劉宇帥，賀洪娟，吳瓊

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150020；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

Jhdm1d在小鼠胚胎發(fā)育中后期的表達(dá)及表觀調(diào)控研究

劉宇帥1,2,3，賀洪娟3，吳瓊3

（1.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，哈爾濱150010；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150020；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)和免疫組織化學(xué)等技術(shù)，分析了Jhdm1d基因在小鼠胚胎發(fā)育中后期的表達(dá)模式。qRT-PCR結(jié)果顯示，在胚胎發(fā)育中后期，Jhdm1d基因在各組織中的表達(dá)量明顯不同，Jhdm1d在E12.5時(shí)期的腦和肝組織中表達(dá)最高，而在舌和肺組織中表達(dá)最低；在E15.5時(shí)期的肝臟組織中該基因的表達(dá)量最高，在肺和腎組織中的表達(dá)最低；在E18.5時(shí)期各組織中的表達(dá)均普遍較低。同時(shí)利用免疫組織化學(xué)的方法分析其在E15.5時(shí)期的表達(dá)，結(jié)果顯示Jhdm1d在蛋白水平上的表達(dá)與定量結(jié)果基本相符。同時(shí)，亞硫酸氫鹽測(cè)序的結(jié)果說明Jhdm1d的表達(dá)不受甲基化的影響。

Jhdm1d；胚胎發(fā)育；免疫組織化學(xué)；DNA甲基化

自從組蛋白去甲基化酶被發(fā)現(xiàn)以來，便受到越來越多的關(guān)注。迄今為止，已鑒定出來的組蛋白去甲基化酶可以歸為兩類，包括KDM1（賴氨酸去甲基化酶1）蛋白家族和含有典型JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶［1］。許多報(bào)道已證實(shí)組蛋白去甲基化酶可以參與細(xì)胞分化、減數(shù)分裂及器官形成等重要的生物發(fā)育過程。研究報(bào)道，在胚胎干細(xì)胞中敲除Kdm1a基因會(huì)削弱生長和分化過程［2］，甚至將導(dǎo)致早期胚胎的致死［2,3］。一項(xiàng)對(duì)秀麗隱桿線蟲和小鼠減數(shù)分裂過程中組蛋白修飾的研究發(fā)現(xiàn)，減數(shù)分裂前期H3K4me和H3K9me的修飾水平伴隨著染色體配對(duì)、聯(lián)會(huì)以及DNA雙鏈斷裂等動(dòng)態(tài)變化［4］。研究人員發(fā)現(xiàn)H3K4me存在于線蟲常染色體，而在失活的X染色體上不存在H3K4me修飾［5］。人們針對(duì)這些甲基化動(dòng)態(tài)模式，發(fā)現(xiàn)多種靶向H3K4me和K3K9me的酶在減數(shù)分裂中起到重要作用，比如LSD1/KDM1［6］、JARID1/KDM5家族［7］。

Jhdm1d位于小鼠第6號(hào)染色體，編碼一種含有940個(gè)氨基酸并且包含JmjC結(jié)構(gòu)域的組蛋白去甲基化酶，對(duì)H3K9me2和H3K27me2有特異性去甲基化作用，從而參與轉(zhuǎn)錄抑制和染色質(zhì)調(diào)節(jié)過程［8］。研究報(bào)道，在營養(yǎng)缺陷條件下，組蛋白去甲基化酶Jhdm1d能夠通過調(diào)控血管的生成從而抑制腫瘤的生長［9］。目前對(duì)于該基因在小鼠胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式及表觀調(diào)控機(jī)制尚不明確，因此，本課題分別從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平研究了該基因在小鼠胚胎發(fā)育中后期的時(shí)空表達(dá)譜以及表觀調(diào)控機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本課題中所使用的小鼠品系分別為DBA/2J、C57BL/6J、ICR及FVB小鼠，均購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2實(shí)時(shí)定量qRT-PCR

本部分實(shí)驗(yàn)包括總RNA提取、RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA以及實(shí)時(shí)定量qRT-PCR三部分。

總RNA提?。韩@取實(shí)驗(yàn)樣本后，利用RNAisoTM Plus試劑（TaKaRa），根據(jù)試劑盒說明書的操作流程提取RNA。

反轉(zhuǎn)錄：利用M-MLV reverse transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,USA)說明進(jìn)行。

實(shí)時(shí)定量qRT-PCR：利用Perfect Real Time SYBRPremixExTaq TMII試劑盒，依據(jù)說明書提供的操作條件及流程進(jìn)行，分析該基因在小鼠不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。

1.3免疫組織化學(xué)

胚胎樣品的前處理：獲取新鮮的小鼠胚胎樣品于4%多聚甲醛中過夜固定，梯度脫水及透明化處理，多次浸蠟后包埋成塊。

切片、粘片：用石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為10μm左右，于水中將切片展平后放于干凈的多聚賴氨酸載玻片上，42 C雜交爐中干燥過夜。

免疫組化抗體反應(yīng)：在通風(fēng)櫥中利用二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)以及滅活內(nèi)源性過氧化物酶操作，2%BSA/PBS室溫封閉1h，抗體過夜雜交后添加BCIP/NBT發(fā)色液暗處進(jìn)行顯色，經(jīng)脫水、透明化處理后用中性樹脂膠封片，顯微鏡下觀察拍照。

1.4甲基化分析

由于Jhdm1d基因在胚胎各組織中的表達(dá)存在明顯差異，因此利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法對(duì)Jhdm1d基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化模式進(jìn)行分析。

提取小鼠E15.5時(shí)期的腦、舌和肝組織的基因組DNA，然后根據(jù)試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。設(shè)計(jì)甲基化分析用引物，進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，經(jīng)過連接、轉(zhuǎn)化以及藍(lán)白斑抗性篩選后對(duì)陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，利用Axygen試劑盒提取質(zhì)粒。測(cè)序后利用軟件DNAMAN6.0分析。

2　結(jié)果與討論

2.1Jhdm1d在小鼠胚胎發(fā)育中后期各組織中的表達(dá)

選取小鼠E12.5、E15.5和E18.5三個(gè)時(shí)期的胚胎作為研究對(duì)象，分別獲取各時(shí)期的腦、舌、肝臟、肺、心以及腎6個(gè)組織，用qRT-PCR分析Jhdm1d在各組織中的表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，Jhdm1d在E12.5d的小鼠胚胎各組織中持續(xù)表達(dá)，在腦組織中的表達(dá)最高，舌和肺組織表達(dá)最弱，在腦組織中的表達(dá)量約為肺組織的11倍，在肝組織中的表達(dá)量幾乎與腦組織的相同。在E15.5d的胚胎各組織中Jhdm1d基因呈現(xiàn)相對(duì)較高的表達(dá)水平，在肝臟中的表達(dá)最高，在舌、腦和心組織中次之，而在腎和肺組織中的表達(dá)最弱。在E18.5d，Jhdm1d在各組織中的表達(dá)普遍較低。

綜合對(duì)比這三個(gè)時(shí)期的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在各組織中的表達(dá)基本均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，即從E12.5到E15.5逐漸升高，然后從E15.5到E18.5逐漸降低，在E15.5各組織中的表達(dá)基本處于最高水平，舌組織除外。

圖1　qRT-PCR檢測(cè)Jhdm1d基因在E12.5、E15.5和E18.5小鼠胚胎各組織中的表達(dá)Fig.1Jhdm1dexpression in E12.5、E15.5 and E18.5 various organizations of mouse embryos by qRT-PCR

2.2免疫組織化學(xué)分析Jhdm1d在胚胎發(fā)育中期的表達(dá)

E15.5為胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵時(shí)期，隨著發(fā)育的進(jìn)行，此時(shí)的小鼠胚胎大多數(shù)組織器官形態(tài)已基本建成。

圖2　免疫組織化學(xué)檢測(cè)Jhdm1d在小鼠E15.5的表達(dá)Fig.2 Immunohistochemical detection of Jhdm1d expression in mice E15.5

我們選取E15.5d的小鼠胚胎作為實(shí)驗(yàn)材料，利用免疫組化技術(shù)在蛋白水平對(duì)Jhdm1d進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Jhdm1d基因在這個(gè)時(shí)期的蛋白表達(dá)廣泛（圖2）。表達(dá)信號(hào)較強(qiáng)的區(qū)域集中在造血組織、呼吸器官以及內(nèi)分泌器官中。其中在肝臟組織中的表達(dá)最強(qiáng)，說明組蛋白去甲基化酶Jhdm1d在肝中的含量很高。在前腦、心、肺、胸腺、腎、垂體等組織器官中的表達(dá)相對(duì)較強(qiáng)。而在中腦、后腦、脊柱軟骨原基和舌中的表達(dá)則處于一個(gè)相對(duì)較低的水平。綜合來看，Jhdm1d在各組織中的表達(dá)存在明顯差異，而且圖2中的表達(dá)信號(hào)強(qiáng)弱基本與定量qRT-PCR結(jié)果相符。

2.3DNA甲基化對(duì)Jhdm1d基因的表觀遺傳調(diào)控

通過生物信息學(xué)分析，該基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)CpG島，我們選取CpG島中大小為148bp的片段，其中含有12個(gè)CpG位點(diǎn)，為了明確該CpG島是否會(huì)影響Jhdm1d基因的表達(dá)，我們對(duì)該啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行甲基化動(dòng)態(tài)模式分析。亞硫酸氫鹽測(cè)序結(jié)果表明，在小鼠E15.5的各組織中，無論是表達(dá)量高的肝臟組織，還是表達(dá)量較低的腦和舌組織，Jhdm1d基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)均處于低甲基化狀態(tài)（圖3）。說明在小鼠活體各組織中Jhdm1d基因的表達(dá)不受甲基化的調(diào)控。

圖3　小鼠E15.5肝、腦和舌中Jhdm1d基因在其啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化動(dòng)態(tài)Fig.3 Methylation dynamic of Jhdm1d in its promoter region CpG locus in liver,brain and tongue of mice E15.5

3　結(jié)論

通過實(shí)時(shí)定量qRT-PCR和免疫組織化學(xué)等方法對(duì)Jhdm1d基因在小鼠胚胎發(fā)育不同時(shí)期的時(shí)空表達(dá)譜的研究表明，無論在mRNA水平還是在蛋白水平，Jhdm1d基因在小鼠胚胎發(fā)育中后期的腦、心、舌、肺、腎和肝等組織中呈現(xiàn)一種廣泛的表達(dá)模式，并且各組織以及胚胎發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)量存在顯著差異。說明Jhdm1d基因?qū)π∈蟾鹘M織的發(fā)育起重要作用。

在胚胎發(fā)育和分化過程中，由于多種細(xì)胞類型均是從同一個(gè)前體細(xì)胞分化而來，所以嚴(yán)格的基因表達(dá)模式的調(diào)控十分重要［1］。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的一個(gè)重要因素，通?；騿?dòng)子區(qū)的低甲基化與基因表達(dá)相關(guān)。本課題通過亞硫酸氫鹽測(cè)序法初步明確了在E15.5d小鼠胚胎的腦、舌和肝組織中，Jhdm1d基因的表達(dá)不受DNA甲基化的調(diào)控，可能受其他因素的影響，如組蛋白修飾、染色質(zhì)構(gòu)象等，這些仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。組蛋白去甲基化酶的異常通常伴隨疾病的發(fā)生，其中引起基因異常表達(dá)的因素很多，表觀遺傳學(xué)修飾的突變就是很重要的原因之一，因此弄清基因的表觀調(diào)控機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療疾病具有重要意義。

本課題關(guān)于Jhdm1d的研究將有助于我們深入了解組蛋白去甲基化酶中JmjC結(jié)構(gòu)域的作用，同時(shí)也為進(jìn)一步明確Jhdm1d的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

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Study of Expression and Epigenetic Regulation of Jhdm1d in Mouse Mid-later Gestation Period

LIUYu-shuai1,2,3,HE Hong-juan3,WUQiong3
(1.Institute ofAdvanced Technology，HeilongjiangAcademyofSciences,Haerbin 150010,China; 2.Institute ofMicrobiology,HeilongjiangAcademyofSciences,Harbin 150020,China; 3.School oflife science and technology,HIT,Harbin,150080,China)

In this study,we analyzed the expression patterns of Jhdm1d in mouse mid-later gestation period in detail by quantitative real-time PCR(qRT-PCR),and immunohistochemistry(IHC).qRT-PCR results showed that in the mid-later gestation period,the expression of Jhdm1d was significantly different in various tissues.At E12.5,Jhdm1d was expressed abundantly in brain and liver,accompanied by the lowest level in tongue and lung.At E15.5 Jhdm1d was expressed abundantly in liver,with the lowest level in lung and kidney.At E18.5,the expressions of Jhdm1d in various tissues were almost very low.The immunohistochemistry results at E15.5 were consistent with qRT-PCR.The results of bisulfite sequencing demonstrated that Jhdm1d expression was not regulated by DNA methylation.

Jhdm1d;Embryonic development;IHC;DNAmethylation

Q78

A

1674-8646（2016）19-0038-03

2015-08-19

劉宇帥（1988-），女，碩士，助理研究員。