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        納米/微米一水草酸鈣、二水草酸鈣對牛血清白蛋白的吸附性能

        2016-12-01 01:32:11溫小玲歐陽健明暨南大學生物礦化與結石病防治研究所暨南大學化學系廣州510632
        無機化學學報 2016年1期
        關鍵詞:等電點納米級草酸鈣

        溫小玲 歐陽健明(暨南大學生物礦化與結石病防治研究所;暨南大學化學系,廣州510632)

        納米/微米一水草酸鈣、二水草酸鈣對牛血清白蛋白的吸附性能

        溫小玲歐陽健明*
        (暨南大學生物礦化與結石病防治研究所;暨南大學化學系,廣州510632)

        研究了牛血清白蛋白(BSA)在尺寸分別為100 nm、3 μm的一水草酸鈣(COM)和二水草酸鈣(COD)晶體上的吸附等溫線及晶體ζ電位隨BSA濃度(cBSA)的變化。結果表明,4種晶體對BSA的最大吸附量順序為COD-100 nm>COM-100 nm≥COD-3 μm>COM-3 μm,即吸附量與晶體的比表面積成正相關。而比表面積歸一化后,吸附量順序為COD-3 μm>COM-3 μm>COM-100 nm>COD-100 nm,說明COM和COD晶體的結晶水數量和晶面電荷密度影響了BSA的吸附。吸附等溫線都很好地擬合了Langmuir模型,表明BSA在納米/微米COM、COD晶體上的吸附屬于單分子層吸附。COM和COD等電點大小順序為COM-100 nm(7.2)>COD-100 nm(6.7)≥COM-3 μm(4.7)>COD-3μm(4.3),因此在病生理條件下(pH≈6.3)納米級晶體的團聚比微米級晶體的更嚴重。納米級和微米級晶體對BSA的最大吸附量都在BSA等電點附近(pH=4.8)。BSA在納米/微米COM和COD晶體上的吸附與晶體的比表面積、晶面電荷、團聚、結晶水數量和pH值有關。本文結果有助于闡明尿液中不同性質微晶與尿蛋白質對草酸鈣結石形成的影響。

        納米;微米;草酸鈣;牛血清白蛋白;吸附等溫線;等電點;pH值

        0 前言

        尿液中存在許多結石抑制因子,如蛋白質和葡胺聚糖等,這些物質可以吸附到草酸鈣晶體表面,封閉晶體表面的生長、聚集位點,從而發(fā)揮其抑制作用。白蛋白是尿液中最豐富的蛋白之一,能降低草酸鈣的飽和程度,抑制大尺寸晶體形成和聚集;同時,白蛋白能夠促進二水草酸鈣(COD)晶體形成,并抑制一水草酸鈣(COM)的生長,這有利于抑制CaOx結石的形成[1]。Liu等[2]發(fā)現(xiàn)牛血清白蛋白不僅能促進COD的形成,還能抑制COM的成核。白蛋白還可以通過吸附到COM表面螺旋位錯的臺階,從而抑制晶體的生長[3]。Grohe等[4]發(fā)現(xiàn)帶負電的弱親水白蛋白可以吸附到尿微晶上,并通過靜電斥力抑制尿微晶的團聚和吸附到腎上皮細胞,這種情況使得晶體更容易被沖出腎小管。可見白蛋白對抑制尿結石的形成有很重要的作用。

        之前的報道注重研究白蛋白對草酸鈣晶體聚集、成核和生長的影響以及蛋白對草酸鈣晶體不同晶面的選擇性吸附差異。例如,F(xiàn)armanesh等[3]通過熒光標記硫酸軟骨素、白蛋白和轉鐵蛋白,發(fā)現(xiàn)這些大分子結合在COM的不同的結晶面,導致晶體的形態(tài)改變。Grohe等[5]利用共聚焦顯微鏡研究了磷酸化多肽與COM晶體的吸附,發(fā)現(xiàn)熒光主要出現(xiàn)在COM的(100)晶面,說明這些多肽優(yōu)先吸附在COM的(100)晶面。Taller等[6]將骨橋蛋白(OPN)先用熒光染料標記,再用激光掃描共聚焦顯微鏡研究這些OPN對COM的特異性吸附,發(fā)現(xiàn)OPN主要吸附在(100)和(121)晶面的邊緣,原因之一是這些邊緣的吸附位點有較高表面能。

        雖然這些文獻報道了尿液蛋白對草酸鈣晶體形貌、晶相的影響以及對晶面的選擇性吸附,但尿液中的蛋白質在不同尺寸、不同晶相的草酸鈣晶體的吸附性質的差異至今未有研究。我們前期的研究表明尿液中存在納米和微米尺寸的COM和COD晶體[7-9],這些尺寸和晶相不同的草酸鈣晶體具有不同的比表面積、不同的ζ電位和不同的聚集狀態(tài)?;诖?,本文研究了尿蛋白在納米、微米COM和COD晶體上的吸附差異,研究了這些晶體的性質(如晶體尺寸、聚集程度、ζ電位、比表面積、晶相等)對蛋白吸附的影響,這有助于闡明尿液中存在的蛋白質和尿微晶性質差異對草酸鈣結石形成的影響。

        1實驗材料與方法

        1.1試劑與儀器

        PBS磷酸鹽緩沖溶液(北京索萊寶科技有限公司),牛血清白蛋白(BSA,Roche,Shanghai,China)。

        Varian Cary 500型紫外可見分光光度計(美國Varian公司)。Zetasizer Nano-ZS型納米粒度儀-Zeta電位分析儀(英國Malvem公司)。數字酸度計(PHS-3C,鄭州寶晶電子科技有限公司)。

        1.2納米/微米COM、COD晶體的合成方法

        參照前文[10]合成尺寸分別約為100 nm和3 μm的COM、COD晶體,并分別用COM-100nm、COD-100nm、COM-3μm、COD-3μm表示。XRD和FTIR表明合成的晶體為純的目標產物。各晶體的比表面(SBET)和孔容通過全自動比表面積及孔隙度分析儀(Tristar 3000,Micromeritics,USA)得到。以He作為載氣,N2為被吸附氣體。儀器對記錄數據分別采用BET方程(Brunauer-Emmett-Teller)和BJH(Barrett-Joyner-Halenda)方法處理,得到晶體的比表面積和孔容值。

        1.3ζ電位測定方法

        參照文獻[11]的方法測量不同pH值下BSA和草酸鈣的ζ電位,通過不同pH值下的ζ電位得到晶體和BSA的等電點。

        (1)取12個小燒杯,分別加入50 mg COM或COD晶體,加入20 mL的蒸餾水溶解,用10 μL微量注射器滴加濃度為0.25 mol·L-1的HCl或NaOH調節(jié)pH值分別至3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和9,搖勻后,取約1 mL懸浮液加入電位池中,測量對應的ζ電位;

        (2)同上面方法,將晶體替換為0.5 mg·mL-1BSA溶液,測量不同pH值下BSA的ζ電位。

        ζ電位的測量是通過測定體系的電泳遷移率,運用Smoluchowski方程計算出ζ電位,Smoluchowski方程如下其中UE是電泳遷移率,ε是介電常數,η是粘度。

        1.4BSA標準曲線測定

        準確稱取100 mg BSA固體,用PBS磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.3±0.1)定容至100 mL,配置成濃度為1 mg·mL-1的BSA標準溶液。于10 mL具塞管中加入不同體積的1 mg·mL-1標準BSA溶液,用PBS定容至10 mL。以PBS溶液為參比,采用分光光度計于280 nm處測定蛋白質溶液的吸光值(A)。以濃度為橫坐標,A為縱坐標,獲得BSA濃度標準曲線,其線性方程為:y=0.717 1x-0.002 1;R2=0.999 2。

        1.5BSA吸附試驗方法

        準確稱取不同質量的BSA固體,用PBS定容至100 mL,配置成濃度(C0)分別為0、2、4、6、8、10、12、15、20、25 mg·mL-1的BSA標準溶液。分別稱取10份50 mg草酸鈣晶體于25 mL燒杯中,分別加入預先配置好的BSA標準溶液10 mL。超聲10 min完全分散后,放入37℃恒溫干燥箱中,吸附24 h后取出離心,取上清液適量測定剩余BSA濃度(Ceq),同時測量懸浮液的ζ電位。根據公式計算出晶體對BSA的吸附量(Qads)。以Ceq為橫坐標,Qads為縱坐標繪制吸附等溫線。

        1.6pH值對吸附的影響

        分別稱取10份50 mg草酸鈣晶體于25 mL燒杯中,分別加入初始濃度(C0)為1.0 mg·mL-1的BSA標準溶液15 mL。超聲10 min完全分散后,用10 μL微量注射器滴加濃度為0.25 mol·L-1的HCl或NaOH調節(jié)pH值分別至3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5和8。放入37℃恒溫干燥箱中,吸附24 h后,取出離心,取上清液適量測定剩余BSA濃度(Ceq)。根據公式計算出晶體對BSA的吸附量(Qads)。以pH值為橫坐標,Qads為縱坐標繪制吸附曲線。

        2 結果與討論

        2.1納米/微米COM和COD晶體對BSA的吸附

        2.1.1吸附等溫線

        納米/微米COM和COD晶體對BSA的吸附等溫線如圖1A所示,BSA的最大吸附量順序為COD-100 nm>COM-100 nm≥COD-3 μm>COM-3 μm,即:納米級晶體的吸附量遠大于微米級的晶體。這是因為納米級晶體的比表面積大于微米級晶體,說明BSA的吸附量與晶體的比表面積成正相關。

        2.1.2表面積歸一化后的吸附等溫線

        為了排除比表面積的影響,比較相同面積時納米/微米COM和COD晶體對BSA的吸附量,對平衡吸附量進行晶體的比表面積歸一化,得到比表面積歸一化的吸附量Qe′(即每平方米晶體面積吸附的BSA質量,Qe′=Qe/SBET),如圖1B所示。可以看出,比表面積歸一化后,BSA的最大吸附量的順序為COD-3 μm>COM-3 μm>COM-100 nm>COD-100 nm,即微米級晶體的吸附量大于納米級的晶體。這與圖1A中結果相反,這歸因于COM和COD晶體在水溶液中會存在聚集現(xiàn)象。用Dratio代表水溶液中的粒徑和單個粒子的直徑之比,Dratio值越大代表粒子聚集越嚴重。在聚合過程中,單個粒子先形成小聚集體,再形成大聚集體。粒子的聚集會導致粒子的間隙關閉(BSA分子無法進入聚集體內部的間隙),因此減少了納米粒子用來吸附的暴露表面[12]。由表1可知,納米級晶體的Dratio比微米級的高很多,說明納米晶體比微米晶體聚集更嚴重。由于BSA分子無法進入聚集體中的間隙,減少了它們用來吸附的暴露表面,因此比表面積歸一化后,納米級晶體吸附量小于微米級晶體。這種差異說明晶體聚集越嚴重,吸附量越小。

        圖1 BSA在納米/微米COM和COD晶體上的吸附等溫線Fig.1 Adsorption isotherms of BSA on micron/nano COM and COD

        表1納米/微米COM、COD的性質Table 1 The properties of m icron/nano COM and COD

        2.1.3COM與COD吸附量的比較

        如圖1A所示,對于相同尺寸的晶體,COD的吸附量大于COM,說明晶體的親水性影響了BSA的吸附。COD比COM多含一個結晶水,水化程度比COM高[13],所以BSA與COD會形成更多的氫鍵。Walton等[14]報道白蛋白在COD的吸附量大于COM是因為白蛋白對COM晶體的面選擇性吸附,主要吸附在COM帶正電荷的(101)晶面。而COD是一個對稱的雙錐體,白蛋白對COD所有的面都有類似的親和力,這導致COD晶體上用于蛋白吸附的位點比COM晶體多。這說明吸附量不僅與晶體的比表面積有關,還與吸附是否存在氫鍵作用有極大的關系。

        比表面積歸一化后,微米級COD的吸附量仍大于COM,但納米級COM的吸附量會稍高于COD晶體。這是因為COM-100nm的ζ電位接近中性(0.17 mV),導致覆蓋在粒子表面的蛋白層密度更高。所以比表面積歸一化后,COM的吸附量會稍高于COD晶體。這與Rezwan等[15]的結果一致,BSA分子與氧化物粒子帶相同或相反電荷時,都會減小覆蓋在粒子表面的BSA密度(即單位面積吸附的BSA質量);只有納米Al2O3粒子電荷接近中性(-0.114 mV),與BSA所帶電荷既不相反也不相同,會增大覆蓋在粒子表面的BSA密度。以上結果表明吸附量與晶面電荷有關。

        COD對BSA的吸附量大于COM,這一結果與表面活性劑的吸附結果相反,因為不同表面活性劑在COM的吸附量常常大于COD[13,16]。這是因為在pH=7時,BSA與晶體的吸附力主要是氫鍵作用,COD晶體的水化程度大于COM晶體,因此,BSA與COD會形成更多的氫鍵,導致COD的吸附量增加。而表面活性劑分子尺寸較小,其與晶體的吸附主要由靜電力主導,表面活性劑吸附在晶體表面帶電荷的位點(如鈣位點和草酸根位點),由于COM表面的這些位點數比COD多[16],所以不同表面活性劑在COM的吸附量大于COD。

        2.1.4吸附等溫線的擬合結果

        吸附模型最常用的是Langmuir模型和Freundlich模型[17]。Langmuir模型假設溶劑吸附可以忽略,吸附質分子(如BSA)以單分子層吸附在吸附劑(如COM、COD)表面的吸附位點,形成凸型吸附等溫線。Freundlich模型表示在低濃度下已被吸附的分子(如BSA)又能吸附在液相中的分子(如BSA,其他分子),形成多分子層吸附,為凹型吸附等溫線。Langmuir模型的線性方程為[12]為平衡時的吸附量,Ce為平衡時的溶液濃度,Q0為吸附劑飽和吸附量,b是Langmuir等溫吸附方程式常數。

        圖2a和圖2c給出了100 nm和3 μm的COM和COD晶體吸附等溫線按照Langmuir模型線性擬合的結果,其相關系數在0.982 3~0.996 4范圍內。

        圖2納米/微米COM和COD對BSA吸附等溫線的擬合結果Fig.2 Fitting results of adsorption isotherms of BSA on micron/nano COM and COD

        可以看出,這4種晶體均很好的擬合了Langmuir模型(圖2a,2c),而與Freundlich模型(圖2b,2d)差異較大,說明BSA在COM和COD晶體上的吸附屬于單分子層吸附。

        2.2吸附BSA后的ζ電位

        為了將吸附行為和ζ電位聯(lián)系起來,在測量吸附等溫線的相同條件下測量了體系的ζ電位(圖3)。隨BSA濃度的增加,納米/微米COM和COD的吸附量增加后(圖1),對應的ζ電位變得更負。

        BSA含607個氨基酸殘基,其等電點為pH= 4.7~4.8[15,19],所以在實驗pH=7.3時BSA帶負電荷,吸附BSA后會使ζ電位變得更負。圖3也進一步驗證了晶體對BSA的吸附。

        納米級晶體對BSA的吸附量大于微米級晶體(圖1),吸附BSA后納米級晶體的ζ本應比微米晶體更負。但是從圖3可知,吸附后納米級晶體和微米級晶體的ζ電位相差不大。這與晶體原始的ζ電位和晶體的孔容有關(表1)。微米級COM和COD晶體的原始ζ電位(分別為-6.95和-15.5 mV)比納米級COM和COD晶體的原始ζ電位(0.17和-2.22 mV)更負,加上納米級晶體的孔容比微米級晶體的大,所以BSA進入納米級晶體孔結構的分子數比微米級晶體的多,導致吸附在表面的BSA分子減少。而ζ電位反映的是晶體的表面電荷[20],當晶體表面的BSA分子減少時,其表面電荷也會隨著降低。所以吸附后,納米級晶體和微米級晶體的ζ電位相差不大。

        圖3納米/微米COM和COD吸附BSA后的ζ電位Fig.3ζ potential of m icron/nano COM and COD after BSA adsorption

        2.3pH值對吸附的影響

        2.3.1不同pH值下晶體的荷電情況和對應的吸附量

        圖4 BSA在納米/微米COM、COD的吸附隨平衡pH的變化及晶體和BSA在不同pH值下ζ電位Fig.4 Change of BSA adsorption quantity and Zeta potential of micron/nano COM and COD crystals with equilibrium pH

        圖4為納米/微米COM、COD和BSA的ζ電位隨pH值的變化及對應4種晶體的BSA吸附量變化,晶體的零ζ電位點(PZCCaOx)和BSA零ζ電位點(PIBSA)如表1所示。COM和COD等電點大小順序為COM-100 nm(7.2)>COD-100 nm(6.7)≥COM-3 μm (4.7)>COD-3 μm(4.3),納米級晶體的等電點遠大于微米級晶體。草酸鈣結石患者的尿液pH值約為6.3[21-22],接近COM-100 nm和COD-100 nm晶體的等電點(分別為7.2和6.7)。在晶體的等電點附近,晶體間的斥力最小,聚集最為嚴重,因此納米晶體的聚集較微米晶體嚴重。研究表明尿微晶通過腎臟的時間只有5~10 min。在滯留時間內,晶體不足以通過成核生長到足夠大的尺寸造成腎臟堵塞。晶體的聚集才是導致尿微晶尺寸迅速增大最為重要的一步[23-24],人體尿液pH值升高時會加重納米級晶體聚集,導致形成結石的幾率增加。

        2.3.2不同pH值下BSA與晶體的相互作用

        蛋白質分子可通過靜電作用與荷電表面結合,通過氫鍵作用與親水表面結合[25]。COM-100 nm和COD-100 nm的最大吸附量在pH=5,而COM-3 μm和COD-3 μm的最大吸附量在pH=4.5,都在實驗測得的BSA的等電點(pH=4.8)附近。Zhang等[26]研究了BSA在4種聚吡咯類吸附劑上的吸附,其最大吸附量在pH=5或4.5處;Alkan等[27]研究了BSA在不同氧化物表面的吸附,其最大吸附量也在約pH為5處。最大吸附量在BSA等電點附近,是因為此時BSA分子顯中性,吸附在晶體表面的BSA分子之間的靜電斥力最小,吸附層最緊湊,所以吸附量最大。

        pH值變化使晶體和BSA荷電性質的改變,影響晶體與BSA分子之間的相互作用,從而影響B(tài)SA的吸附量。以COM-100 nm為例,BSA與COM-100nm在不同pH下的荷電情況及相互作用如圖5所示。BSA與其它3個晶體的相互作用與COM-100 nm相似。

        (1)在pH

        在pH>PZCCaOx(COM晶體的零電荷點)時,隨pH值的升高,晶體和BSA的ζ電位不斷變負(圖5c)。

        上述兩種情況均使得BSA分子之間的靜電排斥和BSA分子與晶體之間的靜電斥力增大,導致吸附量下降。但晶體對BSA分子仍然有明顯的吸附,說明BSA與晶體之間還有其他的作用,如氫鍵和表面配位[26],這些作用力可以部分彌補因靜電斥力增加導致的BSA吸附量減少。

        (2)在PIBSA

        圖5 BSA與納米COM在不同pH下的荷電情況及其相互作用Fig.5 Charged situation of BSA and nano COM and their interaction under different pH

        對于3 μm的COM和COD晶體,晶體的零電荷點就在BSA等電點附近,所以最大吸附量都在pH=4.5處。

        在pH>4.5時,隨著pH值增大,吸附量逐漸下降。這是因為BSA分子帶負電荷,晶體也帶負電荷,晶體與BSA分子的靜電斥力以及BSA分子間的靜電斥力共同導致BSA吸附量下降。

        而在pH<4.5時,隨著pH值減小,吸附量也逐漸下降。這是因為此時BSA分子帶正電荷,晶體也帶正電荷,晶體與BSA分子的靜電斥力以及BSA分子間的靜電斥力共同導致BSA吸附量下降。

        納米、微米COM和COD晶體對BSA的最大吸附量都在實驗測得的BSA的等電點(pH=4.8)附近。在等電點附近,BSA分子顯中性,吸附在晶體表面的BSA分子之間靜電斥力最小,吸附層最緊湊,此時吸附量最大。pH>4.8時,BSA的吸附量隨pH值增大而減小。

        在草酸鈣結石患者尿液環(huán)境下(pH≈6.3),BSA的吸附量小,晶體聚集嚴重,成石風險提高。在pH= 6.3時,BSA分子間靜電斥力和晶體與BSA分子間的靜電斥力,共同作用導致BSA吸附量的下降(圖5b,5c)。

        3 結論

        尺寸分別為100 nm和3 μm的COM和COD晶體對BSA的吸附等溫線很好的擬合了Langmuir模型,表明BSA在納米/微米COM和COD晶體上的吸附屬于單分子層吸附。上述4種晶體對BSA的最大吸附量都在BSA等電點(4.8)附近。吸附BSA后,這些晶體的ζ電位絕對值增加,這有利于抑制晶體的聚集。由于COM和COD等電點(PI)大小順序為COM-100nm(7.2)>COD-100nm(6.7)≥COM-3μm(4.7)>COD-3μm(4.3),表明在草酸鈣結石尿液中(pH≈6.3)納米級晶體團聚較嚴重。BSA的吸附與晶體的比表面積、晶面電荷、團聚以及結晶水的數量密切相關。晶體的比表面積越大、團聚越小,晶面的結晶水數量越多,吸附量越大。當晶面電荷接近中性時,吸附量也會增大。

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        [27]Alkan M,Demirba Doan M,et al.Microporous Mesoporous Mater.,2006,96(1):331-340

        Adsorption Properties of Bovine Serum Album in on M icron/Nano Calcium Oxalate Monohydrate and Dihydrate Crystals

        WEN Xiao-Ling OUYANG Jian-Ming*
        (Institute of Biomineralization and Lithiasis Research,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

        The adsorption isotherms of bovine serum albumin(BSA)on calcium oxalate monohydrate(COM)and calcium oxalate dehydrate(COD)crystals with a size of 100 nm and 3 μm were detected,and Zeta potential of the crystals after adsorption of various concentration of BSA was measured.Adsorption quality change of BSA at different pH value were also measured.Results showed that the adsorption quality of BSA were positively related to the specific surface area of crystals,that was,following the order:COD-100nm>COM-100 nm≥COD-3 μm>COM-3 μm.However,after surface area normalization,the adsorption order was COD-3 μm>COM-3 μm>COM-100 nm>COD-100 nm.It indicated that the crystal water and charge density on crystal surface of COM and COD also affected BSA adsorption.These adsorption isotherms were fitted better with Langmuir model,indicating a monolayer adsorption of BSA on micron/nano COD and COM surface.The isoelectric point of the four crystals followed an order: COM-100 nm(7.2)>COD-100 nm(6.7)≥COM-3 μm(4.7)>COD-3 μm(4.3),which indicated more serious aggregation of nanocrystals under pathophysiological conditions(pH≈6.3).The maximum BSA adsorption occurred at around isoelectric point of BSA(pH=4.8).The adsorption of BSA on micron/nano COM is related to the specific surface area of crystals,its surface charge,crystal aggregation,crystal water number,and the pH value of system.These results can help to clarify the effect of various urine microcrystalline and urine proteins on the formation of CaOxstones.

        nano;micron;calcium oxalate;bovine serum albumin;adsorption isotherms;isoelectric point;pH value

        O614.23+1

        A

        1001-4861(2016)01-0103-08

        10.11862/CJIC.2016.011

        2015-08-10。收修改稿日期:2015-09-27。國家自然科學基金(No.21371077)資助項目。

        *通信聯(lián)系人。E-mail:toyjm@jnu.edu.cn

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