鄭博元, 紀(jì)鋒穎, 侯智善, 孫思明, 孫允陸, 楊蕊竹

(1. 吉林大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院, 集成光電子學(xué)國家重點聯(lián)合實驗室, 長春 130012;2. 青島市疾病預(yù)防控制中心, 青島 266033; 3. 表面物理與化學(xué)重點實驗室, 綿陽 621907)

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生物兼容蛋白水凝膠微圖案的光刻平版印刷

鄭博元1, 紀(jì)鋒穎2, 侯智善1, 孫思明1, 孫允陸1, 楊蕊竹3

(1. 吉林大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院, 集成光電子學(xué)國家重點聯(lián)合實驗室, 長春 130012;2. 青島市疾病預(yù)防控制中心, 青島 266033; 3. 表面物理與化學(xué)重點實驗室, 綿陽 621907)

通過簡易的紫外光刻平版印刷技術(shù), 對無化學(xué)修飾的生物兼容性良好的天然牛白蛋白的水相光刻膠進行微圖案化加工, 獲得了可用作微光柵器件的蛋白質(zhì)微條紋結(jié)構(gòu), 表征了蛋白質(zhì)凝膠微條紋圖案的宏觀性狀. 結(jié)果表明, 其折射散射彩虹色明顯, 單束激光經(jīng)過后的衍射條紋對稱度高, 可獲得11 級衍射條紋. 通過改變參數(shù)實現(xiàn)了條紋的可控褶皺. 將圖案化的蛋白水凝膠膜用于肝癌細胞的培養(yǎng), 實現(xiàn)了細胞圖案化排布.

紫外光刻; 蛋白質(zhì)水凝膠; 微光柵; 生物兼容性; 微褶皺

近年來, 天然生物大分子材料在微納尺度的諸多生物醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域的研究和應(yīng)用中(如微流控[1]、 細胞微龕等)發(fā)揮著越來越重要的作用. 尤其是生物大分子材料與先進的微納加工技術(shù)有機結(jié)合實現(xiàn)了其微納結(jié)構(gòu)化, 在各種交叉領(lǐng)域應(yīng)用中具有獨特用途和巨大潛力. 例如, 利用核糖核酸制備的重金屬離子納米傳感器可被用于重金屬離子(如鉛離子等)的傳感檢測[2]; 利用多肽可以制備生物傳感器[3]; 利用纖維素可制作微納光波導(dǎo)[4]. 生物材料微納圖案化技術(shù)的發(fā)展有助于提高細胞圖案化的可設(shè)計性與簡易性, 從而實現(xiàn)體外控制的細胞片圖案制備和組織甚至器官的人工構(gòu)建. 其中, 蛋白質(zhì)基材料是一大類重要的生物大分子材料, 具有原料來源廣且可再生、 成本低廉、 環(huán)境友好及功能多樣化等優(yōu)勢. 各種蛋白質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同而具有不同的獨特性質(zhì)和功能. 例如, 絲素蛋白具有良好的可調(diào)控機械特性[5], 膠原蛋白具有優(yōu)異的生物兼容性[6], 白蛋白對于環(huán)境信號具有響應(yīng)性質(zhì)[7]等.

通過將先進的微納結(jié)構(gòu)化和加工技術(shù)與蛋白質(zhì)生物材料有機結(jié)合可得到各種微納(特征)尺寸的功能化結(jié)構(gòu)和器件. 微納結(jié)構(gòu)化和加工手段主要分為“自下而上[8]”(如自組裝[9], 礦化[10], 可見光驅(qū)動[11]等)和“自上而下”(如光刻印刷[12～14]、 激光直寫[15～20]、 納米壓印[21]、 3D打印[22]等)兩大類, 由于具有可設(shè)計性、 可控性和重復(fù)性, 其在各種材料體系, 如磁流體材料[23]、 黑硅材料[24]、 超疏水材料[25,26]、 微光學(xué)透鏡[27]、 微流控[28]、 石墨烯氧化物[29,30]等的加工制備中都有著廣泛應(yīng)用. 例如, 利用飛秒激光直寫技術(shù)可制備蛋白質(zhì)基柔性微光學(xué)器件[31,32]. 生物組織中細胞所處微環(huán)境對組織中細胞的排布和生理活動有著至關(guān)重要的影響. 基于紫外光刻等光加工技術(shù)可實現(xiàn)蛋白質(zhì)材料的微納結(jié)構(gòu)化, 進而可在細胞片、 細胞誘導(dǎo)排布等領(lǐng)域得到應(yīng)用. 如絲素蛋白基水相“光刻膠”(化學(xué)修飾有丙烯酸基團)的紫外水相光刻平版印刷已被用于細胞微米級的誘導(dǎo)和圖案化[33].

蛋白材料的紫外光刻多依賴較復(fù)雜的化學(xué)修飾以實現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的光交聯(lián)能力[33], 其操作的復(fù)雜度較高, 并且丙烯酸等可光聚合基團的引入會在一定程度上改變天然蛋白材料原有的生化特性(如等電點和生物兼容性等). 本文直接使用無化學(xué)修飾的天然牛血清白蛋白的水溶液作為水相生物光刻膠, 利用自行搭建的簡易低成本紫外光刻系統(tǒng)實現(xiàn)了蛋白質(zhì)材料的全水相紫外光刻微納圖案化技術(shù); 在研究和優(yōu)化光刻印刷相關(guān)工藝(溶液配比、 曝光程度、 微褶皺控制等)的基礎(chǔ)上, 獲得了高度可設(shè)計的較高質(zhì)量白蛋白基微圖案; 觀察到蛋白質(zhì)微條紋的宏觀彩虹色, 并證明了其可作為優(yōu)良的微光柵器件; 紫外交聯(lián)的蛋白質(zhì)水凝膠具有較好的生物兼容性, 所得蛋白質(zhì)微條紋圖案可用作細胞培養(yǎng)基底, 并初步觀察到其對人肝癌細胞(HepG 2)生長和排布的誘導(dǎo)作用.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白(BSA)和乙醇(體積分數(shù)73%～75%), 國藥集團化學(xué)試劑有限公司; 亞甲基雙丙烯酰胺(分析純), 天津市福晨化學(xué)試劑廠; 二甲基羥基苯乙酮1173(純度97%), 西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司; 杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、 生理鹽水(質(zhì)量分數(shù)0.9%氯化鈉水溶液)、 人肝癌(HepG2)細胞、 10%(體積分數(shù))熱滅活胎牛血清(FBS)、 抗生素(100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素)和多聚甲醛(純度96%), 賽默飛世爾科技(中國)有限公司; 硫化鉛(純度99.999%), 北京百靈威科技有限公司; 超純水(18.2 MΩ·cm, 25 ℃; 水凈化系統(tǒng)購自美國密理博公司).

Motic BA400光學(xué)顯微鏡, 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司; Veeco MultiMode-8原子力顯微鏡(AFM), 布魯克(北京)科技有限公司; JSM-7500F掃描電子顯微鏡(SEM), 日本電子株式會社; AvaSpec-2048x14-USB2光譜儀, 北京愛萬提斯科技有限公司; QL-07W638 638 nm半導(dǎo)體激光器, 東莞市纖綠電子科技有限公司; 120 W紫外燈自行搭建, 光譜見圖1(A), 燈管功率為150 W.

Fig.1 Spectrum of the UV light source(A) and diagram of UV-lithographing protein gratings(B)

1.2 實驗過程

實驗流程如圖1(B)所示. 首先, 將800 mg牛血清白蛋白、 10 mg亞甲基雙丙烯酰胺和40 μL光敏劑二甲基羥基苯乙酮1173加入到2 mL 去離子水中, 配制蛋白質(zhì)基水相光刻膠. 所得光刻膠在4 ℃的避光環(huán)境中保存數(shù)天. 其中, 光敏劑二甲基羥基苯乙酮1173用于誘發(fā)和促進蛋白質(zhì)分子在紫外光曝光下共價交聯(lián). 添加適量亞甲基雙丙烯酰胺作為增交聯(lián)劑以調(diào)控和提高紫外光照射后蛋白質(zhì)水凝膠的交聯(lián)密度.

取適量蛋白質(zhì)水相光刻膠溶液滴加在所需襯底片(玻璃蓋玻片等)上, 在800 r/min的轉(zhuǎn)速下勻膠10 s, 即得到蛋白質(zhì)膜; 將(石英鍍鉻)紫外光刻掩模板壓緊在蛋白薄膜上方, 放置在120 W紫外燈下4 cm處曝光10 min; 將曝光后的樣品浸泡在純水(即顯影液)中10 min后取出; 通過光學(xué)顯微鏡等對蛋白質(zhì)微圖案進行表征.

將所制備的蛋白質(zhì)微圖案用于細胞培養(yǎng)實驗, 從而證實其較好的生物兼容性. 實驗中采用人肝癌細胞. 該細胞株培養(yǎng)在添加有抗生素(100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素)和10%熱滅活胎牛血清的最低必需培養(yǎng)液(杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基)中, 并維持細胞培養(yǎng)所需的37 ℃、 5%二氧化碳的濕潤氣氛. 在蛋白質(zhì)微條紋基底上進行人肝癌細胞培養(yǎng)的實驗步驟如下: (1) 將消毒(紫外曝光或者75%乙醇溶液浸泡1 h)后的制備有蛋白質(zhì)微條紋結(jié)構(gòu)的蓋玻片置于聚乙烯6孔板中, 在孔板中接種細胞懸液(1 mL/Cell); (2) 將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱(37 ℃, 5%CO2)中孵育24 h; (3) 將蛋白質(zhì)微條紋結(jié)構(gòu)樣品取出進行相關(guān)觀察和表征; (4) 將4%(質(zhì)量分數(shù))PbS的多聚甲醛溶液(pH=10)滴加到附著了活細胞的蛋白質(zhì)周期性條紋結(jié)構(gòu)上, 浸泡約0.5 h, 完成細胞的固定.

2 結(jié)果與討論

2.1 周期性蛋白質(zhì)微條紋結(jié)構(gòu)的表征

由圖2(A)～(D)中的光學(xué)顯微鏡照片可見, 所制備的蛋白質(zhì)水凝膠微條紋完整、 清晰, 與掩膜板相符性較好, 表明采用紫外光刻方法可以通過選用相應(yīng)的掩模板、 使用優(yōu)化的加工參數(shù)(蛋白質(zhì)墨水配比、 涂膜轉(zhuǎn)速、 曝光時間等)制備出各種質(zhì)量優(yōu)良的蛋白質(zhì)水凝膠微圖案(如微條紋結(jié)構(gòu)). 圖3(A)～(D)為蛋白質(zhì)水凝膠微條紋結(jié)構(gòu)的宏觀觀測結(jié)果. 可見, 樣品在白光背景下呈現(xiàn)有明顯的彩虹色. 一束波長為638 nm的激光透過蛋白質(zhì)微條紋后, 在后置的屏幕上可得到衍射點陣圖案[圖3(E)]. 衍射點陣圖案對稱性較好, 可觀察到10～11級衍射點, 證明所制備的蛋白質(zhì)微條紋具有很好的周期性結(jié)構(gòu)質(zhì)量, 可以作為微光柵器件使用(衍射級數(shù)達5級即為高質(zhì)量光柵結(jié)構(gòu)).

Fig.2 Optical microscopic images of protein gratingsThe insets are the grating masks for UV-lithographing. Period/μm: (A) 55; (B) 25; (C) 15; (D) 10.

Fig.3 Optical characterization of the micro-gratings(A)—(D) Rainbow images shown by the protein-based micro-patterns under white light source; (E) Protein-based micro-pattern asmicro-grating optical device(diffraction fringes of a 638 nm laser beam). The inset shows the diffractive optical testing system.

由于蛋白質(zhì)中含有不同的氨基酸, 同種氨基酸之間的交聯(lián)又有多種可能性, 同時不同種氨基酸之間也可能發(fā)生各種交聯(lián)反應(yīng), 所以蛋白質(zhì)材料的紫外光交聯(lián)機理相對復(fù)雜[34～36]. 幾乎所有蛋白分子中都存在可發(fā)生光致聚合的殘基, 主要是蛋白分子的各類氨基酸分子(如組氨酸、 酪氨酸、 色氨酸、 半胱氨酸、 甲硫氨酸等). 其在合適的光敏劑輔助下, 吸收光輻射能量后催化產(chǎn)生自由基(或者單線態(tài)氧等氧化性基團), 進而促成了蛋白質(zhì)分子中的還原性基團(酪氨酸、 組氨酸殘基等)的共價交聯(lián). Scheme 1以組氨酸為例示出了紫外光照射下蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈氨基酸殘基幾種可能的交聯(lián)過程. 蛋白質(zhì)分子可以繼承其氨基酸構(gòu)成單元的光交聯(lián)特性, 在紫外光照射下, 輔以掩模板的圖形化, 即可實現(xiàn)蛋白質(zhì)材料的紫外平版微納印刷, 從而按照設(shè)計獲得蛋白質(zhì)水凝膠微圖案.

Scheme 1 Several possible reactions of histidine-involved protein photo-crosslinking

2.2 蛋白質(zhì)微圖案的微觀性狀及調(diào)控

綜合考慮溶液黏稠度、 旋涂成膜厚度、 光刻效果等, 采用優(yōu)化后的微納加工參數(shù)進行紫外光刻(如實驗過程部分所述). 但實驗中通過原子力顯微鏡表征發(fā)現(xiàn): 即便固定使用相同的加工參數(shù), 所得不同間隔的蛋白質(zhì)微條紋結(jié)構(gòu)也會呈現(xiàn)出不同的微納形貌特征. 主要是不同間隔的蛋白質(zhì)微條紋的條紋間隔區(qū)域也有聚合的蛋白膜; 而間隔區(qū)域的蛋白膜又會呈現(xiàn)出不同的微褶皺形貌. 由圖4可以看出, 隨著圖案周期的增大(即條紋間隔變大, 條紋寬度變寬), 中間未曝光空白區(qū)域(對應(yīng)掩模板不透光區(qū)域)的蛋白膜有不同程度和形貌特征的褶皺紋理. 間隔區(qū)域的蛋白膜可能是由于紫外曝光過程中紫外燈產(chǎn)熱引起蛋白質(zhì)一定程度熱固化而形成的. 微褶皺形成的原因可能為: 未曝光部分蛋白質(zhì)膜在浸水顯影過程中, 蛋白質(zhì)凝膠也會發(fā)生吸水膨脹, 產(chǎn)生區(qū)域化應(yīng)力失配, 進而發(fā)生微褶皺現(xiàn)象[37,38]. 這種應(yīng)力的不匹配主要是由于在蛋白質(zhì)水凝膠中的水分變成水蒸汽蒸發(fā)過程中, 蛋白質(zhì)膜表面彎曲與體積收縮之間的競爭造成的[37]. 這種微褶皺的形狀特征和尺寸很大程度上依賴于薄膜區(qū)域的形狀和尺寸. 如圖4(A)～(D)所示, 隨著條紋間隔的增大, 間隔區(qū)域微褶皺在取向上呈現(xiàn)無規(guī)則化, 而在褶皺程度上逐漸加劇.

Fig.4 AFM images of micro-gratingsPeriod/μm: (A) 10; (B) 15; (C) 25; (D) 55.

這一現(xiàn)象的重要意義在于: (1) 較大條紋間隔時相對無序和明顯的微褶皺與很多器官和組織(如血管、 胃、 腸等)的內(nèi)壁微形貌相似, 通過改變周期或間隔, 即應(yīng)力分配單元區(qū)域面積, 可以制備出具有可調(diào)控微褶皺和表面粗糙度的條紋結(jié)構(gòu). 在實現(xiàn)蛋白質(zhì)微圖案的同時使其具有一定程度的仿生化表面微納形貌, 進而有助于其在組織再生、 細胞片制作等領(lǐng)域的可定制應(yīng)用; (2) 通過調(diào)控溶液組分、 加工參數(shù)、 條紋特征尺寸與形狀等因素, 也能夠獲得表面極為光滑(本文實現(xiàn)～1 nm的平均表面粗糙度)的蛋白質(zhì)水凝膠微圖案結(jié)構(gòu), 其質(zhì)量可以滿足光學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用的要求, 從而可以獲得生物聚合物基微光學(xué)器件等功能器件; (3) 這種紫外光刻印刷獲得的蛋白質(zhì)微圖案具有高度可調(diào)控的微形貌, 從而可適用于不同的應(yīng)用場合與設(shè)計目的.

本文確定的較優(yōu)水相蛋白質(zhì)光刻膠的配比: 800 mg牛血清白蛋白+10 mg亞甲基雙丙烯酰胺+40 μL光敏劑二甲基羥基苯乙酮1173+2 mL去離子水. 對于這一溶液配比, 條紋寬度為5 μm的條紋最優(yōu)間隔為10 μm, 即結(jié)構(gòu)周期為15 μm即可獲得表面褶皺充分抑制、 平均表面粗糙度達～1 nm的微圖案. 如圖5所示, 制備出了條紋間距均勻、 表面光滑無褶皺的條紋結(jié)構(gòu). 由于蛋白質(zhì)不是特別設(shè)計的光刻膠材料, 較大劑量紫外交聯(lián)時存在一定熱固化現(xiàn)象, 紫外掩模板遮光部分下也會發(fā)生蛋白固化, 水浸泡顯影過程中的下臺階邊緣易膨脹, 應(yīng)力匹配鈍化, 最終得到如圖5(C)所示連續(xù)波浪線的橫截面形狀.

Fig.5 Smooth protein hydrogel micro-stripe structure via optimized UV-lithographing (A) AFM image of the smooth protein hydrogel micro-structure; (B) AFM 3D profile of the structure in (A);(C) the cross-section profile at position marked by the line in (A).

2.3 細胞培養(yǎng)實驗

Fig.6 Cell micropatterning via the protein microstructures(A), (B) Optical microscopic images of HepG-2 cells cultured on the protein micro-patterns; (C) SEM image of patterned cells on protein microstructures; (D) cross-section SEM image of patterned cells on protein microstructures.

Fig.7 3D AFM profile of a cell guided alongprotein-hydrogel microstruture

將制備的蛋白質(zhì)水凝膠微條紋結(jié)構(gòu)用作細胞培養(yǎng)基板. 如圖6所示, 在48 h細胞培養(yǎng)過程中, 人肝癌細胞能夠正常地在蛋白質(zhì)水凝膠微圖案膜上黏附與生長. 由圖6(A)和(B)中的光學(xué)顯微鏡照片可見, 人肝癌細胞在蛋白質(zhì)周期性微條紋的誘導(dǎo)下, 沿著條紋的方向進行生長和排布. 圖6(C)清楚地顯示出樣品多聚甲醛固定后, 細胞在蛋白質(zhì)微條紋結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)下沿條紋生長和排布的趨勢. 圖6(D)為蛋白質(zhì)微條紋膜的側(cè)面照片, 可見, 制備的蛋白質(zhì)微條紋結(jié)構(gòu)深度差比較小, 但是細胞對于結(jié)構(gòu)圖案很靈敏, 細胞圖案化排布和延伸的趨勢明顯. 圖7為蛋白質(zhì)微條紋上的單個細胞及其延伸部分的AFM照片. 可見, 細胞很明顯地沿著條紋結(jié)構(gòu)進行延伸. 人肝癌細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果證明, 紫外交聯(lián)得到的蛋白水凝膠具有較好的生物兼容性, 可以將水凝膠作為細胞培養(yǎng)的襯底材料, 并且可用于微米尺度的細胞誘導(dǎo)排布和圖案化.

3 結(jié) 論

采用紫外光刻方法對天然蛋白質(zhì)生物大分子材料(以牛血清白蛋白進為例)進行全水相微納光印刷加工, 制備出了圖案可設(shè)計、 形貌可調(diào)控的微圖案結(jié)構(gòu). 表征了蛋白質(zhì)凝膠微條紋圖案的宏觀性狀, 結(jié)果表明, 其折射散射彩虹色明顯, 單束激光經(jīng)過后的衍射條紋對稱度高, 可獲得達11級的衍射條紋. 通過調(diào)整結(jié)構(gòu)周期與條紋間隔, 可以對蛋白質(zhì)微圖案的微納褶皺次級表面結(jié)構(gòu)進行調(diào)控, 獲得可用于組織工程等的不同褶皺程度和粗糙度的仿生表面, 以及高度光滑的高表面質(zhì)量(平均表面粗糙度達1 nm)微光柵器件. 將制備的蛋白質(zhì)水凝膠微條紋結(jié)構(gòu)用作人肝癌細胞的培養(yǎng)基底, 結(jié)果表明, 其具有良好的生物兼容性, 并且初步觀察到其一定的定向誘導(dǎo)排布細胞的能力. 這種蛋白質(zhì)水相紫外光刻印刷技術(shù)可用于制作生物微納光學(xué)器件或系統(tǒng)中的生物聚合物基二維光學(xué)結(jié)構(gòu)或器件, 并在微納尺度生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到應(yīng)用.

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(Ed.: S, Z, M)

? Supported by the National Defense Pre-Research Foundation of China(No.9140c661404030c66278) and the National Natural Science Foundation of China(No.51373064).

Preparation of Biocompatible Protein-hydrogel-based Micro-patternsviaUV Lithography?

ZHENG Boyuan1, JI Fengying2, HOU Zhishan1, SUN Siming1, SUN Yunlu1*, YANG Ruizhu3*

(1.StateKeyLaboratoryofIntegratedOptoelectronics,CollegeofElectronicScienceandEngineering,JilinUniversity,Changchun130012,China;2.QingdaoMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Qingdao266033,China;3.ScienceandTechnologyonSurfacePhysicsandChemistryLaboratory,Mianyang621907,China)

Through facile UV lithography, without chemical modification, biocompatible natural protein-hydrogel-based film and micro-patterns were prepared. The micro-patterns can be used as micro-grating optical devices. Then rainbow feature was observed and diffraction fringe for a 638 nm laser beam was obtained under white light, even with a diffraction level up to 11. Further more, micro-wrinkles could be controlled by changing related parameters. Finally, HepG-2 cells were cultured on the protein micro-patterns and cell micro-patterns were obtained.

UV Lithography; Protein hydrogel; Micro-grating; Bio-compatibility; Micro-wrinkle

10.7503/cjcu20150733

2015-09-21.

日期: 2016-03-22.

國防預(yù)研究基金(批準(zhǔn)號: 9140c661404030c66278)和國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號: 51373064)資助.

O644.11

A

聯(lián)系人簡介: 孫允陸, 男, 博士, 講師, 主要從事微納器件研究. E-mail: sunyunlu825@163.com

楊蕊竹, 女, 博士, 助理研究員, 主要從事微納器件研究. E-mail: jonas_bamboo@126.com