吳成，任海雷，趙志強(qiáng)，王蕾

(1.山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)村能源總站，濟(jì)南 250100； 2.沂源縣農(nóng)業(yè)檢測(cè)中心，山東沂源 256100)

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定甘藍(lán)中4-羥基百菌清的殘留量

吳成1，任海雷2，趙志強(qiáng)1，王蕾1

(1.山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)村能源總站，濟(jì)南 250100； 2.沂源縣農(nóng)業(yè)檢測(cè)中心，山東沂源 256100)

建立液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定甘藍(lán)中4-羥基百菌清殘留的方法。以乙腈提取樣品中的4-羥基百菌清，采用電噴霧負(fù)離子源(ESI–)和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式測(cè)定，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)法定量。結(jié)果表明，甘藍(lán)中4-羥基百菌清的質(zhì)量濃度與其色譜峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.999)，線(xiàn)性范圍為1.0～100 μg／L，方法檢出限為0.31 μg／kg，定量限為1.0 μg／kg。在5，10，50 μg／kg 3個(gè)添加水平下，方法的回收率為88.0%～91.4%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～7.2%(n=6)。該法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、靈敏，符合法規(guī)殘留限量監(jiān)測(cè)要求。

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法；4-羥基百菌清；甘藍(lán)

百菌清是一種廣譜高效保護(hù)性殺菌劑，主要用于防治蔬菜、大田作物和果樹(shù)真菌病害［1–3］。4-羥基百菌清是百菌清主要降解產(chǎn)物，其毒性比百菌清強(qiáng)，對(duì)人類(lèi)健康影響比百菌清重［4–8］。美國(guó)、加拿大、澳大利亞和國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)等農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中百菌清殘留定義為百菌清及4-羥基百菌清之和，以百菌清計(jì)［9–12］。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的4-羥基百菌清檢測(cè)方法有高效液相色譜法(帶紫外檢測(cè)器)［13–14］和甲基化–氣相色譜法(帶電子捕獲檢測(cè)器)［15–16］，這些方法操作繁瑣,易受干擾,靈敏度低。甘藍(lán)是百菌清用藥較多的蔬菜，筆者用液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法(LC–MS／MS)測(cè)定甘藍(lán)中4-羥基百菌清殘留量，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、靈敏，符合法規(guī)殘留限量監(jiān)測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：LCMS–8040型，配電噴霧離子源(ESI)，日本Shimadzu公司；

離心機(jī)：LDZ5–2型，北京京立離心機(jī)公司；食品加工機(jī)：k600型，荷蘭Philips公司；均質(zhì)器：T18型，德國(guó)IKA公司；

天平(1)：JY2001型，感量為0.1 g，上海精密儀器公司；

天平(2)：BT25 s型，感量為0.01 mg，德國(guó)賽多利斯公司；

4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于98%，加拿大TRC公司；

乙腈和甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司；

甲酸、乙酸銨和氯化鈉：分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司；

甘藍(lán)：市售，用本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)確保為無(wú)4-羥基百菌清殘留的空白樣品；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用天平(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取100.00 mg的4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇逐級(jí)稀釋配制成100 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于–20.0℃冰箱保存，使用時(shí)用甲醇水(1+1)稀釋至所需濃度。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 液相色譜

色譜柱：Shim-pack XR–ODSⅢ柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm，日本Shimadzu公司)；柱溫：40℃；流動(dòng)相：甲醇–0.1%甲酸水溶液(體積比為75∶25，含5 mmol／L乙酸銨)；流量：0.4 mL／min；等度洗脫；進(jìn)樣體積：1 μL；信號(hào)采集時(shí)間：13.0 min。

1.3.2 質(zhì)譜

電噴霧正離子源(ESI+)接口電壓：4.5 kV；電噴霧負(fù)離子源(ESI–)接口電壓：–3.5 kV；霧化氣：氮?dú)?，流量?.0 L／min；干燥氣：氮?dú)?，流量?5.0 L／min；碰撞氣：氬氣，壓力為230 kPa；脫溶劑管溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；駐留時(shí)間：10 ms；延遲時(shí)間：3 ms；監(jiān)測(cè)離子對(duì)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 4-羥基百菌清監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品處理

按GB／T 8855–2008 《新鮮水果和蔬菜取樣方法》 抽取甘藍(lán)樣品，取可食部分［17］，縮分、切碎、混勻，放入食品加工機(jī)中粉碎，制成待測(cè)樣，置于–20.0℃冰箱保存。用天平(2)稱(chēng)取樣品15.0 g于50 mL具塞離心管，加入30.0 mL乙腈，用均質(zhì)器以12 000 r／min均質(zhì)2 min，加入5.0 g氯化鈉，劇烈振搖2 min，以5 000 r／min離心5 min，取上清液1.5 mL過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

乙腈是蔬菜、水果農(nóng)藥多殘留標(biāo)準(zhǔn)分析方法的首選提取溶劑［18–19］，乙腈與水部分互溶，加入氯化鈉后，鹽析、分層和除雜效果明顯，因此實(shí)驗(yàn)選取乙腈作甘藍(lán)中4-羥基百菌清的提取溶劑。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別采用ESI+和ESI–模式掃描4-羥基百菌清母離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于母離子掃描信號(hào)強(qiáng)度，ESI–模式遠(yuǎn)高于ESI+模式；ESI–模式下，4-羥基百菌清減氫峰離子信號(hào)較強(qiáng)且穩(wěn)定，以相應(yīng)離子作母離子，利用島津LCMS–8040 Optimizer軟件對(duì)子離子、四極桿預(yù)桿偏置電壓(Q1和Q3)、碰撞電壓(CE)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

用優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件，在MRM模式下，進(jìn)0.1 mg／L 4-羥基百菌清標(biāo)液1.0 μL，得監(jiān)測(cè)離子對(duì)提取離子流圖見(jiàn)圖1。計(jì)算定性參考離子與定量離子信號(hào)強(qiáng)度比(相對(duì)離子強(qiáng)度，為43.6%)。依據(jù)歐盟2002／657|EC 文件［20］規(guī)定的質(zhì)譜技術(shù)中相對(duì)離子強(qiáng)度的最大允許限度范圍，結(jié)合樣品色譜峰保留時(shí)間和扣背景質(zhì)譜圖，可確證樣品中4-羥基百菌清的存在。

圖1 4-羥基百菌清監(jiān)測(cè)離子對(duì)提取離子流圖

2.3 凈化條件的選擇

甘藍(lán)的乙腈提取液色素含量低，若用傳統(tǒng)固相萃取柱凈化，則效率低，操作繁瑣。樣品前處理采取鹽析、乙腈提取、離心和過(guò)有機(jī)濾膜，能有效去除樣品提取溶液中的色素。并且當(dāng)前LC–MS／MS儀器結(jié)構(gòu)性能得到改進(jìn)，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)，清洗方便。另外，4-羥基百菌清為弱極性化合物，雜質(zhì)對(duì)其電噴霧離子化影響較小，樣品基質(zhì)對(duì)分析物測(cè)定的干擾可忽略不計(jì)。本實(shí)驗(yàn)樣品前處理方法,操作簡(jiǎn)單,回收率高、快速和經(jīng)濟(jì)，特適合大批量樣品農(nóng)藥多殘留檢測(cè)，是農(nóng)業(yè)部蔬菜質(zhì)量安全農(nóng)藥殘留例行監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估推薦的LC–MS／MS樣品前處理方法。

2.4 方法的特異性

用LC–MS／MS檢測(cè)4-羥基百菌清，選取信號(hào)響應(yīng)值高，特異性強(qiáng)的離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，輔之色譜分離，基質(zhì)干擾已減至最低，可忽略不計(jì)。4-羥基百菌清純?nèi)軇?biāo)樣與基質(zhì)標(biāo)樣，不含干擾離子對(duì)，對(duì)方法的特異性無(wú)影響。

2.5 線(xiàn)性范圍及定量限

用甘藍(lán)空白基質(zhì)液配制4-羥基百菌清1～100 μg／L系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在1.3儀器工作條件下測(cè)定4-羥基百菌清。以被測(cè)組分的色譜峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x，μg／L)作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)，分別以3倍和10倍信噪比(S／N)計(jì)算方法檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，4-羥基百菌清的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系(r=0.999)，方法檢出限為0.31 μg／kg，定量限為1.0 μg／kg。說(shuō)明該方法檢測(cè)靈敏度符合殘留檢測(cè)方法的要求［21］。

表2 線(xiàn)性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 精密度試驗(yàn)

在甘藍(lán)空白樣品中添加3個(gè)水平的4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液5,10,50 μg／kg，在1.3儀器工作條件下，每個(gè)水平重復(fù)6次，結(jié)果列于表3。由表3可知，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～7.2%，說(shuō)明該方法精密度符合食品中農(nóng)藥殘留分析要求［21］。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 回收試驗(yàn)

在甘藍(lán)空白樣品中添加3個(gè)水平的4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液5,10,50 μg／kg，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，甘藍(lán)中4-羥基百菌清3個(gè)水平添加平均回收率為88.0%～91.4%，說(shuō)明該方法的加標(biāo)回收率符合食品中農(nóng)藥殘留分析要求［21］。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)語(yǔ)

以乙腈作提取劑，經(jīng)液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法分析，建立了甘藍(lán)中4-羥基百菌清殘留的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，確證性和實(shí)用性強(qiáng)，可作為甘藍(lán)中4-羥基百菌清殘留的確證定性和定量檢測(cè)。

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Determination of 4-Hydroxychlorothalonil Residues in Cabbage by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry

Wu Cheng1， Ren Hailei2， Zhao Zhiqiang1， Wang Lei1
(1. Shandong Station of Agro-environment Protection and Rural Energy， Jinan 250100， China；2. Yiyuan Agricultural Inspection and Testing Center， Yiyuan 256100， China)

The method for determination of 4-hydroxychlorothalonil residue in cabbage by liquid chromatography–tandem mass spectrometry was established. The sample was extracted with acetonitrile, electrospray negative ion source(ESI–), multiple reaction monitoring mode (MRM), matrix–matched and standard curve method were applied to samples analysis. The results showed that there was the good linear relationship(r=0.999) between chromatographic peak area and mass concentration of 4-hydroxychlorothalonil residue in cabbage, the linear range was 1.0–100 μg／L, the detection limit was 0.31 μg／kg，the quantification limit was 1.0 μg／kg. The method validation was carried out at 5,10,50 μg／kg, the recoveries were from 88.0% to 91.4%, and the relative standard deviations of determination results were from 4.6% to 7.2%(n=6). The methods is simple, accurate, rapid, sensitive and suitable for monitoring the maximum residue limit of 4-hydroxychlorothalonil in cabbage.

liquid chromatography–tandem mass spectrometry; 4-hydroxychlorothalonil; cabbage

O657.63

A

1008–6145(2016)06–0071-04

10.3969／j.issn.1008–6145.2016.06.017

聯(lián)系人：吳成；E-mail: wucheng7745@sina.com

2016–09–21