程西永，呼曉賢，李海霞，董中東，任 妍，陳樹林，詹克慧，許海霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002)

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低溫脅迫下小麥幼穗中差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定

程西永，呼曉賢，李海霞，董中東，任 妍，陳樹林，詹克慧，許海霞

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002)

為探究低溫脅迫下小麥幼穗中脅迫響應(yīng)差異表達(dá)蛋白,采用IEF/SDS-PAGE雙向凝膠電泳及質(zhì)譜技術(shù),以低溫敏感品種SW601和低溫不敏感品種隴麥157為材料，對(duì)常溫生長(zhǎng)、0 ℃低溫脅迫12 h和72 h 的幼穗全蛋白進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,在pH 4～7時(shí),SW601和隴麥157各處理幼穗蛋白圖譜中均可重復(fù)檢測(cè)到800～900個(gè)有效蛋白質(zhì)點(diǎn)；低溫脅迫12 h、72 h后，SW601和隴麥157中上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)分別有120個(gè)和101個(gè),下調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)分別有92個(gè)和60個(gè)。對(duì)2種脅迫處理下均差異表達(dá)且Ratio>2的54個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析,成功鑒定出43個(gè)差異蛋白。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索匹配和蛋白質(zhì)鑒定，這43個(gè)差異蛋白分別屬于脅迫應(yīng)激/防御相關(guān)蛋白、光合作用蛋白、蛋白代謝相關(guān)蛋白、碳水化合物代謝相關(guān)蛋白、信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白、能量產(chǎn)生和運(yùn)輸相關(guān)蛋白和未知功能蛋白等7類蛋白。其中，抗壞血酸過(guò)氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶和胚胎后期發(fā)育富集(LEA)同源蛋白14-A等蛋白的表達(dá)量在低溫不敏感材料隴麥157中變化顯著,而在低溫敏感材料SW601中沒有表達(dá),這可能與小麥幼穗在低溫逆境下的代謝調(diào)控和低溫敏感特性有一定關(guān)系。

小麥；幼穗；低溫脅迫；雙向電泳；脅迫響應(yīng)蛋白

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物之一，提高小麥產(chǎn)量對(duì)保證我國(guó)糧食安全具有重要意義。小麥生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭遇干旱、極端溫度(低溫和高溫)和高鹽等非生物脅迫，使小麥生長(zhǎng)發(fā)育和代謝受到抑制,甚至導(dǎo)致植株死亡[1]。在各種非生物脅迫中,低溫對(duì)小麥產(chǎn)量的影響尤為突出,是制約小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素[2]。小麥發(fā)育進(jìn)程中,低溫會(huì)影響穗部發(fā)育和結(jié)實(shí)，在二棱末期-雌雄蕊分化期遭遇低溫，會(huì)直接影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。近年來(lái),黃淮麥區(qū)春季低溫發(fā)生頻率呈增加趨勢(shì)，探究小麥春季低溫受害機(jī)理,選育抗春季低溫能力較強(qiáng)的新品種,可有效降低“倒春寒”對(duì)小麥生產(chǎn)的危害。低溫逆境下,植物組織內(nèi)部生理生化代謝和蛋白質(zhì)表達(dá)都會(huì)發(fā)生變化。目前,雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)是研究逆境脅迫下蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)之一。Cui等[4]對(duì)漸進(jìn)溫度處理下水稻幼苗葉片差異表達(dá)蛋白研究中,獲得60個(gè)與低溫誘導(dǎo)相關(guān)的差異蛋白點(diǎn),質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)分子伴侶蛋白有利于提高植物的低溫耐受性。韓巧霞等[5]對(duì)-5 ℃冷凍處理1 d和3 d小麥葉片的全蛋白進(jìn)行了分離,質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)與應(yīng)激脅迫相關(guān)的抗壞酸過(guò)氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶和LEA蛋白等在適應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Cabane等[6]的研究表明，熱休克蛋白HSP70與大豆抗寒性密切相關(guān)。前人在油菜、菠菜、番茄、楊樹等植物中也鑒定出大量耐冷相關(guān)蛋白[7-8],這些蛋白通過(guò)感知逆境轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào),并通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)逆境脅迫響應(yīng)蛋白的表達(dá),從而響應(yīng)脅迫條件下植物生長(zhǎng)和代謝[9]。因此,尋找逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白對(duì)于提高植物的抗逆性具有重要意義。

目前,蛋白質(zhì)表達(dá)的研究大多集中在植物葉片、根、莖、胚乳、花藥、花粉、種子等器官中，而關(guān)于低溫敏感期小麥幼穗受到低溫脅迫后差異蛋白的研究較少。本研究以低溫敏感和不敏感的兩個(gè)小麥品種為供試材料,采用IEF/SDS-PAGE雙向凝膠電泳技術(shù)，對(duì)常溫及低溫脅迫12 h和72 h的小麥幼穗全蛋白進(jìn)行分離，利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析和鑒定,旨在尋找小麥幼穗中與低溫脅迫誘導(dǎo)相關(guān)的差異蛋白,從蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究小麥幼穗的抗寒機(jī)理,以期為小麥抗寒育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為低溫敏感品種SW601和低溫不敏感品種隴麥157,均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥遺傳育種研究室提供。

試驗(yàn)于2013-2014年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行。采用盆栽，盆直徑24 cm，高20 cm,底部各打6個(gè)小孔,每盆裝土10 kg左右,埋入土中,盆內(nèi)土壤與大田持平。2013年10月10號(hào)播種,每個(gè)材料種植9盆,每盆定苗10株。2014年3月20日開始通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和鏡檢判斷幼穗的發(fā)育時(shí)期,幼穗發(fā)育至雌雄蕊分化期時(shí),進(jìn)行室內(nèi)低溫脅迫處理。

低溫脅迫溫度設(shè)為0 ℃,處理時(shí)間為12 h和72 h,每個(gè)處理3次重復(fù),以常溫條件下生長(zhǎng)的幼穗材料為對(duì)照(CK)；低溫處理結(jié)束后,在冰上剝?nèi)⌒←溣姿?并立即放入離心管中液氮速凍,-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥幼穗蛋白質(zhì)的提取

采用TCA/丙酮沉淀法[10]進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。取-80 ℃冰箱保存的雌雄蕊分化期小麥幼穗1 g，加入少量的PVPP和石英砂,在研缽中迅速研磨成細(xì)粉,加入5 mL預(yù)冷的10%(w/v)的TCA和0.07% DTT的丙酮溶液,-20 ℃沉淀過(guò)夜；4 ℃, 16 000 r·min-1離心30 min,棄上清液，沉淀中加入2 mL預(yù)冷的80%丙酮(含0.07% DTT),充分混合后,放在-20 ℃靜置過(guò)夜；4 ℃,16 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,洗滌沉淀,重復(fù)洗滌2～3次至蛋白為純白色；用純丙酮替代80%丙酮洗滌,沉淀后真空冷凍干燥成干粉,向蛋白干粉中加入裂解液[8 mol·L-1urea，2 mol·L-1Thisoua, 4% CHAPS(w/v),40 mmol·L-1DTT],25 ℃水浴2 h,期間振蕩數(shù)次,室溫14 000 r·min-1離心40 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱備用[11]。蛋白含量的測(cè)定參考Bradford法[12],用BSA(牛血清蛋白)標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度蛋白溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 幼穗全蛋白的雙向凝膠電泳

第一向等電聚焦(IEF)電泳：按照Bio-rad公司的電泳操作指南進(jìn)行,采用pH 4～7、24 cm的膠條,根據(jù)已測(cè)蛋白濃度,取900 μg蛋白樣品和一定體積的緩沖液[8 mol·L-1urea,2 mol·L-1thisoua,4% CHAPS(w/v),40 mmol·L-1DTT、Bio-lyte pH 3～7]至總體積450 μL,在室溫20 ℃泡脹IPG膠條，12～14 h后進(jìn)行等電聚焦,設(shè)置聚焦程序?yàn)?50 v/30 min、500 v/90 min、1 000 v/2 h、9 000 v/5 h、9 000 v/99 000 Vh、500 v/12 h，采用50 uA電流進(jìn)行電泳。

第二向SDS-PAGE凝膠電泳：第一向等電聚焦電泳結(jié)束后,將膠條放在平衡液I[6 mol·L-1urea,2%(w/v)SDS,20%(v/v)甘油,1.5 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.8),2%(w/v) DTT]中平衡15 min，平衡結(jié)束后潤(rùn)洗膠條2～3 min，再放入平衡液II[6 mol·L-1urea,2%(w/v)SDS,20%(v/v)甘油,1.5 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.8),2.5%(w/v)碘乙酰胺]中平衡15 min,用鑷子將平衡結(jié)束的膠條轉(zhuǎn)移至12%的垂直SDS-PAGE凝膠中，加入少量低熔點(diǎn)瓊脂糖固定膠條，凝固后20 ℃水浴電泳，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)停止電泳，進(jìn)行凝膠的固定、染色和脫色。

1.2.3 圖像掃描及差異蛋白點(diǎn)篩選

采用UMAX PowerLook 2100XL凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像,用PDQuest 7.3 software(Bio-Rad)軟件對(duì)圖像進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)、背景扣除、凝膠匹配和差異蛋白點(diǎn)的定量分析。電泳重復(fù)3次，從各處理中選取一張質(zhì)量高的膠圖進(jìn)行PDQuest軟件分析，以常溫下SW601和隴麥157幼穗蛋白電泳圖為對(duì)照(CK),利用PDQuest軟件篩選低溫脅迫后蛋白表達(dá)豐度變化在2倍以上的差異蛋白點(diǎn)。

1.2.4 質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

將在2種低溫處理下均差異表達(dá)且Ratio>2的蛋白點(diǎn)用修剪過(guò)的Eppdorf槍頭挖出，置于盛有少量去離子水的1.5 mL離心管中，標(biāo)記序號(hào)送往中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得肽指紋圖譜。檢測(cè)儀器型號(hào)為5800 MALDI-TOF/TOF/質(zhì)譜儀，檢測(cè)方式為正離子反射模式。質(zhì)譜鑒定結(jié)果利用MASCOT(http://www.matrixscience.com)網(wǎng)站的相關(guān)軟件，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，獲得差異蛋白的種類等相關(guān)信息。

1.2.5 差異蛋白質(zhì)功能鑒定和分類

鑒定成功的蛋白質(zhì)利用UniProt(http://www.ebi.uniprot.org)軟件來(lái)確定其功能，利用COG(cluster of orthologous groups of proteins)功能分類軟件進(jìn)行功能分類。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下小麥幼穗差異表達(dá)蛋白分析

采用雙向電泳技術(shù)對(duì)CK和低溫脅迫12 h、72 h的小麥幼穗全蛋白進(jìn)行分離(圖1)。利用PDQuest software(Bio-Rad)軟件對(duì)圖像進(jìn)行蛋白點(diǎn)匹配和檢測(cè)，在CK和低溫脅迫12 h、72 h的SW601和隴麥157的幼穗中均檢測(cè)到800～900個(gè)有效蛋白質(zhì)點(diǎn)。與CK對(duì)比發(fā)現(xiàn)，SW601和隴麥157中分別有41個(gè)和52個(gè)蛋白點(diǎn)在低溫脅迫12 h和72 h后均呈差異表達(dá)，其中Ratio>2的蛋白點(diǎn)分別有23個(gè)和31個(gè)。利用MALDA-TOF-MS技術(shù)對(duì)Ratio>2的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)鑒定，在SW601和隴麥157中分別成功鑒定出18個(gè)和25個(gè)蛋白點(diǎn)(表1和表2)。

從表1可以看出，低溫脅迫處理后,隴麥157中上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)為抗壞血酸過(guò)氧化物酶(點(diǎn)17、18)、Cu/Zn超氧化物歧化酶(點(diǎn)19)、胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白14-A(點(diǎn)13、14)、T-complex蛋白1γ亞基(點(diǎn)1)、T-complex蛋白1亞基(點(diǎn)4)、1,6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)移酶β亞基(點(diǎn)2)、5-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(點(diǎn)3)、40S核糖體蛋白(點(diǎn)15)、烯醇化酶(點(diǎn)5)、 2,3-二磷酸甘油酸不依賴甘油酸變位酶(點(diǎn)6)、蛋白酶β亞基type-7-A(點(diǎn)22)和細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(點(diǎn)23)。表達(dá)量下調(diào)的蛋白點(diǎn)為真核轉(zhuǎn)運(yùn)起始因子4A-1(點(diǎn)7)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶TaPDIL1-1(點(diǎn)9)、放氧增強(qiáng)蛋白(點(diǎn)16)、β-微管蛋白5、1、3(點(diǎn)10、11、12)、Rubisco大亞基(點(diǎn)24)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基(點(diǎn)25)和磷酸丙糖異構(gòu)酶(點(diǎn)20、21)。

從表2可以看出，低溫脅迫后，SW601中上調(diào)表達(dá)的蛋白點(diǎn)為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(點(diǎn)33)、冷休克主導(dǎo)蛋白2(點(diǎn)30)、α-1,4-葡聚糖蛋白合酶(點(diǎn)38)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(點(diǎn)39)和14-3-3蛋白(點(diǎn)32)。表達(dá)量下調(diào)的蛋白點(diǎn)為40S核糖體蛋白(點(diǎn)26)、亞精胺合酶1(點(diǎn)27)、真核轉(zhuǎn)運(yùn)起始因子3亞基(點(diǎn)28)、核酮糖二磷酸羧化酶α亞基結(jié)合蛋白(點(diǎn)29)、核酮糖二磷酸羧化酶β亞基結(jié)合蛋白(點(diǎn)31)、70 kDa熱激同源蛋白1(點(diǎn)43)、烯醇化酶(點(diǎn)34、35)、胞質(zhì)3-磷酸甘油酸激酶(點(diǎn)36)、異檸檬酸脫氫酶(點(diǎn)41)和ATP合成酶CF1α亞基(點(diǎn)42)。

隴麥157中的蛋白點(diǎn)17和18(抗壞血酸過(guò)氧化物酶)、13和14(胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白)以及SW601中的蛋白點(diǎn)34和35(烯醇化酶),這些蛋白點(diǎn)雖然在同一塊凝膠的不同位置，但卻具有相同的分子量(Mr)和PI值,質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示為同一種蛋白質(zhì)。

a、b、c分別代表CK和低溫脅迫12 h、72 h的隴麥157幼穗2-DE圖譜；d、e、f 分別代表CK和低溫脅迫12 h、72 h的SW601幼穗2-DE圖譜。

a, b, c represent the 2-DE map of Longmai 157 spike with low temperature for 0 h, 12 h and 72 h,respectively; d, e, f represent the 2-DE map of SW601 spike with low temperature for 0 h, 12 h and 72 h,respectively.

圖1 低溫脅迫下隴麥157和SW601幼穗蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜

表2 低溫脅迫下SW601幼穗差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜分析結(jié)果

2.2 不同小麥品種幼穗差異表達(dá)蛋白的功能分析

低溫脅迫后，40S核糖體蛋白、烯醇化酶和真核轉(zhuǎn)運(yùn)起始因子蛋白在2個(gè)小麥材料中(隴麥157 中蛋白點(diǎn)15、5、7，SW601中蛋白點(diǎn)26、34、35、28)均出現(xiàn)差異表達(dá)?？箟难徇^(guò)氧化物酶(蛋白點(diǎn)17和18)、Cu/Zn超氧化物歧化酶(蛋白點(diǎn)19)和胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白(蛋白點(diǎn)13和14)等脅迫應(yīng)激蛋白在隴麥157中的表達(dá)量發(fā)生了明顯變化,而在SW601中的CK和低溫處理圖譜中均沒檢測(cè)到這些蛋白質(zhì)。冷休克主導(dǎo)蛋白2(蛋白點(diǎn)30)、70 kDa熱激同源蛋白1(蛋白點(diǎn)43)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(蛋白點(diǎn)33)在SW601中發(fā)生了差異表達(dá),而在隴麥157中則沒有檢測(cè)到(表1和表2)。

從差異表達(dá)蛋白的功能分類來(lái)看，低溫敏感材料SW601和低溫不敏感材料隴麥157 在蛋白種類和數(shù)量上均存在一定的差異。SW601中18個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的功能可以分為7類，其中碳水化合物代謝相關(guān)蛋白所占例最大(33.3%)，隴麥157中25個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的功能可以分為6類，蛋白質(zhì)代謝相關(guān)蛋白所占比例最大(40%)。低溫脅迫后SW601中存在1個(gè)能量產(chǎn)生和運(yùn)輸?shù)鞍缀?個(gè)光合作用相關(guān)蛋白,而隴麥157中不存在能量產(chǎn)生和運(yùn)輸?shù)鞍?但增加了1個(gè)光合作用相關(guān)蛋白(3個(gè))。

3 討 論

低溫脅迫下，植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化代謝以及與脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)均會(huì)發(fā)生變化，且植物抗寒能力高低與脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白的合成和表達(dá)有直接關(guān)系。研究表明,參與蛋白合成、蛋白折疊和細(xì)胞壁合成有關(guān)的蛋白與水稻葉片對(duì)低溫的耐受性密切相關(guān)[5],蛋白表達(dá)量的變化與小麥自身耐冷性強(qiáng)弱有直接的關(guān)系[13]。

3.1 參與脅迫應(yīng)激或防御的蛋白

低溫逆境下抗壞血酸過(guò)氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶的過(guò)量表達(dá)可有效清除環(huán)境脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的ROS,提高植物抗逆性[14-15],LEA蛋白在低溫條件下具有保護(hù)細(xì)胞膜及維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用[16]。本研究結(jié)果表明，低溫處理后,抗壞血酸過(guò)氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶和胚胎后期發(fā)育富集同源蛋白14-A在低溫不敏感材料隴麥157的幼穗中均上調(diào)表達(dá),而在低溫敏感材料SW601幼穗中沒有表達(dá)。推測(cè)隴麥157中抗壞血酸過(guò)氧化物酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶參與了低溫脅迫下氧化應(yīng)激反應(yīng),在清除H2O2和ROS中發(fā)揮了一定作用。

在低溫敏感材料SW601中鑒定出了熱激同源蛋白、冷休克主導(dǎo)蛋白2和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶。熱激蛋白主要在動(dòng)物疾病和寄生蟲中研究較多[17]，具有分子伴侶的功能，逆境脅迫下可形成具有一定空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)逆境脅迫的耐受性[18-19]。低溫脅迫可誘導(dǎo)植物中熱激蛋白(HSP70)的蛋白質(zhì)合成。本研究中，低溫脅迫后敏感材料SW601中70 kD熱激同源蛋白下調(diào)表達(dá),這可能與低溫敏感材料SW601中的熱激蛋白在低溫脅迫下蛋白質(zhì)合成受到抑制有關(guān)。

3.2 參與光合作用的相關(guān)蛋白

光合作用對(duì)低溫最為敏感,低溫逆境下植物葉綠體光化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞,光合速率下降,CO2的利用受阻, 同時(shí)可使光合系統(tǒng)中多種酶的活性受到抑制，從而影響光合作用過(guò)程中一系列電子傳遞系統(tǒng)[20-21]，最終導(dǎo)致核酮糖二磷酸羧化酶(Rubisco)發(fā)生降解[22]。本研究中,隴麥157中鑒定出3個(gè)參與卡爾文循環(huán)的蛋白，分別為Rubisco 大亞基、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基和放氧增強(qiáng)蛋白；而SW601中僅鑒定出2個(gè)，即核酮糖二磷酸羧化酶亞基結(jié)合蛋白的α、β亞基。其中，Rubisco大亞基、Rubisco α、β亞基結(jié)合蛋白的亞基等都是光合作用過(guò)程中影響CO2固定的關(guān)鍵酶[23]。Santos等[24]通過(guò)對(duì)6 ℃低溫處理6 h、24 h的水稻葉片差異表達(dá)蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，Rubisco大亞基和Rubisco亞基結(jié)合蛋白大亞基的表達(dá)都下調(diào)，且降解加速。在本研究中，隴麥157和SW601中的5個(gè)光合作用相關(guān)蛋白在低溫脅迫12 h和72 h后均下調(diào)表達(dá),這與Santos的研究結(jié)果基本一致,表明低溫脅迫下植物光合系統(tǒng)受到了破壞。

3.3 碳水化合物代謝相關(guān)蛋白

碳水化合物代謝主要控制糖的代謝、轉(zhuǎn)化及分配,磷酸丙糖異構(gòu)酶是糖代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶,在糖酵解途徑中發(fā)揮重要作用。研究表明,小麥在長(zhǎng)期低溫馴化過(guò)程中磷酸丙糖異構(gòu)酶會(huì)增加[25]。低溫脅迫下,烯醇化酶、2,3-二磷酸甘油酸不依賴磷酸甘油酸變位酶和磷酸丙糖異構(gòu)酶等參與糖酵解途徑的蛋白，在低溫不敏感材料隴麥157中上調(diào)表達(dá)；而烯醇化酶、胞質(zhì)3-磷酸甘油酸激酶和D-3-磷酸甘油醛脫氫酶則在低溫敏感材料SW601中下調(diào)表達(dá)。在糖酵解過(guò)程中，磷酸丙糖異構(gòu)酶可將二羥丙酮磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦视腿?3-磷酸，只有甘油醛-3-磷酸才可繼續(xù)進(jìn)入糖酵解途徑。然而，SW601中沒有出現(xiàn)磷酸丙糖異構(gòu)酶，可能與低溫脅迫下其表達(dá)量太低或其表達(dá)受到抑制有關(guān)，這將使SW601糖酵解途徑中糖代謝及能量產(chǎn)生和運(yùn)輸無(wú)法順利進(jìn)行，從而導(dǎo)致SW601糖代謝途徑相關(guān)蛋白酶的表達(dá)量下調(diào)，最終影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，使其抗性減弱。

3.4 蛋白代謝相關(guān)蛋白

蛋白質(zhì)二硫鍵在二硫鍵及氨基酸支鏈的結(jié)合與形成方面發(fā)揮著重要作用[26]。低溫脅迫對(duì)植物核糖體蛋白的合成具有較大影響,在大豆中發(fā)現(xiàn)3個(gè)受低溫脅迫誘導(dǎo)的核糖體蛋白[27]。低溫脅迫下,40S核糖體蛋白SA在隴麥157幼穗中呈上調(diào)表達(dá),而在SW601中則呈下調(diào)表達(dá),這可能與參與蛋白質(zhì)翻譯的核糖體蛋白在對(duì)低溫敏感度不同材料中的表達(dá)模式有關(guān),上調(diào)表達(dá)可能有利于提高小麥幼穗抗低溫的能力。二硫鍵異構(gòu)酶在隴麥157中下調(diào)表達(dá),在SW601中沒有表達(dá),這與Yan等[28]的研究結(jié)果基本相似。

3.5 能量運(yùn)輸與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白

ATP合酶是一種膜結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在葉綠體和線粒體能量轉(zhuǎn)換中可以催化ATP的合成和水解,進(jìn)行跨膜質(zhì)子運(yùn)輸,同時(shí)緩解植物脅迫傷害[29]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,14-3-3蛋白和某些蛋白激酶可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中介，通過(guò)不同的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)逆境脅迫下細(xì)胞的正常代謝和響應(yīng)[30]。

低溫脅迫處理后,SW601中的ATP合酶CF1α亞基表達(dá)下調(diào),這可能與逆境脅迫下植物原生質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞,ATP的合成以及光合作用受到抑制有關(guān)。SW601中的14-3-3 蛋白和隴麥157中細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶的表達(dá)豐度都有所增加,推測(cè)低溫脅迫下它們?cè)谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中通過(guò)調(diào)控耐冷相關(guān)基因表達(dá)而提高植物抗逆性方面發(fā)揮了一定作用。

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Identification and Analysis of Differentially Expressed Proteins in Wheat Young Spike under Cold Stress

CHENG Xiyong, HU Xiaoxian, LI Haixia, DONG Zhongdong,REN Yan, CHEN Shulin, ZHAN Kehui, XU Haixia

(Henan Agricultural University/National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science/Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops, Zhengzhou, Henan 450002, China)

In order to study the proteins responsing to low temperature(LT) in wheat(TriticumaestivumL.) spike, two varieties SW601(LT sensitive ) and Longmai 157(LT insensitive) were used to analyze the total protein profile under low temperature at 0 ℃ for 12 h and 72 h by two-dimensional electrophoresis and matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry method,the spike under normal growth temperature conditions was control. The results show that there are 800 to 900 protein spots for each variety within pH 4 to 7. After 12 h and 72 h low temperature stress treatment,120 up-regulated and 92 down-regulated protein spots were found in SW601, while 101 up-regulated and 60 down-regulated protein spots were detected in Longmai 157. Fifty-four proteins spots which were significantly expressed with the expression ratio more than 2 under two temperature stress conditions were selected. There were 43 protein spots identified by mass spectrometry analysis.Using protein blast methods, the identified cold stress responsive proteins were classified into seven groups including stress/defense, photosynthesis, protein metabolism, carbohydrate metabolism, signal transduction, energy pathways and other unknown function. Some of the expressed proteins were enhanced significantly in LT insensitive varieties Longmai 157,such as ascorbate peroxidase,Cu/Zn superoxide dismutase,and late embryogenesis abundant,while they were not expressed in LT sensitive SW601.These protein may related to metabolic regulation or response characteristics of wheat spike under low temperature stress.

Wheat; Young spike; Low-temperature stress; Two-dimensional electrophoresis; Stress response protein

時(shí)間：2016-10-08

2016-03-12

2016-04-14

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2014CB138105)；河南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(15A180039)

E-mail：xyc634@163.com

許海霞(E-mail:hauxhx@163.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)10-1342-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161008.0932.018.html