丁吉勇, 沈洪辰, 劉夫鋒

(天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系, 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300072)

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p53突變體Y220C小分子穩(wěn)定劑的虛擬篩選

丁吉勇, 沈洪辰, 劉夫鋒

(天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系, 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300072)

為了獲得p53突變體的穩(wěn)定劑, 依次利用利賓斯基五原則, 通過2次分子對接和全原子分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬從DrugBank 4.0 數(shù)據(jù)庫中篩選獲得了潛在的穩(wěn)定劑他克林. 利用MD模擬進(jìn)一步驗(yàn)證他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和作用. 結(jié)果表明, 他克林能夠緊密結(jié)合到Y(jié)220C突變所形成的疏水空腔之中; 他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的主要作用力為疏水和靜電相互作用, 其中疏水相互作用占主導(dǎo)地位. 此外, 他克林分別與目標(biāo)蛋白質(zhì)的殘基Leu145, Val147和Asp228形成3個(gè)氫鍵. 基于MD模擬軌跡分析了他克林與p53C-Y220C的結(jié)合過程. 由硫黃素T熒光光譜進(jìn)一步證明他克林能夠提高p53C-Y220C突變體的穩(wěn)定性.

癌癥; 蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑; 分子對接; 分子動(dòng)力學(xué)模擬; p53; 他克林

p53是一種重要的腫瘤抑制蛋白質(zhì), 具有阻滯腫瘤細(xì)胞生長、 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成等多種生物學(xué)功能[1]. p53含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域, 分別為N末端反式激活結(jié)構(gòu)域、 脯氨酸富集域、 核心DNA結(jié)合域、 四聚體區(qū)域和C末端區(qū)域. p53共含有393個(gè)氨基酸, 其中94～292位氨基酸為該蛋白質(zhì)的核心結(jié)構(gòu)域, 被定義為p53C. 據(jù)統(tǒng)計(jì), 約50%的人類癌癥是由p53突變引起的[2,3]. 其中大多數(shù)突變位于p53C結(jié)構(gòu)域, 如Y220C, R248Q, R248W, R273H, R273C, R175H, G245S, R249S 和R282H(詳細(xì)信息可查閱數(shù)據(jù)庫http: //www-p53.iarc.fr). 當(dāng)然, 除了上述常見的突變位點(diǎn)外, 在p53的C或N末端結(jié)構(gòu)域也會(huì)發(fā)生一些突變, 如R337H[4].

野生型p53C的穩(wěn)定性很差, 其熔解溫度約為44 ℃, 在體溫環(huán)境下該蛋白質(zhì)的半衰期約為9 min[5]. 而突變會(huì)進(jìn)一步降低p53C的穩(wěn)定性, 加速其變性及聚集沉淀, 從而阻礙其抑癌功能的發(fā)揮, 同時(shí)還會(huì)大大增強(qiáng)腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲能力. 因此, 開發(fā)能夠提高p53突變體穩(wěn)定性的藥物是一個(gè)有效的治療癌癥方法. 但大多數(shù)p53的突變位于DNA結(jié)合域, 穩(wěn)定劑結(jié)合到該部位可能會(huì)阻礙p53與DNA結(jié)合, 從而嚴(yán)重影響p53的抑癌功能. 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì), 在最易引發(fā)癌癥的p53突變體中, Y220C突變體排在第9位. 全世界每年約7.5萬例癌癥是由Y220C突變所引起的[6]. 因此, 設(shè)計(jì)p53C-Y220C突變體的穩(wěn)定劑迫在眉睫. p53C-Y220C突變體的二級結(jié)構(gòu)見圖S1(見本文支持信息). 位于S3/S4環(huán)和S7/S8環(huán)之間的220位酪氨酸突變成半胱氨酸會(huì)在p53表面形成一個(gè)疏水空腔[本文支持信息中圖S2(B)所示], 而Cys220位于該空腔底部. 研究表明該突變會(huì)大大降低p53的穩(wěn)定性, 從而引發(fā)p53的變性和聚集沉淀. Wang等[7]發(fā)現(xiàn)p53C-Y220C聚集形成淀粉樣纖維可以結(jié)合硫黃素T(ThT)分子而產(chǎn)生熒光. 另外, Y220C突變所形成的疏水腔遠(yuǎn)離DNA結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域, 因此Y220C突變體所形成的疏水性口袋就成為最理想穩(wěn)定劑的作用位點(diǎn). 即基于此疏水腔設(shè)計(jì)獲得的穩(wěn)定劑不會(huì)影響p53與DNA的結(jié)合, 也就不會(huì)影響其抑癌能力.

目前, 已開發(fā)出多種分子(有機(jī)小分子[8,9]和短肽[10]等)來提高p53C突變體的穩(wěn)定性. Boeckler等[11]利用虛擬篩選技術(shù)從Zinc數(shù)據(jù)庫中篩選獲得了與p53C突變體Y220C具有較高親和力的PhiKan083分子, 該分子能夠大大提高該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性. Wassman等[12]利用分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬發(fā)現(xiàn)了瞬時(shí)開關(guān)的L1/L3結(jié)合位點(diǎn), 基于該結(jié)合位點(diǎn)篩選獲得了p53突變體R175H的穩(wěn)定劑斑點(diǎn)酸, 結(jié)果表明該分子能夠激活p53的抑癌功能, 從而能夠有效抑制人骨肉癌的發(fā)生和發(fā)展. 雖然已有多種分子被開發(fā)用于提高p53C突變體的穩(wěn)定性, 但至今仍無有效的穩(wěn)定劑可用于癌癥的治療. 因此亟需開發(fā)新型的小分子來提高p53C的穩(wěn)定性.

基于結(jié)構(gòu)的藥物分子篩選需要構(gòu)建或選擇現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫, DrugBank 4.0是收錄FDA批準(zhǔn)和臨床研究階段的藥物分子的數(shù)據(jù)庫[13]. 從該數(shù)據(jù)庫篩選獲得的穩(wěn)定劑分子均可直接作為藥物用于p53突變所引起的癌癥治療. 因此, 為了獲得能夠提高p53C-Y220C熱穩(wěn)定性的藥物分子, 本文選擇DrugBank 4.0數(shù)據(jù)庫中的小分子, 根據(jù)利賓斯基五原則篩選, 利用2次分子對接虛擬篩選找到能夠結(jié)合到p53C-Y220C疏水腔中的小分子. 然后利用MD模擬驗(yàn)證了這些小分子與目標(biāo)蛋白之間的親和力. 分析了他克林和p53C-Y220C突變體之間的親和作用機(jī)理以及他克林穩(wěn)定p53C-Y220C的作用過程. 利用硫黃素T(ThT)熒光光譜驗(yàn)證了他克林對突變體p53C-Y220C的穩(wěn)定作用.

1 計(jì)算方法

1.1 分子對接

p53C-Y220C(PDB ID: 2J1X)的初始結(jié)構(gòu)選自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein data bank, PDB)(http: //www.rcsb.org/pdb/)[6]. 利用AutoDockTools 1.5.6 軟件對p53C-Y220C分別添加氫原子和Kollman電荷. 在分子對接之前, 首先利用DrugBank 4.0數(shù)據(jù)庫提供的利賓斯基五原則(Lipinski’s rule of five)進(jìn)行篩選. 然后利用AutoDockTools 1.5.6軟件給這些小分子添加Gasteiger電荷后轉(zhuǎn)化為用于AutoDock Vina分子對接所需的pdbqt格式文件[14]. 利用AutoDock Vina 1.1.2程序?qū)π》肿优c目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行第一次分子對接. 小分子和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和作用力通過EVINA計(jì)算, EVINA絕對值越大表明它們之間的親和力越大.

為了進(jìn)一步降低利用分子對接進(jìn)行虛擬篩選的誤差, 本文利用另一個(gè)常用的分子對接軟件FlexX進(jìn)行了第二次分子對接, FlexX軟件采用片段生長算法, 它充分考慮了小分子配基的柔性, 將蛋白質(zhì)看成剛性[15]. 然后利用SYBYL6.92軟件中5種打分函數(shù)F_Score, ChemScore, D_Score, G_Score和PMF_Score來評價(jià)配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間親和作用力的大小, 其余均采用FlexX的默認(rèn)值.

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬過程中用到的小分子Gromos96力場結(jié)構(gòu)參數(shù)利用PRODRG2服務(wù)器網(wǎng)站(http: //davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgi-bin/prodrg)構(gòu)建[16]. 基于Gromos96全原子力場修正小分子的力場參數(shù)[17]. 所有的MD模擬均利用GROMACS 4.5軟件進(jìn)行[18]. 水分子選用SPC模型. p53C-Y220C與小分子復(fù)合物的MD模擬分別在310 K或 317 K下進(jìn)行. 利用蛙跳算法對每一步的運(yùn)動(dòng)方程積分求解, 積分步長為2 fs. 采用PME方法計(jì)算長程靜電相互作用[19], 傅里葉格點(diǎn)間距為0.12 nm, 庫侖截?cái)嗑嚯x為0.9 nm, 非鍵作用原子列表每4個(gè)步長更新1次. 短程范德華作用力的截?cái)嘀禐?.4 nm. 利用LINCS算法限制所有化學(xué)鍵[20]. 模擬體系中各原子的初速度利用Maxwell分布隨機(jī)指定. 首先將小分子-蛋白質(zhì)復(fù)合物置于一個(gè)具備周期性邊界條件的正方體盒子(8 nm×8 nm×8 nm)中, 然后在盒子中隨機(jī)地加入水分子, 隨后加入5個(gè)Cl-代替等量的水分子使模擬體系處于一個(gè)中性環(huán)境. 經(jīng)過1000步的能量最小化之后, 利用Berendsen弱耦合方法[21]分別在正則系綜(NVT)和等溫-等壓系綜(NPT)下進(jìn)行200 ps的MD模擬來平衡模擬體系. 最后, 在NPT系綜下進(jìn)行100 ns的MD模擬, 模擬系統(tǒng)的溫度和壓力分別利用 V-rescale[22]和Berendsen[21]算法控制. 在計(jì)算過程中, 每隔2 ps存儲(chǔ)一次各原子的坐標(biāo), 共存儲(chǔ)50000個(gè)軌跡進(jìn)行后續(xù)分析. 所有MD模擬計(jì)算均在曙光TC2600刀片服務(wù)器集群上完成.

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

通過GROMACS 4.5軟件包中的一些輔助程序分析模擬軌跡. 配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的能量采用GROMACS 4.5自帶命令g_energy進(jìn)行分析, g_mindist命令計(jì)算指定分子與特定距離之內(nèi)的殘基之間的接觸數(shù)和該分子與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的距離. 根據(jù)p53C-Y220C和小分子復(fù)合物之間的勢能大小來選擇最佳構(gòu)象, 并使用視覺分子動(dòng)力學(xué)(VMD)軟件[23](http: //www. ks.uiuc.edu/Research/vmd/) 繪制復(fù)合物的構(gòu)象圖.

1.4 p53C-Y220C蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化

含有p53C-Y220C基因片段的重組質(zhì)粒由金唯智公司提供, 將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3) 中獲得能夠進(jìn)行外源表達(dá)p53C-Y220C的基因重組菌, 然后在37 ℃, 220 r/min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至菌液的OD600值為1.2左右, 然后加入1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷, 在25 ℃下繼續(xù)誘導(dǎo), 獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的發(fā)酵液. 然后在4 ℃, 220 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min獲得菌體, 破碎后離心收集細(xì)胞上清液, 分別利用陽離子交換和肝素親和色譜分離獲得高純度的p53C-Y220C蛋白質(zhì)用于ThT熒光光譜實(shí)驗(yàn).

1.5 硫黃素T熒光光譜實(shí)驗(yàn)

使用20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液配制濃度為20 μmol/L的ThT溶液. 分別取200 μL 培養(yǎng)好的含與不含他克林的p53C-Y220C蛋白質(zhì)培養(yǎng)液(蛋白質(zhì)濃度為5 μmol/L), 加入2 mL 20 μmol/L ThT溶液, 混合, 然后在Infinite M200 PRO多功能酶標(biāo)儀上檢測溶液的ThT熒光值. 激發(fā)波長為440 nm, 發(fā)射波長為480 nm. 每個(gè)樣品掃描3次, 將每次所得掃描數(shù)據(jù)減去不含目標(biāo)蛋白質(zhì)的緩沖液背景后作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 計(jì)算平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 p53C突變體Y220C穩(wěn)定劑的虛擬篩選

Fig.1 Procedure of virtual screening

Fig.2 Binding affinity distribution of these small molecules and Y220C mutant of p53C analyzed by AutoDock Vina

從DrugBank 4.0數(shù)據(jù)庫中選擇7469個(gè)分子作為潛在的穩(wěn)定劑, 考慮到p53C-Y220C表面的疏水腔很小, 因此穩(wěn)定劑的分子量不能太大. Boeckler等[11]首先利用利賓斯基五原則篩選了Zinc數(shù)據(jù)庫, 然后利用藥效團(tuán)模型和分子對接虛擬篩選獲得了能夠提高p53C-Y220C突變體的穩(wěn)定劑PhiKan083. 因此, 我們首先利用DrugBank 4.0網(wǎng)站(http: //www.drugbank.ca/)[13]提供的利賓斯基五原則篩選獲得了353個(gè)候選小分子(圖1). 然后利用AutoDock Vina將這353個(gè)小分子分別與p53C-Y220C的空腔進(jìn)行分子對接. 圖2為353個(gè)小分子的親和力(binding affinity)分布, 其中親和力≤-25.1 kJ/mol的小分子共有99個(gè). 而乙酰膽堿酯酶抑制劑他克林(Tacrine)(ID: DB00382)、 瑞莫必利(ID: DB00409)和2-Amino-6-Aminomethyl-8-Phenylsulfanylmethyl-3h-Quinazolin-4-One(ID: DB04239)與p53C-Y220C的親和力最小(≤-33.5 kJ/mol).

現(xiàn)有的分子對接軟件在構(gòu)象搜索和對配基-目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和性評價(jià)時(shí)均存在優(yōu)缺點(diǎn)[24,25], 從而造成僅利用單個(gè)分子對接軟件進(jìn)行虛擬篩選很容易引入較大的誤差. 目前常用的解決辦法是利用一種或多種分子對接軟件進(jìn)行虛擬篩選, 然后基于多種打分函數(shù)結(jié)果來綜合評估配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和作用力. 首先需要選取能夠?qū)σ阎€(wěn)定劑進(jìn)行有效篩選的打分函數(shù). 采用打分函數(shù)對已知穩(wěn)定劑的富集率來考察這些打分函數(shù), 并優(yōu)先從數(shù)據(jù)庫中篩選出已知穩(wěn)定劑的性能[26,27]. 首先查找文獻(xiàn)獲得10個(gè)能夠穩(wěn)定結(jié)合到Y(jié)220C突變所導(dǎo)致的結(jié)合腔中的化合物(表S1, 見本文支持信息), 然后利用FlexX軟件將這10個(gè)穩(wěn)定劑和利用AutoDock Vina計(jì)算的結(jié)合自由能≤-25.1 kJ/mol的99個(gè)潛在的穩(wěn)定劑分別與p53C-Y220C對接, 然后基于SYBYL所帶的5種打分函數(shù)F_Score, ChemScore, D_Score, G_Score和PMF_Score來評價(jià)小分子和p53C-Y220C之間的親和力.

Fig.3 Enrichment curve analysis of the fivescoring functions in FlexXa. Random; b. F_Score; c. ChemScore; d. D_Score; e. G_Score; f. PMF_Score. A diagonal represents a random selection. Curves above the diagonal represent the corresponding scoring functions can select the known stabilizers from the library of small molecular compounds.

圖3為已知10個(gè)穩(wěn)定劑和99個(gè)潛在的穩(wěn)定劑分子與p53C-Y220C對接結(jié)果的打分函數(shù)富集曲線. 從圖3可以看出, 只有F_Score, ChemScore和D_Score 3種打分函數(shù)對已知的10種穩(wěn)定劑有富集效果, 而另外2種打分函數(shù)G_Score和PMF_Score不能有效地從現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫中將已知的穩(wěn)定劑篩選出來. 因此, 第2次分子對接僅考慮F_Score, ChemScore和D_Score這3種打分函數(shù)的結(jié)果. 另外, 從圖3可以清晰地看出, 當(dāng)選用top 10%作為選擇標(biāo)準(zhǔn)時(shí), F_Score和ChemScore均能篩選出30%的穩(wěn)定劑分子, 而使用D_Score更能獲得高達(dá)50%的穩(wěn)定劑分子. 因此, 本研究選擇這3種打分函數(shù)的top 10%作為p53C-Y220C穩(wěn)定劑的篩選標(biāo)準(zhǔn). 即候選分子均排在這3種打分函數(shù)前10名之內(nèi)才能作為p53C-Y220C的穩(wěn)定劑. 表S2(見本文支持信息)列出利用3種打分函數(shù)計(jì)算得到的前10名的分子. 可以看出, 只有他克林(ID: DB00382)在這3種打分函數(shù)的排名中均進(jìn)入前10. 因此, 他克林作為潛在的穩(wěn)定劑用于后續(xù)研究. 而利用AutoDock Vina軟件篩選中獲得的另外2個(gè)親和能力<8.0的分子瑞莫必利和2-Amino-6-Aminomethyl-8-Phenylsulfanylmethyl-3h-Quinazolin-4-One卻不能滿足上述篩選條件.

2.2 小分子與p53C突變體Y220C蛋白質(zhì)復(fù)合物親和性的分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證

大量研究[28～32]表明, 僅利用分子對接篩選配基會(huì)存在大量的假陽性和假陰性結(jié)果. 這主要是由分子對接方法的缺陷所致: (1) 僅考慮配基的柔性, 而將目標(biāo)蛋白質(zhì)看作剛性; (2) 在計(jì)算配基-目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和作用過程中沒有考慮溶劑化效應(yīng)對配基-目標(biāo)蛋白質(zhì)之間親和力的影響. 上述缺點(diǎn)決定了僅利用分子對接來篩選較高親和性的分子會(huì)帶來很大誤差. 為了很好地彌補(bǔ)分子對接的上述缺點(diǎn), 本文利用全原子MD模擬來進(jìn)一步驗(yàn)證利用分子對接篩選獲得的小分子和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和力[25,33～35]. 由于利用AutoDock Vina軟件虛擬篩選得到的瑞莫必利和2-Amino-6-Aminomethyl-8-Phenylsulfanylmethyl-3h-Quinazolin-4-One與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和力遠(yuǎn)強(qiáng)于他克林, 但這2個(gè)分子卻不能被F_Score, ChemScore和D_Score 3種打分函數(shù)所富集. 因此, 我們也利用MD模擬進(jìn)一步驗(yàn)證了瑞莫必利和2-Amino-6-Aminomethyl-8-Phenylsulfanylmethyl-3h-Quinazolin-4-One與p53C-Y220C之間的親和力.

圖4(A)和(B)所示分別為分子對接(即MD模擬起始階段的構(gòu)象)和100 ns MD模擬后3個(gè)小分子和p53C-Y220C疏水腔的結(jié)合位置. 由圖4(B)可見, 在100 ns MD模擬時(shí)間內(nèi), 只有他克林分子一直穩(wěn)定結(jié)合在蛋白表面疏水空腔內(nèi). 通過比較100 ns MD模擬前后的構(gòu)象可以看出, 他克林分子和p53-Y220C結(jié)合位置發(fā)生了改變. 他克林分子從疏水腔的表面移到疏水腔內(nèi)部. 與之相反, 另外2個(gè)分子在100 ns MD模擬過程中均不能結(jié)合在這個(gè)疏水腔內(nèi). 瑞莫必利分子從3 ns后就從疏水腔中游離出來, 并在隨后的模擬時(shí)間內(nèi)沒有結(jié)合到目標(biāo)蛋白的任何部位[圖4(B)]. 而DB04239分子從疏水空腔中慢慢移出而結(jié)合到了目標(biāo)蛋白質(zhì)的其它部位[圖4(B)]. 模擬結(jié)果說明, DB04239分子與Y220C突變所形成的疏水腔之間的親和性并不強(qiáng), 而瑞莫必利分子則與疏水腔完全沒有親和性. 只有他克林與Y220C所形成的疏水空腔有較強(qiáng)的親和作用. 進(jìn)一步證明僅利用AutoDock Vina和該軟件自帶的打分函數(shù)進(jìn)行親和配基篩選具有很大的誤差, 而基于多種打分函數(shù)結(jié)果的富集率進(jìn)行虛擬篩選數(shù)據(jù)庫可以較好的彌補(bǔ)上述缺點(diǎn).

Fig.4 Comparison of binding sites of the 3 compounds on p53C mutant Y220C before and after MD simulations (A) Binding models obtained by docking(i.e., initial binding conformations in MD simulation); (B) binding models obtainedafter 100 ns MD simulations.

2.3 他克林與p53C-Y220C蛋白之間親和作用力分析

Fig.5 Time-dependent Coulomb(A) and LJ(B) potential energy of tacrine- p53C-Y200C

Fig.6 Snapshot of the hydrogen bonds betweentacrine and the residues of p53C-Y220CHydrogen bonds between tacrine and the residues Leu145, Val147 and Asp228 of p53C-Y220C are shown in black dotted lines. The residue type and its sequence number which interacted with tacrine via hydrogen bonds are also shown.

利用g_energy計(jì)算了他克林和p53C-Y220C之間的庫侖(Coulomb)和LJ勢能, 并示于圖5. 其中, Coulomb和LJ勢能分別代表他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的靜電和疏水相互作用. 勢能的數(shù)值越低, 表示配基-目標(biāo)蛋白質(zhì)之間相應(yīng)的作用力越強(qiáng). 從圖5可見, 他克林與目標(biāo)蛋白之間Coulomb和LJ勢能的變化趨勢基本一致. 在初始的10 ns內(nèi), 他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的Coulomb和LJ勢能均發(fā)生急劇變化. 他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的Coulomb勢能從0急劇降低到-40 kJ/mol左右, 并在隨后的90 ns內(nèi)基本穩(wěn)定在-50 kJ/mol. 雖然在初始的10 ns內(nèi), LJ勢能的變化趨勢和Coulomb勢能類似, 但在最后90 ns內(nèi), 他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的LJ勢能降低到-110 kJ/mol. 即他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的疏水作用力是其靜電作用力的2倍. 因此, 他克林和p53C突變體Y220C之間的作用力主要為疏水和靜電相互作用, 疏水相互作用占主導(dǎo)地位.

根據(jù)MD模擬獲得的他克林和p53C-Y220C復(fù)合物的典型構(gòu)象, 計(jì)算得出他克林和p53C-Y220C之間的氫鍵, 如圖6所示. 從圖6可見, 他克林與疏水空腔周圍的3個(gè)氨基酸殘基形成3個(gè)氫鍵, 從而使小分子穩(wěn)定地結(jié)合在這個(gè)空腔內(nèi). 可以看出, 他克林的氨基基團(tuán)作為氫供體, 它上面的氫原子可以分別與Leu147和Asp228肽鍵上的氧原子形成2個(gè)氫鍵. 同時(shí), 他克林上的氮原子也可以接受Val145肽鍵上-NH基團(tuán)的氫原子而形成另外1個(gè)氫鍵.

2.4 他克林與p53C突變體Y220C疏水腔的結(jié)合過程分析

Fig.7 Time-dependent contact number between the tacrine and Y220C mutant of p53C

計(jì)算了他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的接觸數(shù)隨模擬時(shí)間的變化(圖7). 從圖7可見, 在MD模擬的初始8 ns內(nèi), 他克林與p53C-Y220C之間接觸數(shù)比較小(<40), 此時(shí)他克林僅有一部分與p53C-Y220C結(jié)合, 而另一部分暴露在疏水腔外(圖8). 在初始的8 ns模擬時(shí)間內(nèi), 他克林與目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合構(gòu)象與分子對接所獲得構(gòu)象類似. 隨著模擬的進(jìn)行, 如圖8中8 ns典型構(gòu)象所示, S3/S4環(huán)與S7/S8環(huán)之間的狹縫發(fā)生結(jié)構(gòu)微調(diào), 從而使他克林分子逐漸向這個(gè)縫隙中移動(dòng). 與此同時(shí),他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的接觸數(shù)急劇上升(圖7). 為了與目標(biāo)蛋白質(zhì)發(fā)生親和作用, 他克林在結(jié)合蛋白過程中的構(gòu)象不斷調(diào)整. 經(jīng)過10 ns MD模擬, 他克林平行結(jié)合到Y(jié)220C的S3/S4環(huán)與S7/S8環(huán)所形成的縫隙中(圖8). 在隨后的MD模擬過程中, 他克林分子豎直插入到這個(gè)空腔, 整個(gè)小分子被Y220C突變所形成的空腔所包裹(圖8). 此時(shí), 蛋白質(zhì)-小分子之間的接觸數(shù)達(dá)到最大(圖7). 在隨后的90 ns內(nèi), 他克林均穩(wěn)定地結(jié)合在目標(biāo)蛋白Y220C突變所形成的空腔內(nèi), 接觸數(shù)也相對穩(wěn)定(圖7). 這進(jìn)一步說明他克林和p53C-Y220C之間具有非常強(qiáng)的親和作用.

Fig.8 Representative conformations of tacrine and p53C-Y220C complex during the 100 ns MD simulations

圖9所示為100 ns MD模擬后的他克林分子結(jié)合到p53C突變體Y220C疏水空腔中的示意圖. 可以看出, 在他克林結(jié)合到p53C-Y220C突變所形成的疏水空腔后, 對L7/L8環(huán)的結(jié)構(gòu)和位置造成很大的影響. 由于他克林主要通過疏水和靜電作用力(包括氫鍵)與S3/S4環(huán)和L7/L8環(huán)上的氨基酸殘基發(fā)生相互作用, 在他克林分子的介導(dǎo)作用下, S7/S8環(huán)逐漸靠近S3/S4環(huán)[圖9(A)], 從而使p53C-Y220C突變體表面的疏水腔的容積逐漸減小, 由原先的打開狀態(tài)變成了一個(gè)閉合的狀態(tài)[圖9(B)]. 從而使目標(biāo)蛋白質(zhì)表面Y220C的附近僅剩一個(gè)很小的空腔, 而他克林分子恰好位于突變產(chǎn)生的空腔中(圖9). 因此, 他克林分子結(jié)合到這個(gè)空腔中, 提高了p53C-Y220C突變體的穩(wěn)定性. 此外, 利用MD模擬研究了他克林和p53C-Y220C復(fù)合物在44 ℃的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性. 在折疊和去折疊過程中, 常用Cα原子的均方根偏差(RMSD)的數(shù)值來表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)的變化[36,37]. 本研究也選擇了Cα原子的RMSD來表示目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)之間的差別, 即RMSD值越大表示目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)差別越大. 圖S3(見本文支持信息)列出了p53C-Y220C的Cα原子的RMSD值隨模擬時(shí)間的變化. 可以看出, 結(jié)合他克林的p53C-Y220C的Cα的RMSD值平衡后基本維持在0.4 nm左右, 遠(yuǎn)低于不含他克林的目標(biāo)蛋白質(zhì)的Cα的RMSD值(0.6 nm). 由于目標(biāo)蛋白質(zhì)p53C-Y220C的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差, 在44 ℃下很快就發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換, 從而使目標(biāo)蛋白質(zhì)的RMSD變化較大. 由于他克林對于目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的穩(wěn)定作用, 從而使目標(biāo)蛋白質(zhì)不容易發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換, 因此該蛋白質(zhì)的RMSD值變化較小. 這也進(jìn)一步證明了他克林確實(shí)能夠穩(wěn)定p53C-Y220C的結(jié)構(gòu).

2.5 他克林提高p53C突變體Y220C穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

Fig.10 Effect of different concentrations of tarcrine on p53C-Y220C aggregation measured by ThT fluorescence The concentration of p53C-Y220C was 5 μmol/L.

研究表明, Y220C突變會(huì)進(jìn)一步降低p53C的穩(wěn)定性, 從而加速p53C-Y220C突變體聚集形成淀粉樣纖維[7]. 由于這些淀粉樣纖維中含有的大量β-折疊片能夠特異地結(jié)合ThT而發(fā)熒光, 因此ThT熒光實(shí)驗(yàn)常被用于定量檢測p53C-Y220C突變體的聚集程度[38]. 而由于p53C-Y220C的聚集沉淀是由其穩(wěn)定性降低所引起的, 因此利用ThT熒光實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證他克林能否提高p53C突變體Y220C的穩(wěn)定性. 首先利用大腸桿菌表達(dá)并依次通過陽離子交換色譜和肝素親和色譜分離獲得了p53C-Y220C蛋白質(zhì). 然后利用ThT熒光實(shí)驗(yàn)表征他克林抑制p53C-Y220C聚集的影響, 結(jié)果如圖10所示.

當(dāng)不含他克林分子時(shí), ThT熒光強(qiáng)度在20 min內(nèi)從初始的3000左右急劇增加到18600, 并經(jīng)過緩慢增長期后到達(dá)平穩(wěn)期, 其ThT熒光強(qiáng)度基本保持在21000左右. 在5 μmol/L他克林存在下, 在聚集初始的20 min內(nèi)ThT熒光強(qiáng)度明顯低于純p53C-Y220C, 但最終的ThT熒光強(qiáng)度僅稍低于純p53C-Y220C聚集體的ThT熒光強(qiáng)度. 即5 μmol/L他克林僅能夠延緩p53C-Y220C的聚集, 并不能減少最終成熟纖維體的形成. 在10 μmol/L他克林存在下, 他克林表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制效果. 表明他克林不僅極大地延緩p53C-Y220C的聚集速度而且極大地減少了成熟纖維的形成量. 因此, 他克林能夠提高p53C-Y220C的穩(wěn)定性, 從而抑制p53C-Y220C的聚集, 且他克林提高p53C-Y220C穩(wěn)定性的能力與其濃度密切相關(guān). 這與常見的淀粉樣蛋白質(zhì)的聚集抑制劑是相同的[39,40].

3 結(jié) 論

基于利賓斯基五原則從DrugBank 4.0數(shù)據(jù)庫中篩選獲得了353個(gè)潛在的p53C-Y220C的穩(wěn)定劑, 利用AutoDock Vina分子對接軟件篩選獲得了99個(gè)親和力≤-25.1 kJ/mol的穩(wěn)定劑分子. 利用FlexX軟件結(jié)合5種打分函數(shù)篩選獲得了p53C-Y220C的穩(wěn)定劑他克林分子, 并利用全原子MD模擬進(jìn)一步驗(yàn)證了他克林與p53C-Y220C之間的親和性. 發(fā)現(xiàn)他克林分子能夠穩(wěn)定結(jié)合到Y(jié)220C所形成的疏水空腔中. 他克林和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的親和作用力主要為疏水和靜電相互作用, 而疏水相互作用占主導(dǎo)地位. 此外, 他克林還與p53C突變體Y220C疏水腔周圍的3個(gè)殘基Leu145, Val147和Asp228形成氫鍵作用. 在他克林和疏水腔周圍殘基之間的相互作用下, S7/S8環(huán)逐漸靠近S3/S4環(huán), 從而使p53C-Y220C突變體表面的疏水腔的容積逐漸減小, 由原先的打開狀態(tài)變成了一個(gè)閉合的狀態(tài), 從而大大提高了p53C突變體Y220C的穩(wěn)定性. 利用ThT熒光實(shí)驗(yàn)證明他克林能夠提高p53C-Y220C突變體的穩(wěn)定性, 從而抑制了p53C-Y220C突變體的聚集.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150790.

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(Ed.: Y, Z)

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Virtual Screening of Small Molecular Stabilizer for Y220C Mutant of p53?

DING Jiyong, SHEN Hongchen, LIU Fufeng*

(KeyLaboratoryofSystemsBioengineeringoftheMinistryofEducation,DepartmentofBiochemicalEngineering，SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,TianjinUniversity,Tianjin300072,China)

About half of cancers are caused by the mutation in the tumor suppressor p53. A hydrophobic cavity on the surface of p53 was caused by the Y220C mutation. The surface crevice is on the opposite side and distant from the DNA-binding domain, making it a particularly attractive target site for stabilizing small-molecule drugs. In order to obtain the effective stabilizers, Lipinski’s rule of five, twice docking methods and molecular dynamics(MD) simulations were successively used for virtual screening the DrugBank 4.0 library and tacrine was obtained as a candidate stabilizer. Then, all-atom MD simulations were used to verify the affinity between tacrine and the target protein. The MD simulation indicated that tacrine bound tightly to the pocket and the complex remained stable. The affinity between tacrine and the target protein was further analyzed. It was found that the hydrophobic and electrostatic interactions dominated the affinity between tacrine and the target protein. And, the hydrophobic interactions were dominant force. Moreover, there were 3 hydrogen bonds between tacrine and the residues Leu145, Val147 and Asp228 of p53C-Y220C. And then, the detailed binding process of tacrine and p53C-Y220C was probed based on MD simulations. Finally, the stabilizing capacity of tacrine on p53C-Y220C was further validated by thioflavine T fluorescent experiments.

Cancer; Protein stabilizer; Molecular dock; Molecular dynamics simulation; p53; Tacrine

10.7503/cjcu20150790

2015-10-13.

日期: 2016-03-18.

國家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21576199)和中國博士后科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 2013M530115, 2012T50241)資助.

O641

A

聯(lián)系人簡介: 劉夫鋒, 男, 博士, 副教授, 從事生物過程的分子模擬研究. E-mail: fufengliu@tju.edu.cn