許卓再，于晉懿，毛毳，王　婧，余　爍，盧　弘

紅芪多糖對(duì)HLA-B27相關(guān)前葡萄膜炎TNF-α和IL-10的影響

許卓再1，于晉懿2，毛毳1，王婧1，余爍1，盧弘1

目的探討紅芪多糖（HPS）對(duì)HLA-B27相關(guān)前葡萄膜炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-10（IL-10）的影響。方法選擇10名處于急性炎癥期的HLA-B27相關(guān)前葡萄膜炎患者，常規(guī)藥物治療4周，在炎癥緩解期，抽取他們的外周血，經(jīng)過分離和培養(yǎng)得到單個(gè)核細(xì)胞。將單個(gè)核細(xì)胞平均分為4組，分別用磷酸鹽緩沖液（PBS）、細(xì)菌脂多糖（LPS）、LPS+HPS、HPS處理各組單個(gè)核細(xì)胞，PBS處理組為對(duì)照組，LPS的終末濃度為1 mg·L-1，HPS的終末濃度為200 mg·L-1。在各組單個(gè)核細(xì)胞接受處理4 h、8 h、12 h、24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測(cè)其中TNF-α和IL-10的含量。結(jié)果患者單個(gè)核細(xì)胞受LPS處理后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中各時(shí)點(diǎn)的TNF-α和IL-10含量均明顯高于PBS處理組（P＜0.05）；HPS+LPS處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中各時(shí)點(diǎn)的TNF-α含量以及前2個(gè)時(shí)點(diǎn)的IL-10含量高于LPS處理組（P＜0.05）；HPS處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-10的含量與PBS處理組比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論HLA-B27相關(guān)前葡萄膜炎炎癥緩解期患者外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)中，紅芪多糖促進(jìn)LPS刺激后的單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-α和IL-10，提示紅芪多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑參與炎癥反應(yīng)的過程。

紅芪多糖；HLA-B27相關(guān)前葡萄膜炎；外周血單個(gè)核細(xì)胞；TNF-α；IL-10

前葡萄膜炎是臨床上最常見的葡萄膜炎類型，HLA-B27（人類白細(xì)胞抗原B27）相關(guān)前葡萄膜炎是前葡萄膜炎中病因最明確的一類，HLA-B27陽(yáng)性的急性前葡萄膜炎占急性前葡萄膜炎（acute anterior uveitis，AAU）的18%～32%〔1〕。糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑是治療葡萄膜炎的常規(guī)藥物，兩者的長(zhǎng)期應(yīng)用均會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的副作用。近年來(lái)，尋找作用較強(qiáng)、副作用小的新型中藥制劑成為研究熱點(diǎn)〔2〕。

紅芪是豆科植物多序巖黃芪干燥根，紅芪具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌等功效，是一種應(yīng)用較為廣泛的傳統(tǒng)中藥。紅芪多糖（radix hedysari polysaccharide，HPS）是紅芪的主要活性成分，有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、減輕糖尿病并發(fā)癥等作用〔3〕。

細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的毒性成分，是目前較常用的免疫炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)劑，本實(shí)驗(yàn)將選用LPS誘導(dǎo)的單個(gè)核細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)中HLA-B27相關(guān)前葡萄膜炎的模型。急性前葡萄膜炎的發(fā)病過程中，有大量的炎癥相關(guān)細(xì)胞和分子參與。單個(gè)核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞是一種重要的參與炎癥反應(yīng)細(xì)胞，能分泌多種可溶性炎癥細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著非常重要的作用〔4〕。

在本課題的前期研究中，利用動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HPS可通過抑制Toll樣受體4（Toll-like receptor-4，TLR4）和它下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生的大鼠急性前葡萄膜炎〔5〕。本次實(shí)驗(yàn)，我們通過監(jiān)測(cè)體外單個(gè)核細(xì)胞的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）的含量，研究HPS對(duì)LPS誘導(dǎo)的HLA-B27相關(guān)急性前葡萄膜炎緩解期離體單個(gè)核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，以進(jìn)一步明確HPS參與炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

HPS（蘭州大學(xué)藥學(xué)院）。LPS（18001株，古典生物型，小川血清型），蘭州生物制品研究所。磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國(guó)Thermo Scientific公司），外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破饭荆琑PMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo Scientific公司），胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司），谷氨酰胺（美國(guó)Hyclone公司），青霉素、鏈霉素（中國(guó)華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司），TNF-α、IL-10 ELISA試劑盒（美國(guó)R&D Systems公司）。SCB-1520型超凈臺(tái)（中國(guó)哈東聯(lián)公司），MicroCL17R型微量冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司），F(xiàn)orma 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），Venticell系列精密強(qiáng)制對(duì)流干燥箱（德國(guó)MMM公司），TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司），MULTISKAN MK3全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.2臨床資料

參照國(guó)際葡萄膜炎研究組（International Uveitis Study Group）制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)和分類〔6〕，2013年1月到2013年7月期間，選擇符合條件的HLA-B27相關(guān)前葡萄膜炎患者10例為研究對(duì)象，6名男性，4名女性，年齡18～45歲，平均年齡28歲。10位研究對(duì)象均為HLA-B27陽(yáng)性的強(qiáng)直性脊柱炎患者，且沒有其他全身免疫性疾病。10位患者急性前葡萄膜炎經(jīng)過常規(guī)治療4周處于緩解期，所有參與試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象均簽署知情同意書，且本次臨床研究已獲得首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：靜脈穿刺抽取每位HLA-B27相關(guān)急性前葡萄膜炎緩解期患者靜脈血32 ml，并在室溫下用等量的PBS稀釋。采取Ficoll密度梯度法分離單個(gè)核細(xì)胞：（1）按2：1的比例，將稀釋后的靜脈血沿管壁緩慢注入淋巴細(xì)胞分離液中；（2）以2 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min；（3）小心吸取包含單個(gè)核細(xì)胞的云霧層，并用PBS洗滌（1 500 r/min×5 min）2次；（4）將清洗后的細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中（含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清、2mmol·L-1谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素各100000 U·L-1），臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)示活細(xì)胞＞95%，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109·L-1，然后將細(xì)胞懸浮液接種于12孔培養(yǎng)板中。37℃，5%CO2，95%相對(duì)濕度的條件下培養(yǎng)4 h使單個(gè)核細(xì)胞貼壁。然后用PBS充分洗滌12孔板除去未貼壁的細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞。

1.3.2分組和處理：將分離得到單個(gè)核細(xì)胞平均分為4組。（1）對(duì)照組：培養(yǎng)孔板中加入PBS；（2）LPS單獨(dú)處理組：培養(yǎng)孔板中加入LPS，終末濃度為1 mg·L-1；（3）LPS+HPS聯(lián)合處理組：加入LPS前30 min時(shí)向培養(yǎng)孔板中加入HPS，終末濃度為200 mg·L-1，LPS終末濃度為1 mg·L-1；（4）HPS單獨(dú)處理組：向培養(yǎng)孔板中加入HPS，終末濃度為200 mg·L-1。分別于加入LPS后4 h、8 h、12 h、24 h時(shí)，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液并在-80℃的條件下儲(chǔ)存。

1.3.3檢測(cè)TNF-α和IL-10：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法測(cè)定收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-10的含量：（1）每孔中加入50 μl試劑盒內(nèi)稀釋液；（2）加入200 μl的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本，錫紙遮蓋室溫孵育2 h；（3）每孔用洗滌緩沖液400 μl完全洗滌4次，最后1次洗滌后，將殘留液體倒置晾干；（4）在每孔中加入200 μl的TNF-α/IL-10共軛試劑，室溫孵育1 h。重復(fù)步驟（3）；（5）加入200 μl底物溶液，室溫下避光孵育20 min；（6）各孔加入50 μl終止液，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定各孔的光密度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析比較單個(gè)核細(xì)胞不同處理組間TNF-α和IL-10的含量差異，兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量。LPS刺激后單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10各時(shí)點(diǎn)的含量均較對(duì)照組明顯上升（P＜0.05），并分別在24 h和8 h時(shí)達(dá)到最大（TNF-α，221.57 ng·L-1；IL-10，22.41 ng·L-1）。HPS+LPS處理組各時(shí)點(diǎn)的TNF-α含量始終高于LPS處理組（P＜0.05），最大值出現(xiàn)在12 h時(shí)（586.61 ng·L-1）；IL-10含量的最大值出現(xiàn)在8 h（27.13 ng·L-1），其中4 h、8 h的數(shù)值高于LPS處理組（P＜0.05），12 h及24 h的數(shù)值與LPS處理組結(jié)果接近（P＞0.05）。HPS處理組與PBS對(duì)照組單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量在所有時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P＞0.05）（表1、表2，圖1）。

表1　各組不同時(shí)間單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量比較（，ng·L-1）

表1　各組不同時(shí)間單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量比較（，ng·L-1）

注：相同時(shí)間組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與LPS組比較，P＜0.05；③與對(duì)照組組比較，P＞0.05TNF-α：腫瘤壞死因子αLPS：脂多糖HPS：紅芪多糖

組別樣本量4 h 8 h 1 2 h 2 4 h對(duì)照組1 0 6 . 3 3 ± 2 . 3 0 9 . 3 5 ± 1 . 5 7 1 0 . 2 9 ± 1 . 8 2 1 3 . 9 6 ± 2 . 6 9 L P S組1 0 4 9 . 0 5 ± 1 5 . 0 5①1 0 8 . 3 9 ± 3 0 . 0 3①1 9 1 . 9 9 ± 4 2 . 7 6①2 2 1 . 5 7 ± 3 7 . 1 2①L P S + H P S組1 0 3 5 2 . 3 5 ± 1 7 . 0 6②4 4 4 . 5 7 ± 1 6 . 6 7②5 8 6 . 6 1 ± 2 0 . 9 9②5 5 2 . 2 7 ± 2 3 . 8 6②H P S組1 0 6 . 6 8 ± 2 . 6 0③1 0 . 6 5 ± 1 . 7 1③1 1 . 5 1 ± 1 . 9 9③1 6 . 2 2 ± 3 . 3 3③F值2 1 0 7 . 5 2 1 4 3 4 . 9 8 1 2 9 4 . 7 0 1 3 0 8 . 9 9 P值＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1

表2　各組不同時(shí)間單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10含量比較（，ng·L-1）

表2　各組不同時(shí)間單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10含量比較（，ng·L-1）

注：相同時(shí)間組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與LPS組比較，P＜0.05；③與LPS組比較，P＞0.05；④與對(duì)照組組比較，P＞0.05IL-10：白細(xì)胞介素-10LPS：脂多糖HPS：紅芪多糖

組別樣本量4 h 8 h 1 2 h 2 4 h對(duì)照組1 0 6 . 7 3 ± 0 . 8 3 1 3 . 5 9 ± 0 . 8 1 1 2 . 0 6 ± 0 . 8 3 1 0 . 2 6 ± 0 . 7 4 L P S組1 0 8 . 5 3 ± 1 . 1 4①2 2 . 4 1 ± 2 . 5 8①1 7 . 6 2 ± 1 . 4 5①1 1 . 7 0 ± 1 . 1 0 L P S + H P S組1 0 9 . 5 3 ± 0 . 8 3②2 7 . 1 3 ± 2 . 7 7②1 7 . 7 2 ± 1 . 7 1③1 1 . 0 0 ± 1 . 6 8 H P S組1 0 7 . 0 1 ± 1 . 0 9④1 4 . 4 2 ± 1 . 2 0④1 2 . 1 0 ± 0 . 8 1④1 0 . 0 3 ± 1 . 2 6 F值1 7 . 9 3 1 0 3 . 2 6 6 5 . 3 0 3 . 7 0 P值＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1＜0 . 0 0 1 0 . 2 0 0

3　討論

HLA-B27相關(guān)急性前葡萄膜炎是一種急性起病、可反復(fù)發(fā)病的難治性致盲眼病〔7〕。糖皮質(zhì)激素是治療葡萄膜炎的一線用藥，長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的系統(tǒng)性和眼部并發(fā)癥。具有免疫調(diào)節(jié)劑作用的中藥制劑，可以考慮用來(lái)治療葡萄膜炎。HPS是一種傳統(tǒng)中藥的提取物，能加強(qiáng)紅細(xì)胞的固有免疫和T淋巴細(xì)胞的免疫功能〔8〕。

圖1　ELISA法檢測(cè)各組單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α和IL-10含量的變化情況（）。1A.1B.顯示LPS組與對(duì)照組的比較結(jié)果，1C.1D.顯示所有四個(gè)組的比較結(jié)果。LPS刺激后單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量明顯上升，TNF-α含量在24 h內(nèi)持續(xù)上升；IL-10含量先升后降，8 h達(dá)到最大值，24 h接近初始含量。HPS預(yù)處理后的單個(gè)核細(xì)胞受LPS刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的含量也呈現(xiàn)持續(xù)增高趨勢(shì)，在12 h達(dá)到最大值；IL-10的含量也呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在8 h達(dá)到最大值ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)TNF-α：腫瘤壞死因子αIL-10：白細(xì)胞介素-10 LPS：脂多糖HPS：紅芪多糖

IL-10是由Th細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有免疫抑制活性的內(nèi)源性細(xì)胞因子，通過下調(diào)TLR4的表達(dá)來(lái)減輕炎癥反應(yīng)〔9〕。有研究表明IL-10家族基因中部分與非感染性葡萄膜炎相關(guān)〔10〕。TNF-α是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，是一種參與葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞因子〔11〕。葡萄膜炎患者血清中的TNF-α和TNF-α受體含量升高〔12〕，升高的TNF-α可能與葡萄膜炎的復(fù)發(fā)性有關(guān)〔13〕。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)HLA-B27相關(guān)急性前葡萄膜炎緩解期患者的離體單個(gè)核細(xì)胞，采用不同的處理方式，來(lái)測(cè)定單個(gè)核細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-10的水平，研究HPS的免疫功能。我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激單個(gè)核細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-10明顯高于對(duì)照組，模擬了HLA-B27相關(guān)急性前葡萄膜炎的炎癥反應(yīng)過程。

經(jīng)HPS預(yù)處理的單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-10的水平高于未經(jīng)紅芪多糖預(yù)處理組，HPS預(yù)處理促進(jìn)了單個(gè)核細(xì)胞分泌TNF-α和IL-10。而單獨(dú)用HPS處理的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-10的含量并不升高，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。提示，單獨(dú)用HPS處理單個(gè)核細(xì)胞，并不引起炎性改變；HPS只在LPS誘發(fā)單個(gè)核細(xì)胞的炎癥條件下，促進(jìn)TNF-α和IL-10的分泌，參與炎癥調(diào)控反應(yīng)。

體外細(xì)胞試驗(yàn)，可以清晰地考察某種成分對(duì)于某種細(xì)胞因子的影響，但是離體環(huán)境有別于機(jī)體正常的內(nèi)環(huán)境，脫離了綜合的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及神經(jīng)體液的調(diào)控作用，也缺失了體內(nèi)各種組織細(xì)胞之間相互的生物學(xué)關(guān)系。因此所獲得的研究結(jié)果，不能簡(jiǎn)單地進(jìn)行體內(nèi)的推論，我們也將通過后續(xù)的整體實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步研究。

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Role of radix hedysari polysaccharide on TNF-α and IL-10 in HLA-B27 associated acute anterior uveitis

XU Zhuozai，YU Jingyi，MAO Cui，et al.
Department of Ophthalmology，Beijing Chao-Yang Hospital，Capital Medical University，Beijing 100020，China

OBJECTIVE To observe the effect of radix hedysari polysaccharide（HPS）on the production of tumor necrosis factor alpha（TNF-α）and interleukin-10（IL-10）by peripheral blood mononuclear cells from patients with HLA-B27 associate acute anterior uveitis（AAU）.METHODS Mononuclear cells samples were isolated from 10 patients with HLA-B27 associate AAU during recovery course in its acute period of onset after 4 weeks medical treatment.Mononuclear cells isolated and cultured from the patients were divided into 4 groups，and were treated by phosphate buffered saline（PBS，as control group），lipopolysaccharide（LPS），HPS+LPS and HPS respectively.The final concentration of LPS is 1 mg·L-1.HPS was added 30 minutes before the adding of LPS in final concentration of 200 mg·L-1.Samples of culture supernatants were harvested at different times（4 h，8 h，12 h and 24 h）after stimulation.Concentration of TNF-α and IL-10 in cell culture supernatant samples were measured with enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.RESULTS After stimulated by LPS，the concentrations of TNF-α and IL-10 in culture supernatants of the patients are significantly higher than control group（P＜0.05）.The production of TNF-α and IL-10 of the LPS+HPS treatment group was higher than the LPS treatment group（P＜0.05）.The production of TNF-α and IL-10 of the HPS treatment group shown no difference comparing with the control group. CONCLUSIONS In the in-vitro test of isolated peripheral blood mononuclear cells from the patients with HLA-B27 associate AAU after recovering，HPS promote the secretion of IL-10 and TNF-α produced by mononuclear cells stimulated with LPS.Test indicatedsthat HPS as immune modulators involveds in the process of inflammatory reaction.

radix hedysari polysaccharide（HPS）；HLA-B27 associate acute anterior uveitis（AAU）；peripheral blood mononuclear cells；tumor necrosis factor alpha（TNF-α）；interleukin-10（IL-10）

R773

A

1002-4379（2016）03-0154-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.03.004

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81471575；81273246）

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院眼科，北京100020 2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院眼科，煙臺(tái)264000

盧弘，E-mail：honglucmu@outlook.com