomarkers.RAW264.7 cells were randomly divided into four groups：control group(C)，inflammation group(L)，diphenylheptane A(D)，ibuprofen(B，positive control).C and L were treated with fresh medium while D and B were treated with medium containing 20 μg/mL diphenylheptane A or 100 μg/mL ibuprofen，respectively.1 h later，lipopolysaccharide(LPS) was added to L，D and B at a final concentration of 0.5 μg/mL.24 h later，glycerophospholipids in RAW264.7 cells of four groups were extracted by modified Bligh-Dyer method and analyzed by ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q/TOF MS) in both positive and negative ion modes.Then，glycerophospholipids components were identified by combination of MS/MS fragment ions information，element composition in MassLynx 4.1 and the Lipid Maps database.Finally，potential pathological and pharmacological biomarkers were screened by unsupervised principal component analysis(PCA)，supervised partial least squares-discriminate analysis(PLS-DA)，supervised orthogonal partial least squares discriminate analysis(OPLS-DA)，and Student'st-test(P<0.05).The results showed that 27 potential pathological biomarkers were found by comparing C and L，23 potential pharmacological biomarkers were found by comparing D and L，and 17 potential pharmacological biomarkers were found by comparing B and L.The biomarkers mainly included phosphatidylcholine(PC)，lysophosphatidylcholine(lysoPC)，phosphatidylethanolamine(PE) and lysophosphatidylethanolamine(lysoPE).It was found that diphenylheptane A led to obvious changes of glycerophospholipids metabolism during the process of inflammation，which were closely related to the occurrence and development of inflammation.Key words：inflammation;glycerophospholipids;diphenylheptane A;ibuprofen;biomakers；ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q/TOF MS)

2016-03-30；

2016-04-26

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21275036，81202429)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.002

O657.63；Q54

A

1004-4957(2016)10-1225-08

*通訊作者：馮毅凡，教授，研究方向：現(xiàn)代儀器分析技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用，Tel：020-39352522，E-mail：tfengyf@163.com