王冠玉，馮 巖，王景春，王 巍，格根塔娜，蘇日古格，田宗民，余興邦

（1.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008；2.海拉爾區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，海拉爾 內(nèi)蒙古 021008；3.莫力達(dá)瓦達(dá)斡爾族自治旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 莫力達(dá)瓦 162850）

呼倫貝爾犢牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析

王冠玉1，馮 巖2，王景春3，王 巍1，格根塔娜1，蘇日古格1，田宗民1，余興邦1

（1.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021008；
2.海拉爾區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，海拉爾 內(nèi)蒙古 021008；
3.莫力達(dá)瓦達(dá)斡爾族自治旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 莫力達(dá)瓦 162850）

口蹄疫（foot and mouth disease，F(xiàn)MD）是一種高度接觸性病毒傳染病，傳播速度快，發(fā)病率高，可對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列入A類動(dòng)物傳染病之列，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其作為一類動(dòng)物疫病中的重點(diǎn)重大動(dòng)物疫病。目前，我國(guó)口蹄疫的主要防治措施依然是以滅活疫苗免疫為主，如何有效區(qū)分感染抗體與免疫抗體一直以來(lái)都是口蹄疫防控工作中亟待解決的重要難題。3ABC是口蹄疫病毒的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，它參與口蹄疫病毒RNA復(fù)制過(guò)程，是口蹄疫病毒一個(gè)高度保守區(qū)域。利用原核和真核系統(tǒng)表達(dá)的3ABC蛋白能與全部7個(gè)血清型的口蹄疫病毒感染血清發(fā)生免疫反應(yīng)，是鑒別免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物的理想抗原之一。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白，是國(guó)內(nèi)各地動(dòng)物防疫機(jī)構(gòu)鑒別口蹄疫病毒感染抗體與疫苗免疫抗體的最常用手段，對(duì)指導(dǎo)口蹄疫防控工作具有至關(guān)重要的作用。

本文通過(guò)使用兩種診斷試劑按不同比例稀釋被檢樣品，對(duì)比實(shí)驗(yàn)犢牛免疫前后口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在明顯變化。并分析結(jié)果總結(jié)規(guī)律，針對(duì)可能存在的影響因素，提出改進(jìn)建議。

1 材料與方法

1.1 診斷試劑與疫苗

北京某品牌口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體單抗阻斷ELISA試劑盒（FMDV20151020E）；甘肅某品牌口蹄疫病毒3ABC單抗阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（20151113129）；北京某品牌口蹄疫病毒通用型RT-PCR檢測(cè)試劑盒（FMD20151202P）；甘肅某品牌口蹄疫三價(jià)滅活疫苗。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

不同月齡、不同飼養(yǎng)環(huán)境下的臨床健康犢牛30頭，來(lái)源于免疫背景清晰、生產(chǎn)記錄詳細(xì)的規(guī)?；B(yǎng)牛場(chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)30頭犢牛于初免前、免疫口蹄疫三價(jià)滅活苗后1個(gè)月共2次分別采集一一對(duì)應(yīng)的血清及O-P液樣品，進(jìn)行口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)和分子生物學(xué)RP-PCR檢測(cè)。在進(jìn)行3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)時(shí)，采用4種實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行檢測(cè)：（方案1）是將90份血清樣品，按總體積比1：2比例進(jìn)行稀釋，用北京品牌試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；（方案2）按照1：5比例稀釋，用北京品牌試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；（方案3）按照1：2比例稀釋，用甘肅品牌試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；（方案4）按照1：5比例稀釋，用甘肅品牌試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)結(jié)果

免疫前采集的血清樣品進(jìn)行口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)后，在 1：2比例稀釋下，北京品牌的診斷試劑共檢出陽(yáng)性樣品5份，疑似樣品23份，陰性樣品2份；其余方案檢測(cè)結(jié)果均為陰性。免疫后再進(jìn)行采樣時(shí)，有5頭犢牛不知去向無(wú)法采集樣品，所以沒(méi)有檢測(cè)結(jié)果。其余樣品，在1：2比例稀釋下，北京品牌的診斷試劑共檢出陽(yáng)性樣品4份，疑似樣品21份，陰性樣品0份；在1：2比例稀釋下，甘肅品牌的診斷試劑檢出陽(yáng)性樣品1份，疑似0份，陰性24份；其余方案檢測(cè)結(jié)果均為陰性。（見(jiàn)表1）

表1 口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)結(jié)果

2.2 口蹄疫病毒RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，全部O-P液樣品均為陰性，未發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒。

3 討論與分析

3.1 血清樣品的稀釋程度對(duì)結(jié)果影響顯著

通過(guò)對(duì)比4種方案的檢測(cè)結(jié)果可以看出，原本1：2稀釋比例下的陽(yáng)性、疑似樣品，略微增加稀釋倍數(shù)后，結(jié)果全部呈陰性。

3.2 口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體水平經(jīng)疫苗免疫后呈上升趨勢(shì)

通過(guò)對(duì)比北京品牌診斷試劑1：2稀釋比例下，免疫前后兩次的檢測(cè)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，免疫后口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)結(jié)果下降的樣品有2份（陽(yáng)性轉(zhuǎn)為疑似），口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)結(jié)果上升的樣品5份（陰性轉(zhuǎn)疑似2份，疑似轉(zhuǎn)陽(yáng)性3份）。其中，001001號(hào)樣品在甘肅品牌診斷試劑檢測(cè)結(jié)果中，也由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。綜合對(duì)比可見(jiàn)，口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白抗體水平經(jīng)疫苗免疫后呈明顯上升趨勢(shì)。

3.3 不同診斷試劑敏感程度不同

本次實(shí)驗(yàn)中，北京品牌的診斷試劑敏感度較高，按說(shuō)明書中要求的樣品稀釋比例為1：2，甘肅品牌的診斷試劑說(shuō)明書中要求的樣品稀釋比例為1：5，全部樣品均按照各自診斷試劑說(shuō)明書中要求的稀釋比例進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示北京品牌檢出大量非結(jié)構(gòu)蛋白陽(yáng)性、疑似樣品與而甘肅品牌檢測(cè)結(jié)果全部呈陰性。按照有關(guān)規(guī)定，本次實(shí)驗(yàn)中，北京品牌診斷試劑檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品和連續(xù)2次檢測(cè)呈疑似的樣品，均應(yīng)判定為口蹄疫感染抗體陽(yáng)性樣品。則全部30頭犢牛中，至少23頭應(yīng)懷疑曾感染過(guò)口蹄疫病毒。但全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床健康，沒(méi)有1頭發(fā)病，再用同種檢測(cè)方法少量增加樣品稀釋倍數(shù)后，檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性，且RT-PCR實(shí)驗(yàn)中未檢出口蹄疫病毒陽(yáng)性樣品，說(shuō)明其他一些因素可能影響了北京品牌檢測(cè)試劑的檢測(cè)結(jié)果。趙麗霞、關(guān)平原、陳君彥等人的研究表明，國(guó)內(nèi)某些疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中，因生產(chǎn)工藝限制，疫苗純化程度不高，在口蹄疫疫苗中會(huì)存在含有痕跡量的3A、3B、2B、2C、3ABC等非結(jié)構(gòu)蛋白。在重復(fù)多次免疫，特別是加大免疫劑量之后，痕跡量的非結(jié)構(gòu)蛋白也可能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并被一些口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)試劑檢測(cè)出來(lái)，而出現(xiàn)“假陽(yáng)性”結(jié)果。

4 問(wèn)題與建議

4.1 感染口蹄疫病毒后，機(jī)體產(chǎn)生的3ABC抗體效價(jià)應(yīng)該是較高的，應(yīng)進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)，確定最低感染量時(shí)機(jī)體內(nèi)3ABC抗體效價(jià)，從而通過(guò)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的樣品稀釋比例，屏蔽疫苗中痕跡量非結(jié)構(gòu)蛋白的影響，真實(shí)反映口蹄疫病毒感染抗體檢測(cè)情況。

4.2 本實(shí)驗(yàn)中，未免疫犢牛在檢測(cè)中出現(xiàn)的“假陽(yáng)性”來(lái)源未查清，可能來(lái)自母畜的母源抗體，也可能來(lái)自于自然環(huán)境中的口蹄疫病毒的微量感染，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行確認(rèn)。

4.3 在實(shí)際工作中，如果遇到口蹄疫病毒3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白檢測(cè)結(jié)果異常偏高，應(yīng)盡量多對(duì)比其他檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果，并結(jié)合大量的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)和病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)，為口蹄疫防控工作提供科學(xué)可靠的依據(jù)，避免造成不必要的人力物力資源浪費(fèi)。

[1]謝慶閣.口蹄疫[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.9-12.

[2]王宏偉，等.口蹄疫病毒3ABC、3AB、3BC基因克隆、表達(dá)及其抗體消長(zhǎng)規(guī)律的研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（7）：1065-1070.

[3]趙麗霞，等.通過(guò)檢測(cè)非結(jié)構(gòu)蛋白抗體評(píng)價(jià)口蹄疫疫苗純度的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，49（4）：17-20.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.016