劉 松 董曉芳 佟建明

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

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多糖提取和抗氧化活性評價方法的研究現(xiàn)狀和進展

劉 松 董曉芳*佟建明

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京100193)

作為構成生命活動的四大基本物質(zhì)之一，多糖與維持生命所需的多種生理功能密切相關。隨著研究的進行，多糖的抗氧化活性成為眾多學者關注的熱點。本文綜述了多糖的提取和抗氧化活性評價方法的研究現(xiàn)狀和進展，以期為多糖的提取和抗氧化活性評價研究提供借鑒。

多糖；提??；抗氧化活性評價

多糖是廣泛存在于自然界的一類天然高分子化合物，一般由10個以上單糖分子之間通過α-或β-糖苷鍵線性或分枝連接組成。作為構成生命活動的四大基本物質(zhì)之一，多糖與維持生命所需的多種生理功能密切相關。20世紀50年代以來，多糖及其復合物在細胞識別、分化、代謝、免疫應答、癌變、凋亡、抗氧化等各項生命活動中的功能逐漸引起人們的關注。抗氧化是多糖重要的生物學活性之一。目前，關于多糖提取、抗氧化活性及其作用機理的研究日趨廣泛和深入。

1 多糖的提取方法

常用的多糖提取方法主要有：水提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶解輔助提取法等。

1.1 水提取法

水提取法是一種常用的多糖提取方法，其是利用多糖溶于水的性質(zhì)，采用熱水浸煮或冷水浸提滲濾提取多糖。影響水提取法提取率的因素有：提取溫度、料液比、提取時間及提取次數(shù)。研究人員對多糖水提取法的研究主要集中在對這幾個提取條件的優(yōu)化上，通常采用正交試驗法、響應面試驗法優(yōu)化確定上述幾個因素的最佳組合。水提取法對條件要求簡單，便于使用，但在提取多糖的同時也易將蛋白質(zhì)、苷類等水溶性成分提取出來，使得多糖純度不高。此外該法耗時，提取效率不高。已報道的采用熱水提取法的多糖有：虎奶菇多糖[1-2]、蘋果多糖[3-4]、劍麻多糖[5]、靈芝多糖[6-7]、蜀葵種子多糖[8]、擔子菌多糖[9]、淫羊藿多糖[10-11]、桑黃多糖[12]等。

1.2 超聲波輔助提取法和微波輔助提取法

超聲波輔助提取法主要是利用超聲波產(chǎn)生強烈的空化效應、機械振動、擾動效應、乳化、擴散、擊碎和攪拌作用等多級效應，增大物料分子的運動頻率和速度，形成瞬間空化高溫和局部高壓，加速物料中多糖在溶媒的溶出。微波輔助提取法則主要是利用高頻電磁波穿透提取介質(zhì)，使物料細胞內(nèi)的水分吸收微波能，導致細胞內(nèi)部溫度迅速上升，連續(xù)的高溫使細胞膨脹破裂，加速物料細胞內(nèi)多糖的自由流出。同時，微波所產(chǎn)生的電磁場可以加速多糖向提取溶劑界面擴散的速率，縮短多糖分子由物料內(nèi)部擴散到萃取溶劑界面的時間，從而提高提取速率。

超聲波輔助提取法和微波輔助提取法的優(yōu)點在于能利用物理作用加速細胞壁破碎和多糖的浸出，提高多糖提取的效率，同時還可降低提取溫度，最大限度保證提取的多糖質(zhì)量。但是，與傳統(tǒng)水提取法相比，超聲波輔助提取法和微波輔助提取法提取過程中超聲和微波功率、頻率、處理時間等工藝條件都需要額外優(yōu)化，而且這2種方法是由內(nèi)向外快速傳熱，因而功率過大或時間太長可能會導致多糖的糖苷鍵斷開[13]，對多糖生物學活性產(chǎn)生不利影響。目前報道的采用超聲波輔助提取法和微波輔助提取法提取的多糖有虎奶菇多糖[2]、古尼蟲草多糖[14]、黨參多糖[15]、銀耳多糖[16]等。

1.3 酶解輔助提取法

酶解輔助提取法是指在多糖的提取時加入一定活性的一種或多種酶來加速細胞壁的破碎、多糖的浸出，如加入纖維素酶和果膠酶分解細胞壁、蛋白酶以除去雜蛋白等。使用酶解輔助提取法時，既可以同時使用多種酶(復合酶法)[17-18]，也可單獨使用一種酶(單一酶法)[19]。酶解輔助提取法的優(yōu)點在于提取條件溫和、效率較高。但是由于外源酶的加入可能會造成多糖的單糖組成、分子量、多糖結構和構象[18]等理化性質(zhì)發(fā)生變化，從而對多糖生物學活性造成影響。同時，酶解輔助提取法中酶的成本較高，提取條件(尤其是溫度和酸堿度)需要額外優(yōu)化選擇，而且條件要求較高，從而使得酶解輔助提取法的應用受到限制。目前已報道的使用酶解輔助提取法提取的多糖有：苜蓿多糖[20]、淫羊藿多糖[11]、黃芪多糖[21]、枸杞多糖[22]等。

1.4 多糖的其他提取方法

多糖的提取方法還有堿提取法[1,9]、高壓脈沖電場輔助提取法[23]、超聲波-酶協(xié)同輔助提取法[1]等。多糖的上述幾種提取方法雖有零星研究報道，但實際應用尚較少。多糖提取方法的優(yōu)缺點見表1。

表1 多糖提取方法的優(yōu)缺點

2 多糖抗氧化活性的研究進展

2.1 體外研究

多糖抗氧化活性體外研究主要是通過使用化學、生物學方法對多糖清除自由基能力、抑制脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化損傷能力等評價方法來進行?？寡趸钚泽w外評價方法簡便、快捷，因此得到廣泛應用。不同的抗氧化活性體外評價方法分別基于不同的反應原理，但各自存在缺陷，因此在多糖體外抗氧化活性評價過程中僅選用1種評價方法顯得有些不足。因此，在進行多糖體外抗氧化能力評價的時候，眾多學者一致推薦至少采用2種基于不同原理的體外評價方法。

2.1.1 體外化學方法評價

2.1.1.1 清除自由基活性評價

自由基具有極強的氧化反應能力，其能通過氧化作用來攻擊所遇到的任何分子，使機體內(nèi)的大分子物質(zhì)產(chǎn)生過氧化反應，從而引起機體不可逆損傷。因此多糖的清除自由基能力是評價其抗氧化活性的一個重要方面。

常用的清除自由基活性評價方法有：清除1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-two phenyl-2-bitter base hydrazine，DPPH)自由基活性評價、清除2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2, 2′-azino-two (3-ethyl benzene and thiazole-6-sulfonic acid)，ABTS]自由基活性評價、清除活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)活性評價、清除活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)活性評價。其中清除ROS活性評價主要包括清除氧化自由基(oxyradical，ROO·)、超氧陰離子自由基(superoxide anion radical，O2-·)和羥基自由基(hydroxyl free radical，OH·)能力評價。清除RNS活性評價包括清除一氧化氮自由基(nitric oxide radical，NO·)和過氧化亞硝鹽離子自由基(pro-oxidant peroxynitrite，ONOO-)能力評價。

Wang等[3]、Zhang等[5]分別對復合酶輔助提取的苜蓿多糖、熱水提取的劍麻多糖進行清除DPPH自由基、羥自由基活性評價，發(fā)現(xiàn)苜蓿多糖和劍麻多糖具有清除DPPH自由基、羥基自由基活性，且具有劑量效應。Wang等[3]報道蘋果多糖具有清除DPPH自由基和ABTS自由基活性，且具有劑量效應。Cheng等[10-11]發(fā)現(xiàn)淫羊藿多糖具有清除DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基活性。據(jù)報道，蜀葵多糖[8]、靈芝多糖[24]、蘋果多糖[25]具有清除超氧陰離子自由基活性。

此外，Klaus等[9]、Ma等[26]、Li等[27]、Volpi等[28]分別使用上述1種或幾種方法對擔子菌多糖、白樺茸多糖、玉米穗多糖、桑葚多糖清除自由基能力進行研究，并發(fā)現(xiàn)這幾種多糖都具有一定的體外清除自由基活性。

2.1.1.2 還原能力評價

多糖同樣具有良好的還原能力，因此可以通過測定多糖的還原能力來間接評價其抗氧化活性。目前，應用于多糖抗氧化能力評價的主要方法有：三價鐵離子(Fe3+)還原能力評價、二價鐵離子(Fe2+)結合能力評價、總還原能力評價等。

Chen等[13]、Ma等[26]分別發(fā)現(xiàn)淫羊藿多糖、白化茸多糖具有Fe3+還原能力。Tseng等[7]分別發(fā)現(xiàn)松杉樹芝多糖具有Fe2+結合能力，從而具有抗氧化活性。Tseng等[7]、Liu等[8]、Dou等[25]和Li等[27]分別通過總還原能力評價發(fā)現(xiàn)松杉樹芝多糖、蜀葵多糖、蘋果多糖和金絲小棗具有一定的還原能力。

2.1.2 體外生物學評價

2.1.2.1 抑制體外脂質(zhì)過氧化活性評價

研究表明，多糖可以絡合產(chǎn)生ROS所必需的金屬離子[28]。多糖環(huán)上的醇羥基可與產(chǎn)生羥基自由基等所必需的金屬離子[如Fe2+、二價銅離子(Cu2+)等]絡合，使其不能產(chǎn)生羥基自由基，而羥基自由基能起動脂質(zhì)過氧化反應，脂質(zhì)過氧化反應可產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化氫(H2O2)。因此多糖能夠抑制脂質(zhì)過氧化。

Fe2+/抗壞血酸處理小鼠離體肝臟能引起肝臟脂質(zhì)過氧化反應的發(fā)生。目前研究發(fā)現(xiàn)，白化茸多糖[26]、海藻多糖[29]、靈芝多糖[30]、天門冬多糖[31]能抑制Fe2+/抗壞血酸引起的肝臟脂質(zhì)過氧化作用。

研究還發(fā)現(xiàn)，淫羊藿多糖[10]、銀耳多糖[16]能抑制紅細胞膜的脂質(zhì)過氧化，保護細胞膜結構的完整性。

2.1.2.2 抑制體外蛋白質(zhì)氧化損傷活性評價

蛋白質(zhì)的氧化損傷會造成一系列的生理和病理紊亂[32]。Subramanian等[33]研究發(fā)現(xiàn)，心葉青牛膽多糖可以抑制輻射引起的蛋白質(zhì)損傷。

2.1.3 體外細胞模型評價

由于細胞更接近生物體內(nèi)的環(huán)境，因此與體外化學法和生物學評價方法相比，采用細胞為載體來進行抗氧化活性的初期篩選、評價，成為多糖抗氧化活性研究一種較好的選擇。

研究者可以根據(jù)抗氧化物質(zhì)的應用目的來選擇不同的模型細胞，以評價抗氧化活性物質(zhì)對生物體內(nèi)某一特定氧化應激反應的抗氧化能力[34-40]。表2列舉了多糖抗氧化活性研究中常用的細胞模型及其研究應用。

2.2 體內(nèi)評價

上述多糖抗氧化活性的體外評價方法簡便、快捷，但是由于多糖消化、吸收、新陳代謝過程的作用增加了多糖抗氧化能力的不確定性，僅憑此研究結果不足以準確評價其抗氧化活性。目前，采用有代表性的氧化應激動物模型對多糖抗氧化活性進行評價研究已經(jīng)得到了廣泛認可。動物機體發(fā)生氧化應激時，體內(nèi)高活性分子如ROS和RNS等產(chǎn)生過多，氧化程度超出機體抗氧化物的清除能力，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導致組織損傷的現(xiàn)象。在氧化應激過程中，由于受到自由基的氧化脅迫，構成細胞組織的各種物質(zhì)如脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、核糖核酸(DNA或RNA)等大分子物質(zhì)，都會發(fā)生各種程度的氧化反應，引起變性、交聯(lián)、斷裂等氧化損傷[34-36]，進而導致細胞結構和功能的破壞和細胞死亡，以及機體組織的損傷和器官的病變甚至癌癥等[37]。

表2 多糖抗氧化活性研究中常用的細胞模型及其研究應用

研究發(fā)現(xiàn)，多糖抗氧化活性主要體現(xiàn)在對肝臟、腎臟等氧化自由基集中產(chǎn)生的器官蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)過氧化、DNA或RNA氧化損傷的抑制、自由基的清除、抗氧化物(如抗氧化酶系統(tǒng)等)的保護、線粒體正常膜電位的維持等方面。

多糖抗氧化活性評價常用的動物模型包括D-半乳糖模型、轉(zhuǎn)基因動物模型、高脂血癥模型、脂肪酸氧化應激模型、輻射損傷模型等試驗動物整體性地處于氧化應激狀態(tài)的全身性的氧化應激模型(也稱非特異性的氧化應激模型)，另外還包括針對試驗動物的某些特定組織器官進行氧化損傷的局部器官性的氧化應激模型(也稱為特異性的氧化應激模型)，如：四氯化碳(CCl4)-肝損傷模型、環(huán)孢靈-A誘導的肝或腎損傷氧化應激模型、鏈脲霉素誘導的糖尿病(胰腺損傷)氧化損傷模型及蛋氨酸和膽堿缺乏肝損傷模型等。表3列舉了多糖抗氧化活性研究常用的動物模型及其研究應用。

2.3 細胞模型和動物模型評價常用方法和指標

多糖抗氧化活性的評價研究多集中在氧化應激標志物、抗氧化酶和抗氧化物的分析、細胞內(nèi)鈣、線粒體膜電位和線粒體凋亡分析等方面。根據(jù)氧化應激的物質(zhì)種類，氧化應激的定量評價方法主要有蛋白質(zhì)氧化損傷標志物檢測、脂質(zhì)過氧化標志物檢測、DNA或RNA損傷檢測以及活性氧消除系統(tǒng)酶和抗氧化物質(zhì)檢測等。研究證明，多糖在緩解蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸氧化損傷，調(diào)節(jié)機體抗氧化酶和抗氧化物水平，抑制細胞凋亡等抗氧化層面具有較好的活性。

2.3.1 蛋白質(zhì)氧化損傷分析

氧化應激過程中，自由基對蛋白質(zhì)的損傷作用包括蛋白質(zhì)肽鏈斷裂、蛋白質(zhì)分子相互間交聯(lián)聚合、蛋白質(zhì)氨基酸發(fā)生氧化脫氨反應、氧自由基攻擊蛋白質(zhì)還原性基團、脂類氧化裂解所產(chǎn)生的丙二醛(MDA)與蛋白質(zhì)上的氨基產(chǎn)生分子間的交聯(lián)等。目前對于蛋白質(zhì)氧化損傷的檢測指標主要有2個：蛋白質(zhì)羰基生成(羰基化)和二酪氨酸的生成(蛋白質(zhì)中酪氨酸硝基化)[59-62]。相比之下，試驗研究中以測定蛋白質(zhì)羰基水平居多。

Josephine等[56]通過測定蛋白質(zhì)羰基化水平，發(fā)現(xiàn)馬尾藻多糖能降低環(huán)孢靈-A誘導的肝損傷大鼠蛋白質(zhì)氨?；潭龋档偷鞍踪|(zhì)氧化損傷，緩解氧化應激。

2.3.2 脂質(zhì)過氧化分析

脂質(zhì)過氧化為ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關的多不飽和脂肪酸的側鏈及核酸等大分子物質(zhì)起脂質(zhì)過氧化反應，形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，如：MDA、4-羥基壬烯醛(HNE)，從而使細胞膜的流動性和通透性發(fā)生改變，最終導致細胞結構和功能的改變[63-64]。HNE和MDA是2個強毒力的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，常被作為判斷脂質(zhì)過氧化的指標。試驗研究中以測定MDA含量較為常見。

表3 多糖抗氧化活性研究常用的動物模型及其研究應用

通過測定脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量，Jia等[38]研究發(fā)現(xiàn)絞股藍多糖能降低β淀粉樣肽(Aβ)誘導的CP12細胞脂質(zhì)過氧化水平；Li等[48]發(fā)現(xiàn)刺五加多糖能降低輻射引起的氧化應激大鼠脂質(zhì)過氧化水平；Yu等[50]發(fā)現(xiàn)甘遂多糖能降低游泳疲勞引起的氧化應激小鼠的脂質(zhì)過氧化程度；Josephine等[56]發(fā)現(xiàn)馬尾藻多糖能降低環(huán)孢靈-A誘導的肝損傷大鼠脂質(zhì)過氧化程度。

2.3.3 DNA或RNA損傷分析

自由基可以直接攻擊生物大分子DNA或RNA誘發(fā)DNA或RNA氧化損傷[65-66]，其中以鳥嘌呤8位碳原子氧化后形成8-羥基-[脫氧]鳥嘌呤(8-OHdG/8-OHG)最為常見。另外，還有一些嘌呤或者嘧啶堿基直接脫去的反應，因此形成了核酸中無嘌呤(apurinic)和脫嘧啶(apyrimidinic)位點，統(tǒng)簡稱AP位點。除了上述氧化損傷外，DNA雙鏈斷裂(DSBs)是細胞內(nèi)多種類型的DNA損傷中最危險、最嚴重的一種。試驗研究中多采用測定8-OHdG含量的方法評價DNA損傷。另外，彗星試驗(comet assay)也是應用較多的DNA損傷評價方法。彗星試驗又稱單細胞凝膠電泳檢測技術(single cell gel electrophoresis assay，SCGE)是近年發(fā)展起來的在單細胞水平上定量檢測DNA損傷的靈敏方法。其原理為：變性切離的DNA片段在電場的影響下從細胞核中移出，而完整的超螺旋DNA仍然保持在細胞核內(nèi)。因而，通過凝膠電泳會形成完整的DNA的細胞染色體為“頭”，松散和斷裂的DNA為“尾”的“彗星拖尾”(comet tail)現(xiàn)象。DNA損傷越嚴重尾部和總彗星熒光百分比(tail DNA%)越高。

Josephine等[56]發(fā)現(xiàn)馬尾藻多糖能降低環(huán)孢靈-A誘導的肝損傷大鼠8-OHdG含量，緩解DNA損傷。Tsai等[40]通過測定H2O2誘導的張氏肝細胞8-OHdG含量，發(fā)現(xiàn)樟枝多糖可以降低其DNA損傷。另外，Tsai等[40]還通過彗星試驗研究證實，樟枝多糖可以降低H2O2誘導的張氏肝細胞DNA氧化損傷。

2.3.4 ROS、抗氧化酶和抗氧化物分析

需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列的ROS，過多的ROS對細胞是有害的。細胞內(nèi)存在的各種活性酶及抗氧化劑在機體細胞抵御氧化損傷、維持氧化和抗氧化的平衡中起了重要作用，如：氧自由基酶類將活性氧簇轉(zhuǎn)化為低毒性物質(zhì)[67]、抗氧化物質(zhì)的解毒作用[68]等。其中，機體內(nèi)多種氧自由基酶類發(fā)揮了重要的作用。主要的抗氧化酶類有：堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)。SOD是體內(nèi)超氧陰離子的主要清除者，將其催化分解為H2O2，但H2O2也具有氧化損傷作用，CAT將其轉(zhuǎn)化為氧氣(O2)和水(H2O)。同時H2O2也可通過GSH-Px的催化和還原型谷胱甘肽(GSH)反應生成H2O，同時生成氧化型谷胱甘肽。另外，機體內(nèi)GSH、維生素C、維生素E等非酶類抗氧化物質(zhì)也在維持氧化和抗氧化的平衡中起了重要作用。

此外，多糖能夠作為氫質(zhì)子或電子的供給體，直接猝滅或抑制自由基，終止自由基的連鎖反應，發(fā)揮抗氧化功能?？赡芡緩揭皇嵌嗵潜旧砜梢葬尫懦鲶w積小、親合性很強的氫質(zhì)子，捕捉高勢能的極活潑的自由基使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔钚曰蜉^為穩(wěn)定的化合物，另一個途徑可能是通過電子轉(zhuǎn)移直接給出電子而清除自由基。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，樟枝多糖[40]、枸杞多糖[43]、刺五加[48]、甘遂多糖[50]、馬尾藻多糖[56]、枸杞多糖[57]等具有促進機體GSH-Px、GR、SOD等抗氧化酶類生成的作用。Ma等[43]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能抵制飼喂高脂飼糧引起的氧化應激小鼠肝臟內(nèi)非酶抗氧化物質(zhì)GSH、維生素C和維生素E含量的下降，緩解小鼠氧化應激。此外，Jia等[38]研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍多糖能降低Aβ誘導的PC12細胞ROS含量。Tsai等[40]研究證實，樟枝多糖能降低H2O2誘導的張氏肝細胞ROS含量。

2.3.5 細胞內(nèi)鈣、線粒體膜電位和線粒體凋亡分析

過強的氧化應激會引起細胞內(nèi)鈣水平升高，導致線粒體膜電位降低，進而會激活線粒體凋亡通路。通過細胞內(nèi)鈣水平、線粒體膜電位測定和蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)等手段，Berridge等[68]發(fā)現(xiàn)，絞股藍多糖能通過降低細胞內(nèi)鈣水平、維持線粒體正常膜電位、降低B淋巴細胞瘤基因-2(Bax/Bcl-2)表達、減少線粒體細胞色素C釋放、抑制細胞凋亡蛋白酶(caspase-3,CPP3)來緩解PC12細胞由于Aβ誘導的氧化損傷[38]。

3 小 結

綜上所述，多糖的不同提取方法各有優(yōu)劣，在多糖提取中應根據(jù)實際情況選擇合適的提取方法。同時，多糖的抗氧化機理復雜，在進行多糖抗氧化活性評價研究時應將體外評價和體內(nèi)評價方法結合起來，有層次、有目的地研究才能清楚的了解多糖抗氧化活性的機制、有效的提取和利用多糖。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: xiaofangd1124@sina.com

(責任編輯 武海龍)

Research Status and Progress of Extraction and Antioxidant Activity Evaluation Methods of Polysaccharides

LIU Song DONG Xiaofang*TONG Jianming

(Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

As one of the four essential substances that constitute the life activity, polysaccharides is closely related to the various physiological functions needed to maintain life. With the development of its research, the antioxidant activity of polysaccharides has become a research hotspot. In this paper, the research status and progress of extraction and antioxidant activity evaluation methods of polysaccharides were summarized which could be referenced in the extraction and antioxidant activities research of polysaccharides.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11)：3391-3399]

polysaccharides; extraction; antioxidant activity evaluation

2016-04-20

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2013BAD10B04)；國家蛋雞產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項經(jīng)費(CARS-41-K16)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS08)

劉 松(1991—)，男，山東日照人，碩士研究生，從事蛋雞營養(yǎng)與飼料添加劑研究。E-mail: liusong7@yeah.net

*通信作者：董曉芳，副研究員，碩士生導師，E-mail: xiaofangd1124@sina.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.004

S852.2

A

1006-267X(2016)11-3391-09