李雪麗，唐由之，范吉平，，許　凱，梁　潔，梁麗娜

·論著：實驗研究·

補腎益精方對RCS大鼠視網(wǎng)膜變性損傷的保護作用研究

李雪麗1，2，唐由之2，范吉平2，3，許凱3，梁潔2，梁麗娜2

目的從形態(tài)及功能兩個方面觀察補腎益精方（BSYJ）對RCS大鼠視網(wǎng)膜變性損傷的保護作用。方法采用先天性視網(wǎng)膜色素變性RCS大鼠作為動物模型，將36只RCS大鼠隨機分為蒸餾水組和BSYJ組，每組18只，分別予蒸餾水及BSYJ水煎劑灌胃（8.8 g·kg-1），每日1次，以SD大鼠作為正常對照組常規(guī)飼養(yǎng)。分別于干預(yù)7 d、14 d和28 d進行指標(biāo)觀察，采用視覺電生理儀檢測各組大鼠視網(wǎng)膜電圖變化；HE染色觀察視網(wǎng)膜各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化，并計數(shù)外核層的細(xì)胞核數(shù)目。結(jié)果視網(wǎng)膜電圖結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，RCS大鼠ERG波幅明顯降低，在7周齡時波幅幾近消失。與蒸餾水組相比，治療7 d時，BSYJ組明視ERG，暗視ERG以及Ops波幅略有提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在治療14d時，BSYJ組暗視ERG波幅值較蒸餾水組明顯提高（P＜0.05），治療28 d時，BSYJ組明視ERG，暗視ERG以及Ops波幅均較蒸餾水組有明顯改善（P＜0.05，P＜0.01）。病理學(xué)檢查顯示，與SD大鼠相比，隨著觀察時間延長，RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層逐漸變薄，外核層細(xì)胞數(shù)減少。與蒸餾水組比較，BSYJ組在7 d、14 d、28 d觀察時間點視網(wǎng)膜形態(tài)改善，外核層細(xì)胞核數(shù)目明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論BSYJ方對RCS大鼠視網(wǎng)膜變性損傷具有一定的保護作用，可能延緩病情的發(fā)展過程。

補腎益精方；視網(wǎng)膜變性；視網(wǎng)膜電圖；外核層；內(nèi)核層

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP）是嚴(yán)重的致盲性眼病，主要表現(xiàn)為光感受器細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞進行性損傷而導(dǎo)致的視功能障礙〔1〕。目前，典型的RP在世界各地發(fā)病率約為1/3000～1/5000〔2〕，世界范圍內(nèi)約有150萬RP患者〔3〕，且至今尚無有效的治療方法。目前研究的方法主要有藥物干預(yù)、基因治療、細(xì)胞移植替代、神經(jīng)營養(yǎng)因子干預(yù)〔4-6〕。后三種方法雖極具前景，但由于技術(shù)、倫理及價格昂貴等難題限制了其臨床應(yīng)用的進程。中醫(yī)認(rèn)為RP屬于高風(fēng)雀目范疇，其病機與腎精不足，目失所養(yǎng)有關(guān)。補腎益精方（BSYJ）是唐由之研究員多年治療RP的經(jīng)驗方，前期臨床初步觀察發(fā)現(xiàn)，BSYJ對RP患者的視功能具有較好的改善作用，但缺乏確切的實驗依據(jù)以及規(guī)范的臨床研究予以證實。為進一步明確BSYJ對視網(wǎng)膜色素變性的作用，本研究選擇先天性RP動物RCS大鼠為動物模型，從形態(tài)學(xué)及功能兩個方面觀察BSYJ對其視網(wǎng)膜變性損傷的保護作用，為BSYJ臨床治療RP提供實驗依據(jù)和理論參考。

1　材料與方法

1.1動物

SD大鼠，18只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供；RCS大鼠，36只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供。大鼠均為3周齡，雄性，飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，室溫控制在20～26℃，相對濕度控制在40～70%，光照12 h明暗交替。

1.2主要試劑及儀器

實驗用藥為BSYJ（藥物組成：首烏，黃精，枸杞子等）按原方配伍制備水煎液濃縮而成，由中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院藥學(xué)部提供。水合氯醛（國藥集團工業(yè)股份有限公司）；鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司）；鹽酸塞拉嗪注射液（吉林省華牧動物保健品有限公司）；復(fù)方托吡卡胺滴眼液（參天制藥中國有限公司）；鹽酸奧布卡因滴眼液（參天制藥中國有限公司）；卡波姆滴眼液（Dr.Gerhard Mann， Chem.-Pharm.Fabrik GmbH，德國）；HE染色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；RETI-scan系統(tǒng)視覺電生理檢測儀、Ganzfeld全視野刺激器（均為羅蘭公司，德國）；EG1150模塊化組織包埋中心HI1210、RM2245輪轉(zhuǎn)式切片機、HI1210攤片機、HI1220烘片機、DM2500顯微鏡（均為LEICA，德國）。

1.3分組與給藥

SD大鼠18只為正常組（Control group）；RCS大鼠為實驗組動物，共36只，隨機分為蒸餾水組（Vehicle group）和中藥組（BSYJ group），每組18只。中藥組：BSYJ 8.8 g·kg-1灌胃給藥，每日1次，蒸餾水組灌服等量的蒸餾水，分別于7 d、14 d、28 d進行相關(guān)指標(biāo)評價，每個時間點取6只動物，進行相應(yīng)操作和各個實驗指標(biāo)測定。

1.4閃光視網(wǎng)膜電圖（flashelectroretinogram，F(xiàn)-ERG）測定

實驗前將各組大鼠轉(zhuǎn)移至暗房過夜，暗適應(yīng)后采用鹽酸氯胺酮-鹽酸塞拉嗪混合麻醉藥（v：v=1：7）肌注麻醉大鼠，行雙眼ERG檢測，所有步驟均在暗紅燈下操作。首先，采用復(fù)方托吡卡胺滴眼液常規(guī)散瞳20 min，再滴鹽酸奧布卡因行角膜表面麻醉。測定前，于角膜中央滴卡波姆眼用凝膠，安裝金箔環(huán)狀角膜電極，參考電極和接地電極分別置于大鼠額部中央和同側(cè)下肢皮下。以Ganzfeld全視野刺激器進行刺激，檢測暗適應(yīng)條件下3.0 cd·s·m2ERG和振蕩電位（oscillatory potentials，OPs）；再以30 cd·m2白色背景光下明適應(yīng)10 min后測定3.0 cd·s·m2ERG。測定過程中，所有刺激間隔時間為30 s，采樣頻率為0.06 Hz；通頻帶為0.3～150 Hz，各電極間阻抗始終保持＜5 kΩ。分別記錄ERG的a波和b波峰時值（ms）和振幅值（μv），并對暗適應(yīng)條件下3.0 cd·s·m2ERG b波、OPs和明適應(yīng)條件下3.0 cd·s·m2ERG b波的振幅值（μv）進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.5HE染色觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化

F-ERG檢查結(jié)束后，水合氯醛麻醉大鼠（ip.350mg·kg-1），快速摘取眼球，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，經(jīng)視神經(jīng)矢狀面行連續(xù)4 μm切片，切片過視神經(jīng)。常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)變化，計數(shù)內(nèi)核層（inner nuclear layer，INL）和外核層（outer nuclear layer，ONL）細(xì)胞核層數(shù)，并于400放大倍數(shù)，選擇不重疊的4個視野（以視神經(jīng)為中點的兩側(cè)各拍攝2個視野）攝片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，計數(shù)每個視野中兩個50 μm長度范圍內(nèi)ONL的細(xì)胞核數(shù)并取平均值，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

用origin 8.0軟件進行統(tǒng)計，各組實驗數(shù)據(jù)通過正態(tài)性分布、方差齊性檢驗后，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ERG檢測結(jié)果

暗視ERG：由圖1可見，與各自正常組相比，蒸餾水組ERG b波振幅均明顯降低（F=1.19664，P= 2.87068E-5；F=1.1804，P=2.78186E-10；F=0.60715，P=2.44214E-15）；蒸餾水組14 d和28 d未記錄到較典型的ERG反應(yīng)圖形，且28 d時ERG反應(yīng)圖形接近熄滅型。BSYJ治療7 d后，RCS大鼠ERG b波振幅與模型組相比沒有明顯差異；BSYJ治療14 d和28 d后，ERG呈現(xiàn)較典型的ERG反應(yīng)圖形，且b波振幅呈明顯升高，與蒸餾水組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.1804，P=0.01977；F=0.60715，P=1.35215E-5）。

圖1　A各組大鼠暗適應(yīng)ERG混合反應(yīng)圖形

圖1　BBSYJ對RCS大鼠暗適應(yīng)ERG混合反應(yīng)b波的影響（，n=6）

明視ERG：蒸餾水組和BSYJ組28 d時均無典型的明適應(yīng)ERG反應(yīng)圖形，除此外，其余各組均可記錄到典型的明適應(yīng)ERG反應(yīng)圖形（圖2A）。與各自正常組相比，蒸餾水組ERG b波振幅值均明顯降低（F=0.67571，P=3.71493E-4；F=2.04519，P=0.01667；F=1.49947，P=2.5325E-9）；BSYJ分別治療7 d和14 d后，ERG b波振幅與各自蒸餾水組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；BSYJ治療28 d后，RCS大鼠明視ERG b波振幅值明顯增加，與蒸餾水組相比（F=1.44947， P=0.02454），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2B）。

OPs：除蒸餾水組28 d時無典型的明適應(yīng)OPs圖形外，其余各組均可記錄到典型的OPs圖形（圖3A）。與各自正常對照組相比，蒸餾水組RCS大鼠OPs總振幅值均明顯降低（F=5.13529，P=8.61137 E-9；F=3.36573，P=4.44844E-12；F=3.21127，P= 7.47635E-14）；而BSYJ治療28 d后，RCS大鼠OPs總振幅值明顯增加，與蒸餾水組相比（F=3.21127，P=0.00608），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）。

2.2HE染色觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變

光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜HE染色切片（圖4A）。正常組7 d、14 d和28 d大鼠視網(wǎng)膜分層清晰，各層細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)無異常（圖4B），INL由4～7層相對較大的細(xì)胞核構(gòu)成；ONL由10～14層排列緊密、相對較小的細(xì)胞核構(gòu)成。蒸餾水組7 d時RCS大鼠視網(wǎng)膜INL由4～6層細(xì)胞核組成，ONL由6～8層細(xì)胞核組成，與正常組7 d時相比，ONL胞核排列疏松，且數(shù)量明顯減少（F=3.05179，P= 1.04968E-8）；BSYJ治療7 d后，視網(wǎng)膜ONL胞核排列整齊致密，數(shù)量明顯增加（F=3.05179，P=0.01576）。蒸餾水組14 d、28 d時RCS大鼠視網(wǎng)膜ONL逐漸變薄，由4～6層變?yōu)?～4層，細(xì)胞核排列更加疏松，可見空泡，特別是胞核數(shù)目均明顯減少，與各自正常組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.58262，P=2.82334 E-8；F=1.49625，P=1.86896E-13）。BSYJ分別治療14 d和28 d后，ONL能夠維持在5～8層和3～5層，細(xì)胞排列相對整齊，胞核的丟失得到明顯控制，與各自蒸餾水組相比（F=1.58262，P=0.01442；F=1.49625，P=1.54975E-5），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖2　A各組大鼠明適應(yīng)ERG反應(yīng)圖形

圖2　BBSYJ方對RCS大鼠明適應(yīng)ERG b波振幅的影響（，n=6）

圖3　A各組大鼠暗適應(yīng)OPs反應(yīng)圖形

3　討論

本研究選擇RCS大鼠為研究對象，觀察了BSYJ對實驗性RP的保護作用。RCS大鼠是一種較成熟的視網(wǎng)膜退化性病變動物，具有人類RP的主要特征，是廣泛用于RP病因及治療方法研究的經(jīng)典模型〔7〕。RCS大鼠出生后2周視網(wǎng)膜形態(tài)和功能表現(xiàn)正常，3周時光感受器細(xì)胞核數(shù)目開始減少，5周后F-ERG波幅值開始下降，約8周時呈熄滅狀態(tài)，且光感受器細(xì)胞接近消失，在本實驗中也發(fā)現(xiàn)，同齡的RCS大鼠與SD大鼠相比，無論是視網(wǎng)膜ERG檢查還是組織病理學(xué)觀察，RCS大鼠均出現(xiàn)了明顯的異常改變，提示RCS大鼠在病變過程中，視網(wǎng)膜的形態(tài)和功能都出現(xiàn)了類似于RP的改變，這與已有的研究報道〔8〕是相似的。

圖3　BBSYJ對RCS大鼠暗適應(yīng)OPs總振幅的影響（，n=6）

圖4　A視網(wǎng)膜各層示意圖（HE染色，400×）

圖4　B各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)改變（HE染色，400×）

表1　BSYJ對大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞數(shù)量的影響（，n=6）

表1　BSYJ對大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞數(shù)量的影響（，n=6）

注：①與正常組比較，P＜0.01；與蒸餾水組比較，②P＜0.05，③P＜0.01。正常組：SD大鼠；蒸餾水組和BSYJ組為RCS大鼠。BSYJ：補腎益精方

外核層細(xì)胞核數(shù)/ 5 0 μ m 7 d 1 4 d 2 8 d正常組2 1 5 ± 2 2 1 9 8 ± 2 2 1 8 2 ± 1 2蒸餾水組1 1 3 ± 8①9 4 ± 1 1①4 4 ± 6①B S Y J組1 4 0 ± 9②1 2 4 ± 1 2②8 0 ± 9③組別

本實驗以BSYJ對3周齡RCS大鼠進行治療，于治療7 d，14 d，28 d后分別進行相關(guān)評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BSYJ治療14 d后暗視ERG波幅值較蒸餾水組顯著增加，BSYJ治療28 d的RCS大鼠暗視ERG、明視ERG波幅值及OPs上升支節(jié)律性小波〔9〕總振幅值與蒸餾水組相比均明顯增加。暗視ERG及明視ERG主要反映了視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的功能，而OPs被認(rèn)為起源于內(nèi)層視網(wǎng)膜，可能來自無長突細(xì)胞到雙極細(xì)胞間的抑制性反饋回路〔10〕，這表明BSYJ能夠較好的維持并改善RCS大鼠外層視網(wǎng)膜和內(nèi)層視網(wǎng)膜的功能。本研究進一步通過組織病理學(xué)觀察了RCS大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。隨著鼠齡的增加，RCS大鼠視網(wǎng)膜外核層逐漸變薄，細(xì)胞核排列漸變疏松且數(shù)目減少；而BSYJ治療7 d、14 d、28 d后視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列相對規(guī)整，外核層層數(shù)以及細(xì)胞核密度較蒸餾水組明顯增加，表明視網(wǎng)膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)得到了改善。

中醫(yī)認(rèn)為RP是由于先天稟賦不足或臟腑內(nèi)損，氣血不足，真元耗傷，精氣不能上榮于目所致，故以“補腎益精”為其基本治則。BSYJ由唐由之研究員多年臨床經(jīng)驗總結(jié)而得，該方重用制首烏、黃精為君藥，以補肝腎、益精血、填精髓，枸杞子滋養(yǎng)肝腎、益精明目，菟絲子補腎益精、養(yǎng)肝明目共為臣藥，同時佐以其它理氣活血之藥，使其補而不滯，靜中有動，精血得以上注暢達于目〔11〕，使髓海得充，目絡(luò)得養(yǎng)，共奏補腎明目之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，制首烏的有效成分二苯乙烯苷對神經(jīng)細(xì)胞有保護作用，并且能促進神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新，向神經(jīng)元方向分化〔12-13〕。黃精中有效成分黃精多糖對APP轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CAI區(qū)超微結(jié)構(gòu)具有改善作用，可使腦組織中神經(jīng)元數(shù)目增多，神經(jīng)變性減輕〔14〕。枸杞子自古被譽為“養(yǎng)肝明目”之圣藥，近年來的研究表明枸杞子及其多糖成分對防治RP、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼等眼部疾病均有一定功效〔15-19〕。隨著現(xiàn)代藥理研究的逐步深入，各單味藥的作用機制也將更加明確，這不僅為BSYJ治療實驗性RP的研究提供重要依據(jù)，也為其進一步開發(fā)提供重要參考。

綜上所述，本研究初步證明BSYJ對RCS大鼠視網(wǎng)膜進行性損傷具有較好的保護作用，一定程度上延緩了疾病的進程，但其作用環(huán)節(jié)及機制還有待進一步研究闡明。

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Study of Bushenyijing Decoction's protective effect on retinal degeneration in RCS rats

LI Xueli,TANG Youzhi,FAN Jiping,et al.
Post-doctoral Research Station,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing, 100700,China

OBJECTIVE To investigate the effect of Bushenyijing Decoction（BD）on retinopathy in RCS rats by studying the retinal function and histopathology.METHODS Royal College of Surgeons（RCS）rats were used as an animal model of retinal degeneration.Thirty-six RCS rats were randomly divided into two groups:the distilled water group and the Bushenyijing Decoction（BD）group while SD rats were used as normal control group.The mice of BSYJF group were administrated with Bushenyijing Decoction（BD）solution by gavage（8.8 g·kg-1）,and the mice in distilled water group were treated with distilled water by gavage,while the SD mice were fed normally.At the 7thdays,14thdays and 28thdays after treatment,their effects were assessed respectively.The flash electroretinogram（FERG）was used to detect the function of the retina.Hematoxylin-eosin（HE）staining was used to evaluate the retinal histopathological changes and the number of photoreceptor nucleiin the outer nuclear layer（ONL）.RESULTS The ERG result showed that in contrast with normal control group,the amplitude of RCS rats was significantly decreased,and it almost disappeared when the RCS rats were 7 weeks old.At 7thday after treatment,in comparison with the distilled water group,the amplitude of photopic ERG,scotopic ERG and Ops of the Bushenyijing Decoction（BD）group was increased slightly,but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.At 14thday after treatment,b-wave amplitudes of scotopic ERG in the BSYJ group was significantly higher than the distilled water group（P＜0.05）.At 28thday after treatment, the amplitudes of scotopic ERG,photopic ERG,andOPs in Bushenyijing Decoction（BD）group were all markedly higher than that in distilled water group（P＜0.05,P＜0.01）.It was shown by pathological examination that in comparison with SD mice,the ONL layer in the RCS rats attenuated gradually,and the number of nucleus decreased either.Comparing with the distilled water group,the pathological change in the BSYJ group was improved and more nuclei were preserved at all three time points.（P＜0.05,P＜0.01）.CONCLUSION BThe Bushenyijing Decoction（BD）had protective effect on retinal degeneration lesion in RCS rats,and it might delay the development process of retinal degeneration.

Bushenyijing Decoction（BD）;retinal degeneration;flash electroretinogram;outer nuclear layer; inner nuclear layer

R285.5

A

1002-4379（2016）03-0144-06

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.03.002

國家自然科學(xué)基金（81473736）；國家人力資源和社會保障部留學(xué)人員科技活動擇優(yōu)項目

1中國中醫(yī)科學(xué)院博士后流動站，北京100070 2中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京100040 3中國中醫(yī)科學(xué)院，北京100070

梁麗娜，E-mail：lianglina2001@hotmail.com