陸東和， 陳 慎， 黃穎穎， 楊成龍*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點實驗室，福建福州 350003)

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嬰幼兒米粉復合酶解技術(shù)研究

陸東和1,2， 陳 慎1,2， 黃穎穎1,2， 楊成龍1,2*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建福州 350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點實驗室，福建福州 350003)

[目的]研究生物酶解法在嬰幼兒米粉加工過程中的應(yīng)用，以提高直鏈淀粉含量而抑制淀粉回生。[方法]選取適宜的復合酶對米粉進行酶解，通過酶種類的篩選、復合酶配比優(yōu)化，酶解pH、酶作用溫度、酶添加量及酶作用時間等條件單因素分析及Box-Benhnken試驗設(shè)計，優(yōu)化得到了復合酶解技術(shù)延緩米粉回生過程的工藝條件。[結(jié)果]考慮實際操作，得到最優(yōu)酶解條件如下：酶解pH 5.9，酶解溫度56 ℃，復合酶總添加量0.70 μg/g，酶解時間120 min。該條件下得到實際的直鏈淀粉含量可達26.28%。經(jīng)方差及回歸方程分析得到各個條件及它們之間的交互作用對于米粉直鏈淀粉含量影響顯著。[結(jié)論]通過該試驗分析法優(yōu)化得到的復合酶解技術(shù)可顯著抑制淀粉回生，所得到的工藝條件可用于指導工業(yè)生產(chǎn)。

嬰幼兒米粉；直鏈淀粉；酶解；最佳條件

嬰幼兒營養(yǎng)米粉是根據(jù)嬰兒生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)而研制，在母乳或嬰兒配方食品不能滿足嬰幼兒營養(yǎng)需要時，作為補充嬰幼兒營養(yǎng)的輔助食品。它是以大米為主要原料，以糖、肉類、蛋類、蔬菜、水果、大豆、小米等為選擇性配料，并加入鈣、鐵等礦物質(zhì)及維生素等加工制成[1]。歐美國家的嬰幼兒輔食發(fā)展較快，大都具有明確的針對性，營養(yǎng)標簽詳盡，膳食調(diào)配指導完善[2]。國內(nèi)當前嬰幼兒食品傳統(tǒng)加工工藝存在沖調(diào)時用水量大，不易攪拌均勻，存在團塊及入口后黏度大等缺點。因此，提升國內(nèi)市場嬰幼兒食品整體品質(zhì)具有重要意義。

大米不容易引起過敏且易于消化吸收，因此由大米加工成的米粉是嬰兒輔食的首選[3]。淀粉的水解度與回生程度對米粉產(chǎn)品的品質(zhì)具有顯著影響，因此嬰幼兒米粉的品質(zhì)及口感與淀粉的性質(zhì)有重要關(guān)系。淀粉通過蒸煮、焙烤等加熱過程而被糊化，在儲存過程中，糊化的淀粉發(fā)生老化(亦稱回生)，從而使食品的質(zhì)構(gòu)與消化性劣化。因此，抑制回生是改善米粉口感及延長貨架期的重要手段。淀粉的回生包括直鏈分子螺旋結(jié)構(gòu)的形成及其堆積、支鏈淀粉外支鏈間雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成與雙螺旋之間的有序堆積[4]。研究表明，直鏈淀粉分子長短及直、支鏈的比例與回生速率呈高度相關(guān)，抑制淀粉類食品的回生可由消除或抑制支鏈淀粉分子結(jié)晶的形成來達到[5]。目前，抑制淀粉回生的主要方法有基因修飾、酶法修飾、化學修飾、物理修飾[6]。

淀粉的生物酶解法能通過改變鏈長，增強分子鏈排列的無序性而達到明顯的延緩回生、抗老化和改善穩(wěn)定性的效果。如通過在饅頭、面包和米粉等的制作過程中添加淀粉酶，可有效延長面制品的保鮮時間，是一種具有廣闊前景的方法[7]。筆者針對米粉傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝的缺陷，選取α-淀粉酶、β-淀粉酶及環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTase)進行復配，采用酶解技術(shù)解決米粉沖調(diào)性的缺陷，延緩米粉中淀粉的回生過程，重點解決嬰幼兒米粉加工成品口感較差的問題。

1 材料與方法

1.1 材料 原料與主要試劑：大米(市售)，α-淀粉酶(分析純)，β-淀粉酶(分析純)，環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(CGTase)(分析純)。

主要儀器設(shè)備：雙螺桿膨化機，低速臺式離心機，植物粉碎機，數(shù)顯恒溫水浴鍋，電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程。大米→粉碎→調(diào)水分→酶解→鈍化→擠壓膨化→烘干→粉碎→篩分→輔料調(diào)配→混勻→包裝。

1.2.2 酶的篩選。選用α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶3種酶在其各自最優(yōu)條件下對米粉進行水解，通過測定直鏈淀粉含量，分析淀粉的水解程度，篩選出直鏈淀粉含量比較理想的2種酶進行后續(xù)復配試驗。

進行復配試驗時，選取3種酶進行復合酶篩選試驗，固定酶添加總量為0.50 μg/g，在各酶水解最適條件下，酶解2 h。

1.2.3 復合酶比例的確定。經(jīng)過前期預(yù)試驗確定，在固定酶總添加量0.60 μg/g、pH 8.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間120 min條件下，設(shè)定9個不同水平的復配比例，研究效果較好的2種酶制劑之間量的不同配比對米粉酶解效果的影響。1.2.4 復合酶組合水解條件篩選。在確定復合酶水解粗略的水解條件之后，改變酶添加量、酶解時間、酶解pH、溫度中的1個參數(shù)，分別測定其直鏈淀粉含量，確定復合酶的較佳單因素條件。

1.2.5 響應(yīng)面分析試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取pH、溫度、酶添加總量、酶解時間作為響應(yīng)因素，以直鏈淀粉含量作為響應(yīng)面值，通過Design Expert 8.0.1 軟件，根據(jù)Box-Benhnken 試驗設(shè)計原理，設(shè)計4因素3水平共29組試驗對預(yù)處理工藝進行響應(yīng)面分析，得到優(yōu)化后的最佳加工參數(shù)，因素水平編碼見表1。

表1 試驗因素水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 復合酶種類與配比選擇

2.1.1 復合酶種類選擇。選取α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶3種酶，在其各自最優(yōu)條件下對米粉進行水解，之后進行兩兩組合試驗，并與單酶試驗進行對比。由圖1可知，α-淀粉酶和β-淀粉酶組合效果最好，因此選取該組合作為后續(xù)試驗的復合酶。

圖1 酶種類與直鏈淀粉含量的關(guān)系Fig.1 The relationship between enzyme type and amylose content

2.1.2 復合酶比例組合篩選結(jié)果。選取α-淀粉酶和β-淀粉酶作為該試驗的復合酶，配制不同比例的復合酶，以直鏈淀粉含量為指標，從而得出較佳的復合比例。由表2可知，2號處理組的直鏈淀粉含量最高，為25.33%。與單一酶解效果比較，復合酶中所有處理組合的直鏈淀粉含量均高于單一酶處理組，因此該試驗采用的復合酶配比為第2處理組，即α-淀粉酶∶β-淀粉酶為4∶6。

表2 不同復合比例組合對米粉的酶解效果

Table 2 Enzymatic results of rice flour with combined enzymes at different rations

編號No.復合酶比例Ratioofcompoundenzymes(α-淀粉酶+β-淀粉酶)α-amylasc+β-amylase)直鏈淀粉含量Amylosecontent%11∶122.6824∶625.3333∶724.7842∶822.9751∶922.5666∶423.7877∶321.0188∶220.4999∶118.751010∶0 18.5811 0∶1022.57

2.2 復合酶酶解條件單因素試驗

2.2.1 復合酶水解pH的選擇。在酶添加量0.60 μg/g、酶解時間120 min、酶解溫度50 ℃條件下，研究不同酶解pH對酶解效果的影響，試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同pH對直鏈淀粉含量的影響Fig.2 Effect of different pH on amylose content

pH可影響酶分子活性中心上必需基團的解離程度，影響催化基團中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)，以及底物與酶的解離程度，從而對酶與底物的結(jié)合過程造成影響[8]。由圖2可以看出，隨pH的升高，酶解液的直鏈淀粉含量呈先升高后降低的趨勢，在pH 5.5左右時，米粉的酶解效果最好，可知此時復合酶與米粉中淀粉結(jié)合最好，pH低于或超過了這個較適范圍，酶的活性中心構(gòu)象就會發(fā)生改變，甚至整個酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[9]，造成酶解效果的變化。因此，復合酶的最佳酶解pH為5.5。

2.2.2 復合酶水解溫度的選擇。在pH 8.0、酶添加量0.60 μg/g、酶解時間120 min條件下，研究不同酶水解溫度對酶解效果的影響，試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酶解溫度對直鏈淀粉含量的影響Fig.3 Effect of different hydrolysis temperature on amylose content

溫度對酶的活性至關(guān)重要，其對酶促反應(yīng)速率的影響主要表現(xiàn)在2個方面：一方面當溫度在一定范圍內(nèi)升高時，反應(yīng)物能量增加，單位時間內(nèi)有效碰撞次數(shù)增加，反應(yīng)速率加快；另一方面由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，隨著溫度的升高，在超過一定范圍之后，酶蛋白會因逐漸變性而失活，從而導致酶促反應(yīng)速度下降。由圖3可知，當溫度較低時，淀粉酶的活性受到限制，酶解反應(yīng)效率較低，直鏈淀粉含量偏低，當溫度逐漸升高，淀粉酶的活性不斷提高，帶動酶解反應(yīng)速率增加。當溫度為60 ℃時，直鏈淀粉含量最高，此后隨著酶解溫度的升高酶活性受到抑制，直鏈淀粉含量降低。研究表明，α-淀粉酶的適宜溫度在60 ℃左右[10]，而β-淀粉酶的適宜溫度在40～60 ℃[11]，故選擇復合酶適宜的酶解溫度為60 ℃左右。

2.2.3 復合酶總添加量的選擇。在pH 8.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間120 min條件下，研究不同酶總添加量對酶解效果的影響，試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同酶總添加量對直鏈淀粉含量的影響Fig.4 Effect of different addition amount of total enzymes on amylose content

在底物充足而酶用量處在較低水平時，隨著酶用量增大，反應(yīng)速率也隨之增大；當?shù)孜锊怀渥銜r增大酶用量，反應(yīng)速率的增大會變得緩慢，甚至出現(xiàn)下降的趨勢[12]。由圖4可知，當復合酶總添加量為0～0.60 μg/g時，酶解液直鏈淀粉含量隨復合酶添加量的增加而不斷升高，當添加量超過0.60 μg/g后，酶解液的直鏈淀粉含量增加不再明顯，說明酶已經(jīng)被底物飽和，再增加酶的用量對酶解效果作用不大。有研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的β-淀粉酶能保持直鏈淀粉的分支結(jié)構(gòu)，但縮短了直鏈淀粉的外鏈長度，從而抑制淀粉的回生[13]。因此，復合酶的最適添加量確定為0.60 μg/g。

2.2.4 復合酶解時間的選擇。在pH 8.0、酶添加量0.60 μg/g、酶解溫度50 ℃條件下，研究不同酶解時間對酶解效果的影響，試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同酶解時間對直鏈淀粉含量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time on amylose content

由圖5可知，伴隨著酶解反應(yīng)時間的延長，酶解效果逐漸達到最佳點，酶解液直鏈淀粉含量逐漸上升。在30～120 min內(nèi)，淀粉得到了快速的酶解，120 min后溶液的直鏈淀粉含量增加變得緩慢?？赡艿脑蚴敲附獬潭冗_到完全之后底物被完全酶解，酶解效率開始下降，酶解效果趨于平緩。因此，以120 min為較合適的復合酶酶解時間。

2.3 最佳酶解條件優(yōu)化 由單因素試驗可知，復合酶處理下，直鏈淀粉含量增加，而直鏈淀粉是直接影響米粉制作的最主要因素，因此在單因素試驗基礎(chǔ)上，以直鏈淀粉含量為指標，選取復合酶總添加量、溫度、pH和時間進行響應(yīng)面分析，采用Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，對4個因素進行優(yōu)化設(shè)計，結(jié)果如表3。

利用Design Expert 8.0分析軟件對表3的試驗結(jié)果進行分析，以pH(X1)、酶解溫度(X2)、復合酶添加總量(X3)和酶解時間(X4)為自變量，直鏈淀粉含量(Y)為因變量，建立酶解工藝參數(shù)回歸模型，回歸方程如下：Y=-419.14+42.45X1+6.02X2+357.65X3+0.47X4+0.038X1X2-30.25X1X3-0.089X1X4-2.86X2X3+0.000 8X2X4-0.12X3X4-0.99X12-0.04X22+4.54X23+0.000 132X4。

表3 Box-Benhnken 試驗設(shè)計與結(jié)果

模型的F值為84.71，P值小于0.000 1，說明該數(shù)學模型顯著。而失擬項P=0.146 4>0.05，說明失擬項不顯著，相關(guān)系數(shù)(R2=0.988 3)較高，表明有98.83%的數(shù)據(jù)可以用此方程解釋。因此，該方程擬合較好，可以用此模型來預(yù)測米粉酶解工藝。由F值可以看出，顯著影響酶解的因素由大到小依次為pH、酶解溫度、復合酶添加總量和酶解時間。

2.4 驗證試驗 利用Design Expert 8.0.6軟件對擬合后的回歸方程進行求解，得出最優(yōu)酶解條件為：pH為5.93，酶解溫度為55.87 ℃，酶總添加量為0.69 μg/g，酶解時間120.76 min，直鏈淀粉含量可達到26.36%。考慮實際操作，將優(yōu)化參數(shù)修正為：pH為5.9，酶解溫度為56 ℃，酶總添加量為0.70 μg/g，酶解時間120 min。采用優(yōu)化后的參數(shù)條件進行試驗，得到實際的直鏈淀粉含量為26.28%，與預(yù)測值基本相符，而且得到的結(jié)果比任何一次單因素試驗都好，說明模型的適用性高，以及利用響應(yīng)面分析確定2種淀粉酶最佳復配條件具有可行性。

3 結(jié)論與討論

該研究通過單因素試驗和Box-Benhnken試驗設(shè)計，優(yōu)化得到了復合酶解技術(shù)延緩米粉回生過程的工藝條件，選取α-淀粉酶和β-淀粉酶進行復配，通過酶解pH、酶作用溫度、酶添加量及酶作用時間等條件進行分析，結(jié)果表明，在pH為5.9，酶解溫度為56 ℃，酶總添加量為0.70 μg/g，酶解時間120 min的條件下，直鏈淀粉含量提高至26.28%，經(jīng)方差及回歸方程分析得到各個條件及它們之間的交互作用對于米粉支鏈淀粉含量影響顯著。因此，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化的復合酶解技術(shù)抑制淀粉回生工藝條件可用于指導工業(yè)生產(chǎn)。

α-淀粉酶普遍分布在動物、植物和微生物中，是一種重要的淀粉水解酶。它以隨機作用方式切斷淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子內(nèi)的α-1，4葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等[14]。α-淀粉酶來源穩(wěn)定且價格便宜，酶解效果佳，是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的酶制劑之一[15]。β-淀粉酶是一種外切型糖化酶，作用于淀粉時，能從α-1，4糖苷鍵的非還原性末端順次切下1個麥芽糖單位，生成麥芽糖及大分子的β-界限糊精[12]。從而通過切短支鏈淀粉外側(cè)支鏈而抑制其回生，且隨著酶解度的增加回生抑制更加明顯。因此β-淀粉酶在制備飴糖、啤酒、飲料等工業(yè)生產(chǎn)過程中被大量使用成糖化劑。該研究中所篩選出的2種酶均為易得穩(wěn)定、成本可控的加工原料，在大規(guī)模生產(chǎn)中都可很好地應(yīng)用，因此，該研究所得到的加工條件具有可行性[16]。

當前國內(nèi)外嬰幼兒米粉加工企業(yè)中，無論是采用輥筒干燥法或擠壓膨化法，都存在一定的技術(shù)瓶頸，導致產(chǎn)品水溶速度慢、沖調(diào)性差，米粉沖調(diào)后質(zhì)量低和口感差等一系列問題[17]。該研究運用酶解法在一定程度上改善了嬰幼兒米粉產(chǎn)品的品質(zhì)，但當前嬰幼兒米粉仍然存在衛(wèi)生學指標超標、營養(yǎng)強化劑添加不足、食用方便性和穩(wěn)定性差等問題。由于米粉作為嬰幼兒必要的谷物類輔助食品，具有很大的市場需求和發(fā)展前景。因此，研究更符合嬰幼兒的生理及飲食特點，配方科學、營養(yǎng)全面、食用方便的新型高端米粉產(chǎn)品具有重要意義。只有對米粉加工過程進行更加詳細和全面性的研究才能從根本上解決存在的諸多問題，促進米粉產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

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Compound Enzyme Selection and Enzymolysis Conditions Optimization for Infant Rice Paste

LU Dong-he1,2,CHEN Shen1,2,HUANG Ying-ying1,2,YANG Cheng-long1,2*

(1.Institute of Agricultural Engineering Technology,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou,Fujian 350003; 2.Fujian Key Laboratory of Agricultural Product (Food) Processing,Fuzhou,Fujian 350003)

[Objective] The application of enzyme hydrolysis method in production process of infant rice paste was studied,in order to improve the content of amylopectin and restrain starch retrogradation.[Method] Through enzyme selection,compound enzyme ratio optimization,single factor analysis such as pH,temperature,enzyme dosage,time,and Box-Benhnken experimental design,conditions for delay retrogradation process by complex enzymatic hydrolysis technology were optimized.[Result] Considering the actual conditions,the optimal conditions were as follows:pH 5.9,enzymolysis temperature 56 ℃,addition amount of compound enzymes 0.70 μg/g,enzymolysis time 120 min.Under this condition the content of amylose could reach to 26.28%.Through variance and regression equation analysis,each condition and their interactions had significant effects on amylose content.[Conclusion] The optimized technique can significantly restrain starch retrogradation,the obtained conditions can be used to guide the industrial production.

Infant rice paste; Amylose; Enzyme hydrolysis; Optimal condition

福建省科技廳公益類項目(2014R1015-2); 福建省區(qū)域重大項目(2015N31010018)。

陸東和(1975- )，男，福建福州人，副研究員，博士，從事食品與發(fā)酵工程研究。*通訊作者，教授級高級工程師，從事食品與發(fā)酵研究。

2016-08-18

TS 216

A

0517-6611(2016)29-0066-05