楊潤(rùn)潔, 唐 堯, 朱維平

(華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海市化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237)

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用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的比率型熒光探針

楊潤(rùn)潔, 唐 堯, 朱維平

(華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海市化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200237)

設(shè)計(jì)合成了1種用于檢測(cè)生物巰基的比率型熒光探針(4), 并考察了其對(duì)谷胱甘肽的識(shí)別作用. 在4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液中, 探針4可與谷胱甘肽快速反應(yīng), 溶液顏色由淡黃色變?yōu)榉奂t色, 從而實(shí)現(xiàn)“裸眼”檢測(cè), 且在608 nm處的熒光信號(hào)增強(qiáng). 在1.6×10-5～2×10-4mol/L范圍內(nèi), 探針4能夠定量檢測(cè)谷胱甘肽, 檢出限為8.9×10-7mol/L. 此外, 探針4還可用于MCF-7細(xì)胞中谷胱甘肽的成像.

熒光探針; 谷胱甘肽; 細(xì)胞成像

谷胱甘肽、 半胱氨酸和高半胱氨酸都屬于內(nèi)源性生物巰基, 能夠維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡[1,2]. 其中, 谷胱甘肽是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富(0.5～10 mmol/L) 的一類巰基化合物, 它是由谷氨酸、 甘氨酸以及半胱氨酸組成的三肽[3], 對(duì)過(guò)氧化氫等氧自由基、 汞和鉛等重金屬有解毒作用[4]. 細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸濃度為50～200 μmol/L, 濃度遠(yuǎn)低于谷胱甘肽[5,6]. 細(xì)胞內(nèi)的高半胱氨酸含量約為5～15 μmol/L, 它是半胱甘酸的前體, 經(jīng)過(guò)甲硫氨酸和絲氨酸合成胱硫醚中間體, 進(jìn)而轉(zhuǎn)變成半胱氨酸[7]. 研究[8,9]表明, 多種疾病都與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的異常相關(guān), 如癌癥、 心血管疾病和艾滋病等. 因此, 定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽對(duì)疾病的診斷及治療具有重要的意義. 與其它方法相比, 熒光分析法具有操作簡(jiǎn)便、 靈敏度高及能夠可視化觀察等優(yōu)點(diǎn), 能將微觀上分子識(shí)別過(guò)程轉(zhuǎn)化為宏觀上熒光信號(hào)的變化, 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)[10]. 近年來(lái), 已有大量用于檢測(cè)生物巰基的熒光探針被研究報(bào)道[11～14].

本文以2,4-二硝基苯磺酸酯(DNBS)為受體, 三氰基二氫呋喃(DCDHF) 為熒光團(tuán)[15,16], 合成了1種新型的可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)含量最多的生物巰基谷胱甘肽的熒光探針(4). 其中, 2,4-二硝基苯磺酸酯是經(jīng)典的受體, 它能夠快速識(shí)別生物硫醇. 近年來(lái), 大量文獻(xiàn)[17～19]報(bào)道了以DNBS為受體的生物巰基探針. 與這些探針相比, 探針4具有合成簡(jiǎn)便、 能夠?qū)崿F(xiàn)裸眼檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn), 并且能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽進(jìn)行檢測(cè). 由于探針4受體部分的硝基具有吸電子作用, 致使磺酸酯基的硫原子帶部分正電荷, 在親核試劑的進(jìn)攻下磺酸酯鍵更容易斷裂. 因此, 當(dāng)谷胱甘肽中的巰基親核進(jìn)攻硫原子時(shí), 經(jīng)分子內(nèi)重排、 硫氧鍵斷裂, 生成游離的酚羥基, 使熒光團(tuán)供電子端電子云密度增加, 整個(gè)熒光分子推拉電子體系增強(qiáng), 進(jìn)而導(dǎo)致熒光增強(qiáng)(圖S1, 見(jiàn)本文支持信息). 探針4的結(jié)構(gòu)經(jīng)元素分析、 質(zhì)譜和核磁共振譜確認(rèn). 利用該探針在MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的成像.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

所用試劑均為分析純; 乙腈和四氫呋喃經(jīng)過(guò)重蒸處理; 氨基酸購(gòu)自上海Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司; 200～300目硅膠購(gòu)自青島海洋化工廠產(chǎn)品.

WRS-1B型熔點(diǎn)儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司); Vario EL型元素分析儀(德國(guó)Elementar公司); Avance 400 MHz型核磁共振儀[四甲基硅烷(TMS) 為內(nèi)標(biāo), Bruker公司]; 5989A型質(zhì)譜儀(HP公司); Cary 100型紫外-可見(jiàn)光譜儀(Varian公司); Cary Eclipse熒光光譜儀(Varian公司); Leica SP8型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司); Hera cell CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司); Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(Thermo Scientific 公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 探針4的合成 目標(biāo)化合物(探針4)的合成路線和結(jié)構(gòu)如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthetic routes of probe 4

參照文獻(xiàn)[20]方法, 由3-羥基-3-甲基-2-丁酮與丙二睛合成中間體2, 得到淡黃色晶體, 產(chǎn)率79%, m. p. 199.0～200.3 ℃(文獻(xiàn)值[21]: 202～203 ℃). 向50 mL反應(yīng)瓶中加入50 mg(0.25 mmol) 化合物2、 20 mL無(wú)水乙腈和100 μL哌啶, 待原料完全溶解后, 加入33 mg(0.27 mmol) 對(duì)羥基苯甲醛, 加熱回流3 h, 用薄層色譜(TLC) 跟蹤至反應(yīng)結(jié)束. 減壓蒸餾除去溶劑, 殘余物用硅膠柱層析純化[V(DCM)∶V(MeOH) = 50∶1], 得到45 mg化合物3.

目標(biāo)化合物(探針4)的合成: 向25 mL反應(yīng)瓶中加入20 mg(0.070mmol) 化合物3、 10 mL無(wú)水四氫呋喃和100 μL吡啶, 將混合溶液在冰浴下冷卻至0 ℃, 攪拌10 min后, 加入27 mg(0.100 mmol) 2,4-二硝基苯磺酰氯的四氫呋喃(0.5 mL) 溶液, 在冰浴下反應(yīng)30 min后逐漸升溫到室溫, 繼續(xù)反應(yīng)3 h. 用TLC跟蹤至反應(yīng)結(jié)束. 減壓蒸餾除去溶劑, 殘余物用硅膠柱層析純化[V(DCM)∶V(PE)=12∶1], 得到25 mg淡黃色粉末4.

1.2.2 化合物的表征 化合物3和4的理化性質(zhì)和高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)列于表1. 核磁共振數(shù)據(jù)列于表2.

Table 1 Appearance, melting points, yields, HRMS and elemental analysis data of compounds 3 and 4

Table 2 1H NMR and 13C NMR data of compounds 3 and 4

1.2.3 光譜分析 室溫下, 用DMSO配制濃度為1×10-3mol/L的探針4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液. 測(cè)試時(shí), 用pH=7.4的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液(0.1 mol/L)稀釋至所需濃度, 控制DMSO的含量為1%. 探針4的濃度為10 μmol/L, 定量加入谷胱甘肽及其它氨基酸, 分別測(cè)定紫外-可見(jiàn)吸收光譜及熒光光譜.

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及染色 采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞; 細(xì)胞染色后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行成像.

2 結(jié)果與討論

2.1 探針4與谷胱甘肽反應(yīng)前后的光譜變化

研究了探針4與谷胱甘肽反應(yīng)前后紫外-可見(jiàn)光譜及熒光光譜的變化情況. 如圖1所示, 探針4的最大吸收波長(zhǎng)位于394 nm處, 與谷胱甘肽反應(yīng)后, 最大吸收紅移并且出現(xiàn)2個(gè)吸收峰, 這是由于熒光團(tuán)3在pH=7.4時(shí)存在羥基和氧負(fù)離子形式(見(jiàn)化合物3的pH滴定曲線, 圖S2, 見(jiàn)本文支持信息). 探針4反應(yīng)前后最大吸收波長(zhǎng)紅移達(dá)到170 nm, 溶液由淡黃色變?yōu)榉奂t色[圖1(A)插圖], 可對(duì)谷胱甘肽進(jìn)行“裸眼”檢測(cè). 由熒光光譜圖[圖1(B)]可見(jiàn), 探針4與谷胱甘肽反應(yīng)后, 608 nm處的熒光顯著增強(qiáng), 最大增強(qiáng)倍數(shù)達(dá)7倍.

Fig.1 UV-Vis absorption(A) and fluorescence spectra(B) of probe 4(10 μmol/L) before(a) and after(b) reaction with glutathione(200 μmol/L) in HEPES buffer(0.1 mol/L, pH=7.4, 1% DMSO)Inset of (A): color changes of solution before(a) and after(b) reaction.

2.2 探針4與不同濃度谷胱甘肽反應(yīng)的紫外-可見(jiàn)光譜響應(yīng)

由于探針4與谷胱甘肽反應(yīng)后紫外吸收發(fā)生紅移, 溶液顏色發(fā)生變化, 因此可以通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜的變化定量檢測(cè)谷胱甘肽. 如圖2所示, 隨著谷胱甘肽濃度的升高, 568 nm處的紫外吸收逐漸增強(qiáng), 而394 nm處的紫外吸收逐漸下降, 探針溶液顏色最終由淡黃色變?yōu)榉奂t色. 在谷胱甘肽濃度為1.6×10-5～2×10-4mol/L范圍內(nèi), 568和394 nm處吸收強(qiáng)度的比值與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系, 計(jì)算得到探針4檢出限為8.9×10-7mol/L[22].

Fig.2 UV-Vis absorption spectra of probe 4(10 μmol/L) with different concentrations of GSH(A) and the linear relationship of A568/A394 vs. the concentrations of GSH over 0—200 μmol/L(B)c(GSH)/(μmol·L-1): 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200.

2.3 探針4與谷胱甘肽反應(yīng)的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線

圖3示出了探針4與谷胱甘肽反應(yīng)過(guò)程中紫外-可見(jiàn)吸收及熒光光譜的變化. 可見(jiàn), 向探針4的HEPES緩沖液中加入200 μmol/L的谷胱甘肽后, 在0～15 min內(nèi), 探針4在394 nm處的紫外吸收強(qiáng)度逐漸下降, 在568 nm處的紫外吸收強(qiáng)度逐漸上升, 并且在455 nm處出現(xiàn)等吸收點(diǎn), 15 min之后基本達(dá)到平衡. 由圖3(B)可見(jiàn), 探針4與谷胱甘肽反應(yīng)過(guò)程中, 608 nm處的熒光逐漸增強(qiáng), 15 min后熒光基本保持恒定.

Fig.3 UV-Vis absorption(A) and fluorescence spectra(B) changes of probe 4(10 μmol/L) toglutathione(200 μmol/L) in 15 min

2.4 探針4的選擇性

Fig.4 Fluorescence emission changes of probe 4(10 μmol/L) in HEPES upon addition of different amino acids(200 μmol/L)

圖4示出了探針4對(duì)不同氨基酸的熒光響應(yīng). 除了谷胱甘肽之外, 探針4對(duì)半胱氨酸和高半胱氨酸均有類似的響應(yīng), 對(duì)其它氨基酸如組氨酸、 絲氨酸、 蛋氨酸、 谷氨酸和蘇氨酸等則沒(méi)有響應(yīng). 但是, 由于細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量為0.5～10 mmol/L, 半胱氨酸的含量在50～200 μmol/L, 高半胱氨酸的含量為5～15 μmol/L, 濃度相差較大[5,6]. 因此, 該探針能夠應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的成像.

2.5 探針4的細(xì)胞成像

采用共聚焦顯微鏡考察了探針4對(duì)活細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的檢測(cè)性能. 如圖5所示, 向MCF-7細(xì)胞內(nèi)加入50 μmol/L探針并培養(yǎng)30 min后, MCF-7細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了明亮的紅色熒光[圖5(D)], 而未經(jīng)探針4處理的細(xì)胞內(nèi)則無(wú)任何熒光信號(hào)[圖5(B)]. 此結(jié)果表明, 探針4能夠進(jìn)入MCF-7細(xì)胞; 并且在細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的作用下, 探針4分子的硫氧鍵被切斷, 從而釋放出熒光團(tuán)3, 發(fā)出紅色熒光, 30 min后熒光即趨于穩(wěn)定, 表明該探針在谷胱甘肽的作用下反應(yīng)迅速. 由此可見(jiàn), 探針4具有檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的潛力.

Fig.5 Bright-field(A, C) and fluorescence(B, D) images of MCF-7 cells(A, B) and MCF-7 cellsincubated with 50 μmol/L probe 4 for 30 min(C, D)

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的比率型熒光探針4. 在HEPES緩沖液(0.1 mol/L, pH=7.4, 1%DMSO) 中, 探針4能夠較靈敏地檢測(cè)谷胱甘肽. 在與谷胱甘肽反應(yīng)后, 探針4在394 nm處的吸收峰消失, 在450和570 nm處出現(xiàn)新的吸收峰, 溶液顏色由淡黃色變?yōu)榧t色, 從而實(shí)現(xiàn)“裸眼”檢測(cè)谷胱甘肽, 其檢出限達(dá)到8.9×10-7mol/L. 此外, 探針4可用于MCF-7細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的熒光成像.

支持信息見(jiàn)http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150725.

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(Ed.: N, K )

Ratiometric Fluorescent Probe for the Detection of Glutathione in Living Cells?

YANG Runjie, TANG Yao, ZHU Weiping*

(ShanghaiKeyLabofChemicalBiology,SchoolofPharmacy,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237,China)

A fluorescent probe(4) for the detection of biothiols was designed and synthesized and its properties for labeling glutathione was investigated. After reaction with glutathione in 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid(HEPES) buffer, the color of solution changed from light yellow to pink, which could be detected by naked eyes. Meanwhile, the fluorescence was enhanced at 608 nm. Probe 4 was useful for measuring glutathione at concentrations ranging from 1.6×10-5to 2×10-4mol/L with a detection limit of 8.9×10-7mol/L. Besides, probe 4 was sensitive to glutathione in MCF-7 cells, which emitted red fluorescence when it was incubated with MCF-7 cells.

Fluorescent probe; Glutathione; Intracellular imaging

10.7503/cjcu20150725

2015-09-17.

日期: 2016-03-10.

國(guó)家自然科學(xué)基金(批準(zhǔn)號(hào): 21476077)資助.

O657; O625.75

A

聯(lián)系人簡(jiǎn)介: 朱維平, 男, 博士, 教授, 主要從事熒光探針及其應(yīng)用研究. E-mail: wpzhu@ecust.edu.cn

? Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.21476077).