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        基因沉默整合素連接酶對(duì)胰腺癌細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

        2016-11-30 14:11:38魏洪吉
        中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥 2016年27期

        魏洪吉

        【摘要】 目的 探討基因沉默整合素連接酶(ILK)對(duì)胰腺癌細(xì)胞(Panc-1)上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響。方法 培養(yǎng)Panc-1細(xì)胞, 構(gòu)建ILK-specific-shRNA慢病毒載體后, 再行轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞, 通過(guò)Western-blot技術(shù)驗(yàn)證感染基因的有效性, 同時(shí)比較Panc-1細(xì)胞上皮向EMT轉(zhuǎn)化標(biāo)志性蛋白E-鈣連蛋白(E-cadherin)表達(dá)情況。結(jié)果 ①基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細(xì)胞的遷移、侵襲能力, 且陽(yáng)性組細(xì)胞遷移率和侵襲率均為(0.15±0.03), 明顯低于陰性組(0.43±0.02), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.572, P<0.01)。②SDS- 聚丙烯酰胺凝膠電脈法(SDS-PAGE)結(jié)果:E-cadherin的條帶為122~141 KD, GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后KD組E-cadherin表達(dá)為(0.545±0.011), 明顯高于陰性組(0.079±0.004), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.942, P<0.01)。結(jié)論 基因沉默ILK轉(zhuǎn)染后, 明顯抑制Panc-1細(xì)胞遷移、侵襲能力, 顯著上調(diào)E-cadherin 表達(dá), 逆轉(zhuǎn)了EMT 的發(fā)生。

        【關(guān)鍵詞】 基因沉默;整合素連接酶;胰腺癌細(xì)胞;上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化

        DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.27.194

        胰腺癌發(fā)病率占常見(jiàn)惡性腫瘤的1%~2%, 死亡率高[1]。由于多數(shù)患者在確診時(shí)己發(fā)生癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移, 無(wú)法進(jìn)行胰腺切除手術(shù), 只能采用化療、放療等姑息治療手段, 隨之產(chǎn)生的副作用嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量。尋找新的治療思路迫在眉睫。ILK是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白, 是多種致瘤相關(guān)因素的上游交叉點(diǎn), 與腫瘤的形成、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。因此, 研究ILK對(duì)胰腺癌細(xì)胞EMT的影響可能是一種新的治療思路。

        1 材料與方法

        1. 1 材料 人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù);兔E-cadherin抗體、ILK多克隆抗體、BCA蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑、PVDF膜等購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品;轉(zhuǎn)膜電泳槽購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司;PCR儀(PE2400)購(gòu)自美國(guó)Perking Elmer公司。

        1. 2 方法

        1. 2. 1 ILK-specific shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建 針對(duì)目的基因序列, 采用siSearch和sFold兩種在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)核苷酸序列[3]。將自行合成的含干擾序列的雙鏈DNAoligo兩端含酶切位點(diǎn)的粘端連入酶切后的RNA干擾載體上, 再轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞, 對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定, 測(cè)序比對(duì), 鑒定陽(yáng)性即構(gòu)建成功。

        1. 2. 2 感受態(tài)細(xì)胞的制備轉(zhuǎn)染 人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株常規(guī)接種于高糖杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液中[4](含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素), 于5%二氧化碳飽和濕度、37℃條件下培養(yǎng), 每2天換液1次。將一個(gè)上述培養(yǎng)基中的單菌落轉(zhuǎn)到SOB培養(yǎng)基中, 37℃劇烈振搖3 h, 然后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌預(yù)冷的丙烯管中, 冷卻至0℃, 以4000 r/min離心10 min回收細(xì)胞。以0.1 mol/L CaCl2重懸, 4℃下, 4000 r/min離心10 min回收細(xì)胞, 連接反應(yīng)制備克隆連接液, 轉(zhuǎn)化。正常目的細(xì)胞在6孔板上分為三組:①空白組:未感染任何病毒;②陰性組:加陰性對(duì)照病毒感染;③陽(yáng)性組:加RNAi靶點(diǎn)病毒感染。感染4 d后行PCR檢測(cè)。

        1. 2. 3 Western blot 檢測(cè) 提取目的細(xì)胞中的蛋白, 蛋白定量法(BCA法)對(duì)蛋白進(jìn)行定量測(cè)定。再取適量蛋白樣品, 95℃加熱變性, 以SDS-PAGE分離, 每孔上樣量為100 μg。常規(guī)處理后轉(zhuǎn)至PVDF膜, 5%脫脂牛奶封閉40 min, 倒掉封閉液, 加一抗4℃孵育過(guò)夜, TBST洗膜3次, 分別加入相應(yīng)的二抗孵育1 h后TBST洗膜3次, 最后化學(xué)發(fā)光法顯影, 暗室曝光, 使用凝膠掃描儀掃描分析, 以Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

        1. 2. 4 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)操作如下:鑷子經(jīng)乙醇消毒后, 置于培養(yǎng)箱中達(dá)到室溫, 然后以其處理侵襲室內(nèi)的嵌入物, 加入300 μl無(wú)血清培養(yǎng)基。各組細(xì)胞以無(wú)血清培養(yǎng)基重懸, 以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù), 調(diào)整細(xì)胞密度約為5×108個(gè)。取200 μl細(xì)胞懸液加入侵襲室上室嵌入物, 下室加入500 μl 胎牛血清(FBS)高于侵襲室的培養(yǎng)基, 于組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3 d。去除培養(yǎng)基, 以棉拭子拭去非侵襲細(xì)胞, 于每孔嵌入物中加入500 μl染色液染色, 浸泡20 min, 再反復(fù)沖洗, 空氣中晾干, 以10%醋酸溶解, A570檢測(cè)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟同侵襲實(shí)驗(yàn), 但下室所加FBS濃度為30%。

        1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2. 1 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)Panc-1遷移和侵襲的影響 基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細(xì)胞的遷移、侵襲能力, 且陽(yáng)性組細(xì)胞遷移率和侵襲率均為(0.15±0.03), 明顯低于陰性組(0.43±0.02), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.572, P<0.01)。

        2. 2 siRNA 慢病毒轉(zhuǎn)染 Panc-1 細(xì)胞后E-cadherin 表達(dá)情況 SDS-PAGE結(jié)果:E-cadherin的條帶為122~141 KD, GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后KD組E-cadherin表達(dá)為(0.545±0.011), 明顯高于陰性組(0.079±0.004), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.942, P<0.01)。

        3 討論

        胰腺癌是預(yù)后較差的惡性腫瘤之一, 由于胰腺癌早期診斷困難, 且易發(fā)生血液或淋巴轉(zhuǎn)移, 一般確診后生存期平均≤6個(gè)月, 5年內(nèi)生存率<5%[5], 給社會(huì)和患者家庭造成極大負(fù)擔(dān)。癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是目前臨床研究的熱點(diǎn)。ILK作為整合素和生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個(gè)重要效應(yīng)物, 調(diào)節(jié)著細(xì)胞的豁附、生存、分化和凋亡, 對(duì)腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等發(fā)揮著重要作用[6]。莊翔等[7]研究顯示, ILK在人類神經(jīng)源性腫瘤、胃癌、卵巢腫瘤、黑色素瘤、肺癌中ILK表達(dá)明顯增高。上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。正常情況下EMT的發(fā)生受到嚴(yán)密調(diào)控, 但腫瘤發(fā)展過(guò)程中, EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的重要途徑。ILK作為EMT的誘導(dǎo)因子, 在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中有與癌基因類似的效應(yīng), 因此有效的抑制ILK的表達(dá)或降低其生物學(xué)活性是抗腫瘤治療的關(guān)鍵。E-cadherin為EMT的標(biāo)志性蛋白, ILK的過(guò)度表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致E-cadherin的減少或缺失, 檢測(cè)E-cadherin 蛋白表達(dá)情況可反映ILK對(duì)EMT的影響。

        研究顯示, 基因沉默ILK明顯的抑制了Panc-1細(xì)胞的遷移、侵襲能力, 且陽(yáng)性組細(xì)胞遷移率和侵襲率均為(0.15±0.03), 明顯低于陰性組(0.43±0.02), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.572, P<0.01)。同時(shí), SDS-PAGE結(jié)果顯示:E-cadherin的條帶為122~141 KD, GAPDH為37 KD的條帶。siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞后KD組E-cadherin表達(dá)為(0.545±0.011), 明顯高于陰性組(0.079±0.004)(t=28.942, P<0.01)。表明ILK可通過(guò)抑制Panc-1細(xì)胞遷移、侵襲能力、上調(diào)E-cadherin 表達(dá)抑制EMT發(fā)生, 可作為胰腺癌臨床治療的重要思路。

        綜上所述, 基因沉默ILK可明顯抑制Panc-1細(xì)胞遷移、侵襲能力, 上調(diào)E-cadherin 表達(dá), 逆轉(zhuǎn)EMT 的發(fā)生。

        參考文獻(xiàn)

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        [2] 李曉紅, 陸晶晶, 朱慧, 等. 抑制微小RNA-200a表達(dá)對(duì)胰腺癌上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2014, 31(10):2178-2181.

        [3] 謝傳高, 魏樹(shù)梅, 陳清宇, 等. GEP100基因沉默抑制胰腺癌細(xì)胞AsPC-1的侵襲能力. 中國(guó)病理生理雜志, 2010, 26(7):1348-1351.

        [4] Bradford JW, Baldwin AS. Chapter Three-IKK/Nuclear Factor-kappaB and Oncogenesis: Roles in Tumor-Initiating Cells and in the Tumor Microenvironment. Advances in Cancer Research, 2014, 121(121):125-145.

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        [6] 黃懿, 韶云鵬, 丁留成, 等. 過(guò)表達(dá)整合素連接酶基因腺病毒體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2014, 31(6):1373.

        [7] 莊翔, 朱軍, 呂夢(mèng)欣, 等. 特異性ILK siRNA對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞EMT及移植瘤生長(zhǎng)的影響. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2016, 36(2):191-198.

        [收稿日期:2016-07-26]

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