湯興利， 李林華， 周義峰， 陳藝芳

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；2.中國(guó)科學(xué)院南京分院東臺(tái)灘涂研究院，江蘇鹽城 224200；3.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽蕪湖 241003；4.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇南京 210014)

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白及種子液體懸浮培養(yǎng)原球莖的研究

湯興利1，2， 李林華3， 周義峰2，4， 陳藝芳1

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；2.中國(guó)科學(xué)院南京分院東臺(tái)灘涂研究院，江蘇鹽城 224200；3.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽蕪湖 241003；4.江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇南京 210014)

[目的]研究白及種子在液體懸浮培養(yǎng)條件下萌發(fā)的最佳條件，為快速繁殖白及幼苗提供技術(shù)支撐。[方法]研究不同光照條件、不同培養(yǎng)基和不同激素及濃度對(duì)白及種子萌發(fā)的影響。[結(jié)果]黑暗有利于白及種子萌發(fā)，1/2 MS適宜作為白及種子萌發(fā)基本培養(yǎng)基。植物激素對(duì)白及種子無菌萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，其中，添加1.0 mg/L NAA對(duì)白及萌發(fā)促進(jìn)效果最明顯。[結(jié)論]在黑暗條件下，以1/2 MS+1.0 mg/L NAA為萌發(fā)培養(yǎng)基，白及種子萌發(fā)率高，萌發(fā)整齊一致，且原球莖生長(zhǎng)速度一致。

白及；懸浮培養(yǎng)；原球莖

白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.]為蘭科白及屬多年生宿根草本植物[1]，形態(tài)優(yōu)美，具有很高的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值。白及在自然狀態(tài)下主要采用分株繁殖，繁殖系數(shù)較低；雖然能產(chǎn)生大量種子，但白及是無胚乳種子，在自然條件下不易發(fā)芽。由于白及繁殖率低，無法適應(yīng)規(guī)模化種植的需求[2-5]。目前針對(duì)白及繁殖的研究主要集中于種子無菌輔助育苗和組織培養(yǎng)，該技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)得到大量的實(shí)生苗，是白及生產(chǎn)上快速有效的途徑[6-10]。

目前白及組織培養(yǎng)大多選用固體培養(yǎng)基，即將白及種子輕輕抖落在培養(yǎng)基表面，但由于白及種子呈粉末狀，非常細(xì)小，操作時(shí)難以保證每個(gè)種子都能充分接觸培養(yǎng)基，造成不同種子生長(zhǎng)條件差異較大。同時(shí)由于白及種子細(xì)小，在固體培養(yǎng)基上播種時(shí)易將種子撒到一起導(dǎo)致種子萌發(fā)后過于密集，而幼苗在轉(zhuǎn)接過程需要進(jìn)行單株分離，過于密集會(huì)增加分離轉(zhuǎn)接的難度，轉(zhuǎn)接時(shí)易對(duì)幼苗造成二次傷害。筆者利用液體培養(yǎng)的方式對(duì)白及種子進(jìn)行懸浮培養(yǎng)得到原球莖的方法進(jìn)行研究，該方法可以讓白及種子充分和液體培養(yǎng)基接觸，并通過振蕩培養(yǎng)的方式使白及種子充分分開，不會(huì)結(jié)成團(tuán)塊，后期轉(zhuǎn)接時(shí)容易分離，不會(huì)對(duì)白及幼苗造成二次傷害。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 白及蒴果由安徽省蕪湖市安徽中醫(yī)藥?？茖W(xué)校李林華老師提供，果實(shí)采集于安徽蕪湖市南陵縣丫山，經(jīng)鑒定為蘭科植物白及[Bletillastriata(Thunb.)Reichb. f.]的干燥成熟蒴果。試驗(yàn)于2014年9月至2016年6月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院組培中心進(jìn)行。

1.2 主要儀器 FA1104分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，HS-1300-U超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，HV85全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)，HY-8(A) 大容量振蕩器(江蘇盛藍(lán)儀器有限公司)，奧林巴斯光學(xué)顯微鏡CX23(北京瑞科中儀科技有限公司)。

1．3 試驗(yàn)方法 白及蒴果采集后，于4 ℃冰箱貯藏，接種前從冰箱取出后用洗滌劑漂洗蒴果表面10～20 min，再用流水沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上用75%乙醇浸30 s，無菌水沖洗后經(jīng)5%NaClO溶液消毒10 min，期間不停搖動(dòng)，無菌水沖洗3～4遍，無菌濾紙吸干白及蒴果表面水分。用剪刀將蒴果頂端剪開，將種子抖落在不同處理液體培養(yǎng)基中。

液體培養(yǎng)基高溫滅菌前調(diào)pH至5.6～5.8，121 ℃下滅菌30 min，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶300～500粒種子。暗培養(yǎng)是將接種白及種子的液體培養(yǎng)瓶置于黑暗條件下培養(yǎng)并觀察試驗(yàn)結(jié)果，其余處理的光照周期均為12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，培養(yǎng)溫度均為(25±1)℃。將接種白及種子的液體培養(yǎng)瓶置搖床上振蕩，防止白及種子在營(yíng)養(yǎng)液中結(jié)塊，搖床振蕩頻率為100 r/min。

1．4 觀測(cè)項(xiàng)目與方法 白及種子接種于液體培養(yǎng)基后觀察白及種子萌發(fā)情況和種子發(fā)芽率，根據(jù)發(fā)芽情況分為5級(jí)：+表示少數(shù)種子萌發(fā)且顏色淡黃綠色；++表示少于50%的種子萌發(fā)，少數(shù)種子冒尖且顏色黃綠色；+++表示約50%的種子萌發(fā)冒尖轉(zhuǎn)綠；++++表示約75%的種子萌發(fā)，芽顏色鮮綠，種子中部膨大成球狀；+++++表示約90%的種子萌發(fā)出芽，顏色翠綠且多數(shù)膨大成球狀。

原球莖長(zhǎng)度和粗度測(cè)定：將萌發(fā)的白及種子在無菌條件下隨機(jī)取樣置于光學(xué)顯微鏡下觀察并測(cè)量白及原球莖的莖粗和芽長(zhǎng)度，按照傳統(tǒng)方法將物鏡測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺配合使用[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素條件對(duì)白及種子發(fā)芽的影響 由表1可知，白及種子接種后45 d，各液體培養(yǎng)基中白及種子均可達(dá)到4級(jí)以上。與1/2 MS培養(yǎng)基相比，添加1.0 mg/L NAA顯著提高白及種子發(fā)芽率，并能促進(jìn)白及組培苗生長(zhǎng)。以1/2MS為基本培養(yǎng)基時(shí)，白及種子發(fā)芽速度快且一致，表明其生活力更旺盛；以MS為基本培養(yǎng)基有利于白及芽伸長(zhǎng)，促進(jìn)其快速生長(zhǎng)。懸浮培養(yǎng)30 d種子發(fā)芽情況見圖1。

表1 不同處理對(duì)白及種子萌發(fā)的影響

Table 1 Effects of different treatments on the seed germination ofB.striata

培養(yǎng)基Culturemedium發(fā)芽情況Germinationsituation15d30d45d1/2MS++++++++1/2MS+0.5mg/LNAA+++++++++1/2MS+1.0mg/LNAA++++++++++++++1/2MS+1.5mg/LNAA+++++++++++MS++++++++MS+0.5mg/LNAA+++++++MS+1.0mg/LNAA++++++++++++MS+1.5mg/LNAA++++++++++

圖1 白及種子懸浮培養(yǎng)30 d表現(xiàn)Fig. 1 Performance of B. striata seeds under suspension culture for 30 d

2.2 不同光照條件對(duì)白及種子發(fā)芽的影響 將白及種子消毒后接種于1/2 MS+1.0 mg/L NAA培養(yǎng)基中，于黑暗和光照條件下培養(yǎng)，30 d后取樣觀察，結(jié)果見表2和圖2。由表2和圖2可知，黑暗條件更有利于白及種子發(fā)芽，光照條件下白及發(fā)芽率約80%，比黑暗條件下的發(fā)芽率低20%左右。同時(shí)，光照對(duì)白及原球莖的形成和早期生長(zhǎng)也有明顯的抑制作用。光照條件下，白及原球莖的長(zhǎng)度、粗度僅為黑暗條件的30%和60%左右。因此，推測(cè)在外源激素和營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，光照條件雖然不是白及發(fā)芽及早期生長(zhǎng)的決定性因子，但對(duì)其形成和生長(zhǎng)性能產(chǎn)生重要影響，黑暗條件更有利于白及種子發(fā)芽、原球莖形成與生長(zhǎng)。

表2 不同光照條件下白及發(fā)芽情況

注：a.黑暗條件下;b.光照條件下。Note: a. Dark condition; b. Light condition.圖2 白及種子發(fā)芽情況Fig. 2 Germination situation of B. striata seeds

2.3_left不同激素及濃度對(duì)白及種子形成原球莖的影響 將白及種子消毒后接種于不同液體培養(yǎng)基中，于黑暗條件下培養(yǎng)30 d，結(jié)果見表3。由表3可知，不同培養(yǎng)基配方對(duì)白及種子萌發(fā)率和原球莖形成均有較大影響。6-BA明顯抑制白及芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，對(duì)白及原球莖的增粗生長(zhǎng)也有較明顯的抑制作用。因此，在白及種子萌發(fā)過程中無須添加6-BA。最有利于白及種子萌發(fā)形成健康幼苗的最佳培養(yǎng)基是1/2MS +1.0 mg/L NAA。

表3 不同濃度激素對(duì)白及幼苗生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

蘭科植物種子細(xì)小，成熟時(shí)種皮細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器退化消失，成為死細(xì)胞[12]。白及胚發(fā)育不完全，缺乏供給營(yíng)養(yǎng)成分的胚乳，在自然條件下難以萌發(fā)。而無菌培養(yǎng)白及種子，必須提供其萌發(fā)所需的各種物質(zhì)。該研究表明，1/2 MS作為種子萌發(fā)培養(yǎng)基可以提高其發(fā)芽勢(shì)，高濃度鹽離子影響細(xì)胞滲透勢(shì)導(dǎo)致白及胚在吸水時(shí)膨脹速度較慢，故建議白及種子在萌發(fā)初期采用1/2MS培養(yǎng)基，且節(jié)省培養(yǎng)基成本。白及在萌發(fā)過程中添加一定的生長(zhǎng)素有利于啟動(dòng)萌發(fā)，而6-BA在白及種子萌發(fā)過程中會(huì)增加細(xì)胞的分裂作用，顯著增加白及數(shù)量，但明顯抑制原球莖的增大和芽的伸長(zhǎng)，而白及種子數(shù)量很多，并不是限制白及育苗的關(guān)鍵因素。因此，在白及種子液體發(fā)芽體系中不建議添加6-BA。

該研究發(fā)現(xiàn)，黑暗條件有利于白及種子萌發(fā)。在黑暗條件下培養(yǎng)的白及種子萌發(fā)率相對(duì)較高，且芽生長(zhǎng)速度明顯高于光照條件下。綜合考慮，在黑暗條件下，以1/2 MS+1.0 mg/L NAA為萌發(fā)培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得白及原球莖。白及種子萌芽初期細(xì)小，不宜轉(zhuǎn)接，因此，可以在培養(yǎng)瓶中直接添加營(yíng)養(yǎng)液的方式解決白及原球莖對(duì)營(yíng)養(yǎng)消耗的補(bǔ)充。該試驗(yàn)對(duì)白及種子在液體條件下無菌萌發(fā)進(jìn)行研究，能夠形成健壯一致的原球莖，為快速生產(chǎn)白及無菌苗提供有效的技術(shù)參數(shù)，為推動(dòng)白及種苗規(guī)?；a(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)．中國(guó)植物志：第18卷[M]．北京:科學(xué)出版社，1999．

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Fluid Suspension Culture ofBletillastriata(Thunb.) Reichb. f. Protocorm

TANG Xing-li1,2, LI Lin-hua3, ZHOU Yi-feng2,4et al

(1. Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095; 2. Dongtai Institute of Tidal Flats, Nanjing Branch of Chinese Academy of Sciences, Yancheng, Jiangsu 224200; 3. Anhui College of Traditional Chinese Medicine, Wuhu, Anhui 241003; 4. Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing, Jiangsu 210014)

[Objective] To research the optimum germination condition for liquid suspension culture ofBletillastriata(Thunb.) Reichb. f. seeds, and to provide technological supports for the rapid propagation ofB.striataseedlings and saving its resources. [Method] The effects of different light conditions, culture mediums and the hormone types and concentrations on the germination ofB.striataseeds were investigated. [Result] Dark culture was beneficial to the germination ofB.striataseeds, and the medium of 1/2 MS was a proper basic medium for the seed germination. In addition, plant hormones could promote the seeds germination, among them, adding 1.0 mg/L NAA in the medium was the most effective. [Conclusion] Under dark culture, with 1/2 MS+1.0 mg/L NAA as a germination medium, theB.striataseeds have a high germination rate and orderly germination, and the protocorm has a consistent growth rate.

Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.; Liquid suspension culture; Protocorm

江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金前瞻性研究項(xiàng)目(BY2014116)。

湯興利(1974- )，女，湖北浠水人，講師，碩士，從事藥用植物資源開發(fā)利用研究。

2016-08-29

S 188

A

0517-6611(2016)29-0151-03